一種制漿造紙漂白預處理用半纖維素酶的制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制漿造紙漂白預處理用半纖維素酶的制備和應用。所述方法包括以下步驟：采用試管斜面活化，通過液態(tài)培養(yǎng)的方式得到液體種子；將碳源、氮源、葡萄糖和mandles營養(yǎng)液混合均勻，在121℃條件下滅菌1h，冷卻后轉入發(fā)酵罐中；之后將液體種子放入發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，即可得到半纖維素酶液。本發(fā)明方法采用玉米芯、麩皮、殼聚糖、粗半纖維素等生物質基材料作為誘導底物，節(jié)約了資源同時對環(huán)境十分友好。本發(fā)明得到的半纖維素酶液可以充分適應制漿造紙工業(yè)運用要求，同時使用后可以大幅提高紙漿白度。
【專利說明】一種制漿造紙漂白預處理用半纖維素酶的制備和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于屬于生物漂白領域，具體涉及一種制漿造紙漂白預處理用半纖維素酶 的制備和應用。

【背景技術】
[0002] 在制漿造紙工業(yè)中，紙漿的漂白是很重要的工段。傳統(tǒng)上，制漿造紙工業(yè)一般采用 含氯的漂白劑進行漂白。雖然其漂白效果好，但使用該法漂白的同時會使造紙廢水中產(chǎn)生 大量的、有毒的、畸形的有機氯化物，從而對環(huán)境會造成嚴重的危害。由于環(huán)境的要求，造紙 企業(yè)必須解決該問題，發(fā)展新型的無污染漂白技術。因此傳統(tǒng)的氯漂白發(fā)很大程度上被無 元素氯漂白（ECF)及全無氯漂白（TCF)所代替。過氧化氫漂白是造紙工業(yè)中常見的清潔漂 白技術。過氧化氫漂白不脫除漿中的殘余木素，而是通過在一定程度上破壞木素的共軛羰 基和鄰醌等發(fā)色基團，使其變?yōu)椴话l(fā)色基團來達到漂白效果。過氧化氫漂白效果好，對環(huán)境 無污染，在紙漿懸浮體中不產(chǎn)生氯的衍生物，符合環(huán)保要求。如果在漂白前，用半纖維素酶 對紙漿進行預處理，就會使過氧化氫等化學藥品更好的滲透到紙漿里面，從而提高漂白效 率，進一步降低污染。近年來國內外對紙漿生物技術的研究方興未艾，其中微生物酶作為漂 白活化劑促漂白成為了造紙工業(yè)中最具有發(fā)展前景的課題之一。采用生物質預處理技術， 不僅可以提高紙漿的物理性能并且能降低漂白廢水的污染負荷。
[0003] 半纖維素占植物碳水化合物總量的三分之一，在自然界中是繼纖維素之后含量第 二豐富的可再生物質資源。半纖維素酶是一種復合酶系，包含木聚糖酶、聚乳糖酶等。對半 纖維素酶的研究早在60年代就已經(jīng)開始，已經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同 類型、不同功能的半纖維酶。近年來由于基因科技的發(fā)展，半纖維素酶在造紙行業(yè)中的應用 已經(jīng)引起了科學家們的廣泛關注。


【發(fā)明內容】

[0004] 為解決現(xiàn)有技術的缺點和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種制漿造紙漂 白預處理用半纖維素酶的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法得到的半纖維素酶的應用。
[0006] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種制漿造紙漂白預處理用半 纖維素酶的制備方法，包括以下步驟：
[0007] (1)將ATCC56765里氏木霉菌種置于馬鈴薯葡萄糖葡萄糖水中，在25?35°C， 180rpm條件下培養(yǎng)48小時，產(chǎn)生孢子；然后將制得的孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA) 培養(yǎng)基中進行固體培養(yǎng)，在25?35°C條件下培養(yǎng)1?4天，產(chǎn)生發(fā)育良好的單菌落；
[0008] (2)將步驟（1)制得的發(fā)育良好的單菌落置于馬鈴薯葡萄糖水中進行液體培養(yǎng)， 在30°C、150?220rpm條件下培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)出液體種子；
[0009] (3)將碳源、氮源、葡萄糖和mandles營養(yǎng)液混合均勻后于121°C條件下滅菌1小 時得到底物，底物冷卻后轉入發(fā)酵罐，將步驟（2)制得的液體種子接種到裝好底物的發(fā)酵 罐中發(fā)酵培養(yǎng)1?4天，得到菌液；
[0010] (4)將步驟（3)得到的菌液離心分離后收集清液，得到酶的粗提液；將粗提液透析 后進行層析純化，得到半纖維素酶液。
[0011] 優(yōu)選的，步驟（1)所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的組成為：20%馬鈴薯汁、葡萄 糖、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、硫胺素和瓊脂，其比值為1L :20g :3g :1. 5g :8mg :20g ;所述 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基pH值為4?6。
[0012] 更優(yōu)選的，所述20%馬鈴薯汁配制方法為：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加1L 水，煮沸20min，濾去馬鈴薯塊，然后加水將濾液補足1L，得到所述20%馬鈴薯汁。
[0013] 優(yōu)選的，步驟（3)所述液體種子的接種量為1?5% (lmL?5mL/100mL)。
[0014] 優(yōu)選的，步驟（3)所述碳源為玉米芯，麩皮，殼聚糖，粗半纖維素，或是玉米芯、麩 皮、殼聚糖和粗半纖維素酶混合物中的一種；所述氮源為牛肉膏。
[0015] 優(yōu)選的，步驟（3)中發(fā)酵培養(yǎng)的具體條件為：罐壓0. 01?0. 08MPa，初始風量為 800m3/h，培養(yǎng)4小時后風量開至1500m3/h，初始攪拌轉速為120r/min ;培養(yǎng)4小時后攪拌 轉速調為180r/min，在培養(yǎng)過程中補加緩沖溶液將pH值維持在4?6,菌體培養(yǎng)溫度為 25°C?35°C，當pH穩(wěn)定不變時加入甲醇，甲醇添加量為1% (甲醇質量與發(fā)酵液體積的百 分比），在此過程中保持溫度為25°C?35°C。
[0016] 更優(yōu)選的，在培養(yǎng)過程中補加緩沖溶液將pH值維持在5. 5。
[0017] 優(yōu)選的，步驟（3)中所述碳源、氮源、葡萄糖和mandles營養(yǎng)液的添加量分別為 10?20g/L、10?20g/L、0. 1?0. 5%和0. 01?0. 10%，其中的百分數(shù)是葡萄糖或mandles 營養(yǎng)液的質量與發(fā)酵液體積的百分比。
[0018] 更優(yōu)選的，所述緩沖溶液為磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉；所述發(fā)酵罐中通入的空氣、 補加的緩沖溶液及甲醇均經(jīng)過滅菌處理。
[0019] 優(yōu)選的，步驟（4)中采用CM-Sephadex作為交換介質，pH值為6. 0的磷酸緩沖液 對粗提液進行陽離子交換層析。
[0020] 上述方法制得的半纖維素酶可以用于制漿造紙漂白領域。
[0021] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：
[0022] (1)本發(fā)明方法采用利用改性的里氏木霉作為發(fā)酵菌種，該菌種產(chǎn)生的半纖維素 酶液中纖維素酶活性低，可以預防紙漿漂白過程中纖維的大量降解。
[0023] (2)本發(fā)明方法采用玉米芯、麩皮、殼聚糖、粗半纖維素等生物質基材料作為誘導 底物，節(jié)約了資源同時對環(huán)境十分友好。
[0024] (3)本發(fā)明方法生產(chǎn)的半纖維素酶液可以充分適應制漿造紙工業(yè)運用要求，同時 使用后可以大幅提商紙楽白度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明制漿造紙漂白預處理用半纖維素酶的制備方法的制備流程圖。
[0026] 圖2為本發(fā)明中不同碳源對里氏木霉菌種生產(chǎn)半纖維素酶的影響結果示意圖。其 中底物1為玉米芯、2為麩皮、3為殼聚糖、4為過篩后的玉米芯、麩皮、殼聚糖和粗半纖維素 酶混合物。
[0027] 圖3為本發(fā)明中碳源不同添加量對里氏木霉菌種生產(chǎn)半纖維素酶的影響結果示 意圖。

【具體實施方式】
[0028] 下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0029] 本發(fā)明使用的里氏木霉菌種購自美國農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心，編號ATCC56765，下述 實施方式中所用材料均為市售可得。
[0030] 實施例1
[0031] 一種制漿造紙漂白預處理用半纖維素酶的制備方法，如圖1所示，包括以下步驟：
[0032] (1)斜面菌種培養(yǎng)：將ATCC56765里氏木霉菌種置于馬鈴薯葡萄糖葡萄糖水中，在 30°C，180rpm條件下培養(yǎng)48小時，產(chǎn)生孢子；然后將制得的孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)培養(yǎng)基中進行固體培養(yǎng)，在30°C放置48h，產(chǎn)生發(fā)育良好的單菌落，之后放入冰箱冷 凍保存；所用的PDA斜面培養(yǎng)基包括：20%馬鈴薯汁1L，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀3g，七水和 硫酸鎂1. 5g，硫胺素 8mg和瓊脂20g，培養(yǎng)基pH為6. 0 ;
[0033] 所述20 %馬鈴薯汁配制方法為：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加1L水，煮沸 20min，濾去馬鈴薯塊，然后加水將濾液補足1L，得到所述20 %馬鈴薯汁；
[0034] (2)搖瓶放大培養(yǎng)：將步驟（1)制得的發(fā)育良好的單菌落置于含500mL馬鈴薯葡 萄糖水的三角瓶中培養(yǎng)，在30°C，180rpm培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)出液體種子；
[0035] (3)接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)：將碳源（玉米芯）、氮源（牛肉膏）、葡萄糖和mandles營 養(yǎng)液混合均勻后于121°C條件下滅菌1小時得到底物，底物冷卻后轉入發(fā)酵罐，同時將步驟 (2)制得的液體種子接種（接種量4% )到裝好底物的發(fā)酵罐中，將罐內原料定容至10m3， 直接通入消毒空氣，保證空氣在12m3,調節(jié)pH至5. 5,發(fā)酵培養(yǎng)4天，得到菌液；
[0036] 發(fā)酵培養(yǎng)具體條件為：罐壓0. 05MPa，初始風量為800m3/h，培養(yǎng)4小時后風量開至 1500m3/h以上保證溶氧量大于20%，發(fā)酵初始階段攪拌轉速為120r/min ;培養(yǎng)4小時后攪 拌轉速調為180r/min，在培養(yǎng)過程中隨時補加緩沖溶液將pH值維持在5. 5,菌體培養(yǎng)溫度 為 30°C ;
[0037] 接種后由發(fā)酵開始，每小時測定一次pH值，使pH值維持在5. 5左右，培養(yǎng)48小時 后由中控開始測定酶活，至pH無明顯下降后加入甲醇誘導，以提高酶的產(chǎn)量；
[0038] (4)將步驟（3)得到的菌液離心分離后收集清液，得到酶的粗提液；將粗提液透析 后進行層析純化，得到所述半纖維素酶液。
[0039] 其中碳源和氮源添加量均為10?20g/L，葡萄糖和mandles營養(yǎng)液的加入量分別 為0· 1?0· 5% (質量與發(fā)酵液體積的百分比）和0· 01?0· 1 % (質量與發(fā)酵液體積的百 分比）。最終半纖維素酶液中酶活為1423. 59IU/g。
[0040] 實施例2 :具體步驟如實施例1所述，所不同的是步驟（1)的固體培養(yǎng)時培養(yǎng)溫度 為25°C ;步驟（2)中制備液體種子時轉速為150rpm，培養(yǎng)時間為1天。最終本實施例所得 的半纖維素酶液中酶活為1223. 59IU/g。
[0041] 實施例3 :具體步驟如實施例1所述，所不同的是步驟（1)的固體培養(yǎng)時培養(yǎng)溫度 為35°C ;步驟（2)中制備液體種子時轉速為220rpm，培養(yǎng)時間為4天。最終本實施例所得 的半纖維素酶液中酶活為1323. 59IU/g。
[0042] 實施例4 :具體步驟如實施例1所述，所不同的是步驟（3)發(fā)酵過程中加入的碳源 為麩皮。最終本實施例所得的半纖維素酶液中酶活為368IU/g。
[0043] 實施例5 :具體步驟如實施例1所述，所不同的是步驟（3)發(fā)酵過程中加入的碳源 為殼聚糖。最終本實施例所得的半纖維素酶液中酶活為57. 35IU/g。
[0044] 實施例6
[0045] 一種制漿造紙漂白預處理用半纖維素酶的制備方法，包括以下步驟：
[0046] (1)斜面菌種培養(yǎng)：將ATCC56765里氏木霉菌種置于馬鈴薯葡萄糖葡萄糖水中，在 30°C，180rpm條件下培養(yǎng)48小時，產(chǎn)生孢子；然后將制得的孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)培養(yǎng)基中進行固體培養(yǎng)，在30°C放置48h，產(chǎn)生發(fā)育良好的單菌落，之后放入冰箱冷 凍保存；所用的PDA斜面培養(yǎng)基包括：20%馬鈴薯汁1L，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀3g，七水和 硫酸鎂1. 5g，硫胺素8mg和瓊脂20g，培養(yǎng)基pH為6. 0 ;
[0047] 所述20 %馬鈴薯汁配制方法為：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加1L水，煮沸 20min，濾去馬鈴薯塊，然后加水將濾液補足1L，得到所述20 %馬鈴薯汁；
[0048] (2)搖瓶放大培養(yǎng)：將步驟（1)制得的發(fā)育良好的單菌落置于含500mL馬鈴薯葡 萄糖水的三角瓶中培養(yǎng)，在30°C，180rpm培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)出液體種子；
[0049] (3)接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)：將碳源（玉米芯、麩皮、殼聚糖和粗半纖維素酶混合物過 100目篩所得）、氮源（牛肉膏）、葡萄糖和mandles營養(yǎng)液混合均勻后于121°C條件下滅 菌1小時得到底物，底物冷卻后轉入發(fā)酵罐，同時將步驟（2)制得的液體種子接種（接種 量4% )到裝好底物的發(fā)酵罐中，將罐內原料定容至10m3,直接通入消毒空氣，保證空氣在 12m3,調節(jié)pH至4?6,發(fā)酵培養(yǎng)4天，得到菌液；
[0050] 發(fā)酵培養(yǎng)具體條件為：罐壓0. 〇5MPa，初始風量為800m3/h，培養(yǎng)4小時后風量開至 1500m3/h以上保證溶氧量大于20%，發(fā)酵初始階段攪拌轉速為120r/min ;培養(yǎng)4小時后攪 拌轉速調為180r/min，在培養(yǎng)過程中隨時補加緩沖溶液將pH值維持在4?6,菌體培養(yǎng)溫 度為30°C ;
[0051] 接種后由發(fā)酵開始，每小時測定一次pH值，使pH值維持在4?6左右，培養(yǎng)48小 時后由中控開始測定酶活，至pH無明顯下降后加入甲醇誘導，以提高酶的產(chǎn)量；
[0052] (4)將步驟（3)得到的菌液離心分離后收集清液，得到酶的粗提液；將粗提液透析 后進行層析純化，得到所述半纖維素酶液。
[0053] 其中碳源和氮源添加量均為10g/L，葡萄糖和mandles營養(yǎng)液的加入量分別為 0· 1?0· 5% (質量與發(fā)酵液體積的百分比）和0· 01?0· 1 % (質量與發(fā)酵液體積的百分 比）。最終所得半纖維素酶液中酶活為2137. 46IU/g。
[0054] 實施例7 :具體步驟如實施例6所述，所不同的是步驟（1)的固體培養(yǎng)時培養(yǎng)溫度 為25°C ;步驟（2)中制備液體種子時轉速為150rpm，培養(yǎng)時間為1天。最終半纖維素酶液 中酶活為1923. 59IU/g。
[0055] 實施例8 :具體步驟如實施例6所述，所不同的是步驟（1)的固體培養(yǎng)時培養(yǎng)溫度 為35°C ;步驟（2)中制備液體種子時轉速為220rpm，培養(yǎng)時間為4天。最終所得半纖維素 酶液中酶活為1723. 59IU/g。
[0056] 實施例9 :具體步驟如實施例6所述，所不同的是步驟（3)發(fā)酵過程中加入的碳源 量為5g/L。最終本實施例所得的半纖維素酶液中酶活為958. 14IU/g。
[0057] 實施例10 :具體步驟如實施例6所述，所不同的是步驟（3)發(fā)酵過程中加入的碳 源量為20g/L。最終本實施例所得的半纖維素酶液中酶活為1548. 25IU/g。
[0058] 圖2為本發(fā)明中不同碳源對里氏木霉菌種生產(chǎn)半纖維素酶的影響結果示意圖。其 中底物1為玉米芯、2為麩皮、3為殼聚糖、4為過篩后的玉米芯、麩皮、殼聚糖和粗半纖維素 酶混合物。從圖中可看到底物為第4種時，酶活最高，但同時操作復雜，損失較高。綜合考 慮成本因素，最佳底物為玉米芯。
[0059] 圖3為本發(fā)明中碳源不同添加量對里氏木霉菌種生產(chǎn)半纖維素酶的影響結果示 意圖。從圖中可看到碳源添加量為10?14g/L時，發(fā)酵產(chǎn)酶的活性最高。
[0060] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1. 一種制漿造紙漂白預處理用半纖維素酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將ATCC56765里氏木霉菌種置于馬鈴薯葡萄糖葡萄糖水中，在25?35°C，180rpm 條件下培養(yǎng)48小時，產(chǎn)生孢子；然后將制得的孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中進行 固體培養(yǎng)，在25?35°C條件下培養(yǎng)1?4天，產(chǎn)生發(fā)育良好的單菌落； (2) 將步驟（1)制得的發(fā)育良好的單菌落置于馬鈴薯葡萄糖水中進行液體培養(yǎng)，在 30°C、150?180rpm條件下培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)出液體種子； (3) 將碳源、氮源、葡萄糖和mandles營養(yǎng)液混合均勻后于121°C條件下滅菌1小時得 到底物，底物冷卻后轉入發(fā)酵罐，將步驟（2)制得的液體種子接種到裝好底物的發(fā)酵罐中 發(fā)酵培養(yǎng)1?4天，得到菌液； (4) 將步驟（3)得到的菌液離心分離后收集清液，得到酶的粗提液；將粗提液透析后進 行層析純化，得到半纖維素酶液。
2. 根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng) 基的組成為：20%馬鈴薯汁、葡萄糖、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、硫胺素和瓊脂，其比值為 1L :20g :3g :1. 5g :8mg :20g ;所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基pH值為4?6。
3. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述20%馬鈴薯汁配制方法為：取去 皮馬鈴薯200g，切成小塊，加1L水，煮沸20min，濾去馬鈴薯塊，然后加水將濾液補足1L，得 到所述20 %馬鈴薯汁。
4. 根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟⑶所述液體種子的接種量為 1 ?5% 〇
5. 根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)所述碳源為玉米芯，麩皮，殼 聚糖，粗半纖維素，或是玉米芯、麩皮、殼聚糖和粗半纖維素酶混合物中的一種；所述氮源為 牛肉膏。
6. 根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟⑶中所述碳源、氮源、葡萄糖和 mandles營養(yǎng)液的添加量分別為10?20g/L、10?20g/L、0. 1?0· 5%和0· 01?0· 10%， 其中的百分數(shù)是葡萄糖或mandles營養(yǎng)液的質量與發(fā)酵液體積的百分比。
7. 根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中發(fā)酵培養(yǎng)的具體條件為： 罐壓0. 01?0. 08MPa，初始風量為800m3/h，培養(yǎng)4小時后風量開至1500m3/h，初始攪拌轉 速為120r/min ;培養(yǎng)4小時后攪拌轉速調為180r/min，在培養(yǎng)過程中補加緩沖溶液將pH值 維持在5. 5,菌體培養(yǎng)溫度為25°C?35°C，當pH穩(wěn)定不變時加入甲醇。
8. 根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖溶液為磷酸二氫鈉或磷酸 氫二鈉；所述發(fā)酵罐中通入的空氣、補加的緩沖溶液及甲醇均經(jīng)過滅菌處理。
9. 根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（4)中采用CM-Sephadex作為交 換介質，pH值為6. 0的磷酸緩沖液對粗提液進行陽離子交換層析。
10. 權利要求1所述制備方法得到的半纖維素酶在制漿造紙漂白領域中的應用。
【文檔編號】C12N9/42GK104087568SQ201410259576
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權日:2014年6月11日
【發(fā)明者】楊仁黨, 阮蒙, 楊飛 申請人:華南理工大學