單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針及其制備方法，首先利用檸檬酸鈉還原氯金酸得到金種子，將得到的金種子溶液稀釋后依次加入鹽酸羥胺和氯金酸溶液生長得到球形金納米顆粒；然后，將球形金納米顆粒均勻固定于清洗干凈的ITO玻璃基底表面，制得到金納米顆粒SPR芯片；最后將發(fā)夾形特定序列的單鏈DNA探針分子通過金硫共價(jià)鍵作用修飾固定在制得的SPR芯片上的金納米顆粒表面，得到單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針。所述球形金納米顆粒的粒徑直徑在40~90nm之間，散射光譜峰位于540~600nm，該探針的檢測限可低于3nM，結(jié)合SPR技術(shù)在動態(tài)檢測肺癌核酸標(biāo)志物方面有良好的效果。
【專利說明】單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及表面等離子體共振探針，具體涉及一種單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是世界范圍內(nèi)最常見、致死人數(shù)最多的肺原發(fā)性惡性腫瘤，并且近三十年來許多國家報(bào)道其發(fā)病率明顯增高。因此早期診斷肺癌具有非常重要的意義。常用的腫瘤診斷手段包括痰細(xì)胞和胸部X線造影檢查、CT、核磁共振、PCR、B超、紅外掃描等。然而早期患者癥狀不典型或者沒有自覺癥狀導(dǎo)致診斷率低，同時(shí)傳統(tǒng)的肺癌篩查方法過程痛苦、耗資大，使得高危人群的依從性較差。因此眾多學(xué)者致力于肺癌標(biāo)志物進(jìn)行早期診斷。
[0003]在肺癌發(fā)生的早期，很多肺癌標(biāo)志物可以反映腫瘤的存在，包括胚胎抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白19降解片段(cyfra21-l)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、糖類抗原(CA125等)、組織多肽特異性抗原(TPS)、乳酸脫氫酶(LDH)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、以及核酸標(biāo)志物MicroRNA (如 miR-29, miR-202, miR-203, miR-205 等)。 [0004]近年來，基于納米材料的生物檢測技術(shù)日益成熟，基于金納米粒子的表面等離子共振生物傳感器具有化學(xué)穩(wěn)定性好、免標(biāo)記、能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)快速檢測等優(yōu)點(diǎn)，可以用于檢測腫瘤早期血液樣本中的低豐度核酸標(biāo)志物，為實(shí)現(xiàn)肺癌早期檢測帶來了新希望。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問題:本發(fā)明提供了一種基于單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針及其制備方法，以及用該探針動態(tài)檢測肺癌核酸標(biāo)志物的方法，并驗(yàn)證了該探針的普適性。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針，為發(fā)夾形單鏈DNA修飾的納米金表面等離子探針，其結(jié)構(gòu)是將球形金納米顆粒固定在預(yù)處理過的玻璃表面，發(fā)夾形的識別單鏈DNA通過功能基團(tuán)連接到金納米顆粒表面。
[0007]所述識別單鏈DNA 的序列為:5 ’ -TGA CT -X- AGT CAT TTT TTT TTT- (CH2) 6_SH_3，，其中 X 部分序列為 T CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA，C AGA CTC CGG TGG AAT GAA GGA 或者 C TAGTGG TCC TAA ACA TTT CAC。
[0008]所述單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針以金納米球?yàn)榛A(chǔ)，球形金納米顆粒的粒徑直徑在40~90 nm之間，散射光譜峰位于540~600 nm。
[0009]本發(fā)明的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針的制備方法包括以下步驟:
O金種子溶液的制備:將2~8 mL40 mM檸檬酸鈉溶液一次性加入到沸騰的40~60mL0.01%HAuC14溶液中，加熱煮沸5~30 min ；
2)球形金納米顆粒的生長:在燒杯中加入10~30 mL水、0.5^5 mL步驟I)制備的金種子溶液和0.1-5 mL0.2 M鹽酸羥胺溶液，以0.06 mL/min的速度加入I~10 mL0.1%HAuC14溶液，得到金納米溶液；3)金納米顆粒玻璃基底的制備:將ITO玻璃依次浸入洗潔精溶液、丙酮、無水乙醇、超純水中超聲清洗0.5飛h，取出后用N2吹干備用；取步驟2)中的金納米溶液0.5 mL，按比例I: Tl:50稀釋后，放入ITO玻璃片，浸泡0.5^20 min后用超純水沖洗并用N2吹干；
4)發(fā)夾形DNA分子的修飾:將步驟3)中制備的金納米顆粒玻璃基底浸泡在Iμ M的發(fā)夾形單鏈DNA溶液中，經(jīng)搖床2(T30°C搖勻5~20 h，取出玻璃基底用超純水沖洗并用N2吹干，得到單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針。
[0010]所述的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針在動態(tài)檢測肺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明所述識別單鏈DNA的序列為:5’ -TGA CT -X- AGT CAT TTT TTTTTT-(CH2) 6-SH-3’，其中X部分序列可以根據(jù)檢測對象miRNA來設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)為任意想檢測對象miRNA的互補(bǔ)鏈，即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)對象的檢測。
[0012]例如:當(dāng)識別單鏈DNA 的序列為:5’ -TGA CITCAA CAT CAG TCT GATAAG CTAbm CATTTT TTT ITT-(CH2) 6-SH-3’ 時(shí)，如 SEQ.1 所示，其 X 部分為 T CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA,是肺癌標(biāo)志物miRNA-21 (序列如SEQ.4所示)的互補(bǔ)鏈,該探針可以動態(tài)檢測肺癌標(biāo)志物miRNA-21，具體步驟為:將修飾了單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針的ITO玻璃置于載物臺上，滴上濃度為I PM~100 μΜ的目標(biāo)RNA溶液(miRNA-21，序列如SEQ.4所示)50~250μ L，用暗場顯微鏡找到單顆粒探針，利用光譜儀采集不同時(shí)間單顆粒的散射光譜，觀察目標(biāo)RNA與探針DNA發(fā)生雜交的過程。
[0013]當(dāng)識別單鏈DNA 的序列為:5 ’ -TGA CTCAGA CTCCGG TGG AAT GAA GGA AGT CAT TTTTTT TTT-(CH2) 6-SH-3，時(shí)，如 SEQ.2 所示，其 X 部分為 C AGA CTC CGG TGG AAT GAA GGA,是肺癌標(biāo)志物miRNA-205 (序列如SEQ.5所示)的互補(bǔ)鏈,該探針可以動態(tài)檢測肺癌標(biāo)志物miRNA-205，具體步驟為:將修飾了單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針的ITO玻璃置于載物臺上，滴上濃度為I PM~100 μ M的miRNA-205溶液50~250 μ L，用SPR暗場光譜顯微鏡拍攝不同時(shí)間單顆粒的散射光譜，觀察目標(biāo)RNA與探針DNA發(fā)生雜交的過程。
[0014]當(dāng)識別識別單鏈DNA 的序列為:5 ’ -TGA CIT TAG TGG TCC TAA ACA TTT CAC AGT CATTTT TTT TTT-(CH2) 6-SH-3’ 時(shí)，如 SEQ.3 所示，其 X 部分為 C TAG TGG TCC TAA ACA TTT CAC,是肺癌標(biāo)志物miRNA-203 (序列如SEQ.6所示)的互補(bǔ)鏈,該探針可以動態(tài)檢測肺癌標(biāo)志物miRNA-203，具體步驟為:將修飾了單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針的ITO玻璃置于載物臺上，滴上濃度為I PM~100 μ M的miRNA-203溶液50~250 μ L，用SPR暗場光譜顯微鏡拍攝不同時(shí)間單顆粒的散射光譜，觀察目標(biāo)RNA與探針DNA發(fā)生雜交的過程。
[0015]有益效果:本發(fā)明的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針具有結(jié)構(gòu)簡單、制作方便等優(yōu)點(diǎn)，并且具有良好的監(jiān)測性能，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計(jì)算出該探針的檢測限可低于3 ηΜ，結(jié)合SPR技術(shù)在動態(tài)檢測肺癌核酸標(biāo)志物方面有良好的效果，實(shí)現(xiàn)了對肺癌標(biāo)志物的實(shí)時(shí)監(jiān)測，同時(shí)具有良好的普適性，對其他miRNA同樣適用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是探針結(jié)構(gòu)及識別原理圖。
[0017]圖2是金種子溶液和金納米球溶液的紫外光譜圖。
[0018]圖3是金納米球的TEM圖。
[0019]圖4是納米金傳感器暗場彩照(a)與原位SEM圖像(b)以及單個(gè)金納米顆粒SEM放大圖像(C)。
[0020]圖5是采用實(shí)施例1制備的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針進(jìn)行瑞利散射光譜隨時(shí)間的變化圖(a)，0-120min局部放大圖(b)。
[0021]圖6是采用實(shí)施例1制備的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針監(jiān)測不同濃度miRNA-21結(jié)合動力學(xué)過程。
[0022]圖7是采用本發(fā)明制備的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針對miRNA-21檢測的濃度線性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023]為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0024]probe DNA (21): 5，-TGA CTT CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA AGT CAT TTT TTTTTT-(CH2) 6-SH-3’ SEQ.l。
[0025]probe DNA (205): 5，-TGA CTC AGA CTC CGG TGG AAT GAA GGAAGT CAT TTT TTTTTT-(CH2) 6-SH-3’ SEQ.2。
[0026]probe DNA (203): 5，-TGA CTC TAG TGG TCC TAA ACA TTT CAC AGT CAT TTT TTTTTT-(CH2) 6-SH-3’ SEQ.3。
[0027]miRNA-21:5’ -UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A_3，SEQ.4。
[0028]miRNA-205: 5，-UCC UUC AUU CCA CCG GAG UCU G_3，SEQ.5。
[0029]miRNA-203: 5，-GUG AAA UGU UUA GGA CCA CUA G_3，SEQ.6。
[0030]以上DNA和RNA序列均從上海皓嘉科技發(fā)展有限公司(南京分公司)購買。
[0031]探針DNA可形成發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，序列中下劃線部分可與對應(yīng)的目標(biāo)RNA互補(bǔ)配對。
[0032]實(shí)施例1
單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針的制備，具體步驟如下:
1)20nm金種子溶液的制備:將5 mL40 mM檸檬酸鈉溶液快速加入到沸騰的50mL0.01%HAuC14溶液中(百分比為質(zhì)量百分比，下同)，加熱煮沸20 min ；
2)球形金納米顆粒的生長:在燒杯中加入20mL水、I mL金種子溶液和0.5 mL0.2 M鹽酸羥胺溶液，以0.06 mL/min的速度加入3.5 mL0.1%HAuC14溶液；
3)納米金玻璃基底的制備:將ITO玻璃依次浸入洗潔精溶液、丙酮、無水乙醇、超純水中超聲清洗I h，取出后用N2吹干備用；取步驟2)中的金納米溶液0.5 mL，按比例1:20稀釋后,放入ITO玻璃片,浸泡I min后用超純水沖洗并用N2吹干；
4)發(fā)夾形DNA的分子的修飾:將步驟3)中制備的金納米顆粒玻璃基底浸泡在Iμ M的識別單鏈DNA (probe DNA (21)，SEQ.1)溶液中，經(jīng)搖床25°C搖勻13 h，取出玻璃基底用超純水沖洗并用N2吹干。
[0033]上述制備得到的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針，將球形金納米顆粒固定在預(yù)處理過的玻璃表面，發(fā)夾形識別單鏈DNA通過功能基團(tuán)連接到球形金納米顆粒表面，球形金納米顆粒通過紫外可見光譜儀(圖2)和透射電鏡(圖3)進(jìn)行表征，結(jié)果顯示金納米顆粒的平均粒徑在75 nm左右，散射光譜峰位于570 nm左右。
[0034]實(shí)施例2
利用實(shí)施例1制備的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針進(jìn)行動態(tài)檢測肺癌標(biāo)志物，具體步驟如下:
I)將上述制備的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針的ITO玻璃置于載物臺上，滴上濃度為20 μΜ的miRNA-21溶液100 μ L，用暗場顯微鏡找到單顆粒探針，利用光譜儀釆集不同時(shí)間單顆粒的散射光譜，觀察目標(biāo)RNA與探針DNA發(fā)生雜交的過程，miRNA-21與探針DNA雜交過程140分鐘內(nèi)各性能參數(shù)見表1。
[0035]表1:___
【權(quán)利要求】
1.單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針，其特征在于:該探針是將球形金納米顆粒固定在預(yù)處理過的玻璃表面，識別單鏈DNA通過功能基團(tuán)連接到球形金納米顆粒表面，所述識別單鏈DNA為發(fā)夾形結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針，其特征在于:所述識別單鏈DNA 的序列為:5’-TGA CT -X- AGT CAT TTT TTT TTT-(CH2)6-SH_3’，其中 X部分序列為T CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA，C AGA CTC CGG TGG AAT GAA GGA 或者 C TAG TGG TCC TAA ACATTT CAC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針，其特征在于:所述球形金納米顆粒的粒徑直徑在40~90 nm之間，散射光譜峰位于540~600 nm。
4.權(quán)利要求1、2或3所述的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針的制備方法，其特征在于包括以下步驟: O金種子溶液的制備:將2~8 mL 40 mM檸檬酸鈉溶液加入到沸騰的40~60 mL 0.01%wtHAuCl4溶液中，加熱煮沸5~30 min ； 2)球形金納米顆粒的生長:在燒杯中加入10~30mL水、0.5^5 mL步驟I)制備的金種子溶液和0.1~5 mL 0.2 M鹽酸羥胺溶液，以0.06 mL/min的速度加入I~10 mL 0.1% HAuCl4溶液，得到金納米溶液； 3)金納米顆粒玻璃基底的制備:將ITO玻璃依次浸入洗潔精溶液、丙酮、無水乙醇、超純水中超聲清洗 0.5飛h，取出后用N2吹干備用；取步驟2)中的金納米溶液0.2^2 mL，按比例1:1~1:50稀釋后，放入ITO玻璃片，浸泡0.5^20 min后用超純水沖洗并用N2吹干； 4)發(fā)夾形DNA分子的修飾:將步驟3)中制備的金納米顆粒玻璃基底浸泡在Iμ M的識別單鏈DNA溶液中，經(jīng)搖床2(T30°C搖勻5~20 h，取出玻璃基底用超純水沖洗并用N2吹干，得到單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針。
5.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的單個(gè)金納米顆粒表面等離子共振探針在動態(tài)檢測肺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104032006SQ201410259872
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】張磊, 汪聯(lián)輝, 胡艷玲, 黃維, 李亞欣 申請人:南京郵電大學(xué)