一株假單胞菌誘變菌株及其在生產(chǎn)(r)-3-羥基丁酸中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于發(fā)酵工程【技術領域】，涉及一株誘變菌株 Psedomonas sp.DS1001a及該菌株所產(chǎn)解聚酶在轉(zhuǎn)化生產(chǎn)(R)-3-羥基丁酸中的應用。該菌株是以從吉林省土壤中篩選出的假單胞菌DS1001為出發(fā)菌株，通過紫外誘變選育出的高產(chǎn)聚3-羥基丁酸解聚酶的誘變菌株。該菌株所產(chǎn)聚3-羥基丁酸解聚酶能夠在體外高效降解聚3-羥基丁酸，轉(zhuǎn)化生成(R)-3-羥基丁酸單體，8h反應產(chǎn)率可達2.848g/L，生產(chǎn)效率明顯高于利用體內(nèi)生物酶生產(chǎn)3-羥基丁酸的效率；而且本發(fā)明提供的菌株發(fā)酵碳源及酶轉(zhuǎn)化底物可以為聚3-羥基丁酸廢棄物或工業(yè)下腳料，有利于實現(xiàn)(R)-3-羥基丁酸的大量廉價生產(chǎn)，并能夠?qū)崿F(xiàn)對聚3-羥基丁酸材料的高值化轉(zhuǎn)化。
CGMCC No.4366
2010.11.25

CGMCC No.8638
2013.12.25
【專利說明】[0001] 一株假單胞菌誘變菌株及其在生產(chǎn)（R)-3-羥基丁酸中的 應用

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程【技術領域】，具體涉及一株高產(chǎn)聚3-羥基丁酸解聚酶的誘變 菌株sp. DSlOOla及利用該誘變菌株sp. DSlOOla所產(chǎn)解聚酶降解 聚3-羥基丁酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)（R) -3-羥基丁酸單體。
[0003]

【背景技術】
[0004] (R)-3-羥基丁酸單體是具有手性活性的酮體，其分子式為C4H 803，分子量為 104. lg/mol，溶于水和乙醇等溶劑。（R)-3-羥基丁酸具有抗菌、殺蟲和抗病毒活性；其作為 手性模塊可以合成精細化學品，如抗生素、維生素、芳香烴和信息素等；由于（R)-3_羥基丁 酸在人體內(nèi)半衰期短且人體對其具有良好的耐受性，因此可以直接用作口服藥物；在缺糖 的條件下，（R)-3_羥基丁酸可以部分保護和穩(wěn)定神經(jīng)細胞；也有一些證據(jù)表明，（R)-3-羥 基丁酸可作為增強心臟的效率，防止腦損傷，表現(xiàn)出巨大的潛在藥用價值。
[0005]目前，手性羥基脂肪酸的主要生產(chǎn)方法為化學法，包括化學方法直接合成 (R)-3-羥基丁酸和化學方法降解聚3-羥基丁酸酯生產(chǎn)（R)-3-羥基丁酸。化學方法直接合 成（R)-3_羥基丁酸需要高溫、高壓的反應條件以及昂貴的手性金屬催化劑等；而化學方法 降解聚3-羥基丁酸生產(chǎn)（R)-3-羥基丁酸，需要耗費大量的有機溶劑，較長的反應時間和高 純度的聚3-羥基丁酸酯作為起始物，并極易產(chǎn)生消旋化。近年來生物法制備（R)-3-羥基 丁酸的研究備受關注，Lee等人構建了含有異源聚3-羥基丁酸合成和降解途徑的基因工程 菌，報道了該菌株以葡萄糖作為碳源，利用體內(nèi)生物酶首先合成聚羥基脂肪酸酯并進一步 使其降解為（R)-3_羥基丁酸單體，產(chǎn)量可以達到0. 18g/L_h。之后也相繼有類似的報道出 現(xiàn)，但該方法目前還處于實驗室水平，如果進入工業(yè)化大生產(chǎn)仍然存在成本高、產(chǎn)率低等問 題。
[0006] 從上世紀60年代開始，得益于全世界對環(huán)境問題的重視，關于聚3-羥基丁酸等生 物可降解高分子材料的研究受到廣泛關注，并于近十幾年得到快速發(fā)展。目前PHB的合成 和改性工藝成熟，其產(chǎn)品已經(jīng)在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療等領域得到應用；而在降解方面人們已經(jīng) 從自然界中分離到了多種對聚3-羥基丁酸具有降解作用的菌株，并對其降解酶和降解機 制進行了深入的研究。在此基礎上可以設想如果利用這些菌株產(chǎn)生的聚3-羥基丁酸降解 酶，對聚3-羥基丁酸廢棄物或聚3-羥基丁酸工業(yè)下腳料進行降解，使其轉(zhuǎn)化為（R)-3-羥 基丁酸單體，則可以大大降低（R)-3_羥基丁酸的生產(chǎn)成本。本實驗室吳曉巖等進行了這方 面工作的探索，利用門多薩假單胞菌DSWY0601證實了該方法的可行性，發(fā)酵液與聚3-羥基 丁酸粉末完全反應48h后3-羥基丁酸產(chǎn)量可達1. 087g/L。
[0007] 本發(fā)明提供的誘變菌株sp.DSlOOla較原始菌株及門多薩假單胞菌 DSWY0601活性更高，其產(chǎn)生的降解酶僅經(jīng)過8h反應，就可以產(chǎn)生（R) -3-羥基丁酸2. 848g/L，相當于0.356g /L_h，生產(chǎn)效率明顯高于前文敘述的利用體內(nèi)生物酶或體外生物酶生產(chǎn) (R)-3-羥基丁酸的效率；而且本發(fā)明提供的菌株發(fā)酵產(chǎn)酶時以聚3-羥基丁酸廢棄物或聚 3_羥基丁酸工業(yè)下腳料為碳源，無需添加其它碳源或誘導劑，轉(zhuǎn)化底物也可以是聚3-羥基 丁酸工業(yè)下腳料，因此相比以葡萄糖為碳源轉(zhuǎn)化生產(chǎn)（R)-3-羥基丁酸的方法即節(jié)約了成 本，又能夠?qū)崿F(xiàn)對聚3-羥基丁酸消費品的二次回收利用，更加環(huán)保，實現(xiàn)了聚3-羥基丁酸 材料的高值化轉(zhuǎn)化。
[0008]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一個目的是提供一株具有較強聚3-羥基丁酸降解活性的誘變菌株假單 胞菌DSlOOla，另一個目的是提供利用該菌株所產(chǎn)的聚3-羥基丁酸解聚酶在體外降解聚 3_羥基丁酸以獲得（R)-3_羥基丁酸中的應用。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的： 1.采用紫外誘變技術選育高產(chǎn)聚3-羥基丁酸解聚酶的菌株 在無菌的平皿中倒入5mL處于對數(shù)生長期的sp. DS1001菌液，置于磁力 攪拌器上攪拌，在垂直距離為30cm的15W紫外燈(波長為254nm)下分別照射0、30、60、90、 120、150s。將不同照射時間的菌液梯度稀釋后，涂布于聚3-羥基丁酸唯一碳源培養(yǎng)基中， 37°C避光培養(yǎng)48h，計算致死率并觀察菌落周圍透明圈的大小。挑選致死率在75%左右，而 且透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株，接種到以聚3-羥基丁酸為唯一碳源的液體培 養(yǎng)基中，每隔24h取樣測定聚3-羥基丁酸解聚酶活力，選取活力最高的菌株。
[0011] 2.聚3-羥基丁酸解聚酶的制備方法 將菌株DSlOOla以5%接種量接入到產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中，27. 5°C、130rpm恒溫振蕩培 養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為：聚 3-羥基丁酸 0. 2%，NH4C1 0. 15%,Na2HP04.12H20/KH2P04 1.45/0 . 48%， MgS04 0? 07%,CaCl2.2H20 0? 0005%，培養(yǎng)基初始pH8. 3,裝液量 116. 5/500mL三角瓶。
[0012] 發(fā)酵達30h后將發(fā)酵液置于14000rpm離心機中4°C條件下離心10min，所得上清 液即為粗酶液。
[0013] 3.聚3-羥基丁酸解聚酶粗酶液降解聚3-羥基丁酸產(chǎn)（R)-3-羥基丁酸的條件 在50mL離心管中加入30mL粗酶液及200mg聚3-羥基丁酸粉末，50°C振蕩保溫8h后， 采用高效液相色譜測定（R)-3-羥基丁酸含量，同時可更換酶液繼續(xù)轉(zhuǎn)化反應。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果是：提供的誘變菌株sp. DSlOOla聚3-輕 基丁酸解聚酶活性高，經(jīng)過紫外誘變和發(fā)酵條件的優(yōu)化，活性比原始菌株提高了 7. 9倍。體 外酶解聚3-羥基丁酸產(chǎn)（R)-3-羥基丁酸的能力更強，其產(chǎn)生的降解酶經(jīng)過8h反應，可產(chǎn) 生（R)-3_羥基丁酸2.848g/L，相當于0.356g /L.h;而且本發(fā)明提供的菌株發(fā)酵產(chǎn)酶時以 聚3-羥基丁酸廢棄物或聚3-羥基丁酸工業(yè)下腳料為碳源，無需添加其它碳源或誘導劑，轉(zhuǎn) 化底物也可以是聚3-羥基丁酸工業(yè)下腳料，因此可實現(xiàn)（R)-3-羥基丁酸的大量廉價生產(chǎn)。
[0015] 保藏說明： 聚3_輕基丁酸降解菌株sp.DS1001、 一株高產(chǎn)聚3-輕基丁酸解聚酶的誘變菌株假單胞菌sp. )DSlOOla,已 于2013年12月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京 朝陽區(qū)大屯路，保藏號為CGMCC No. 8638。
[0016]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1誘變菌株與原始菌株的活性比較圖。
[0018] 圖2誘變菌株的產(chǎn)酶曲線。
[0019]圖3菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化。A:溫度；B:接種量；C:裝液量；D :pH值。
[0020] 圖4菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成優(yōu)化。A:碳源；B:氮源；C:磷源；D :Mg2+。
[0021] 圖5粗酶液的最適反應溫度測定曲線。
[0022] 圖6粗酶液的最適反應pH值測定曲線。
[0023] 圖7 (R)-3-羥基丁酸的高效液相色譜圖。
[0024] 圖8反應液中（R)-3_羥基丁酸含量及pH值隨時間變化曲線。
[0025] 具體實施例
[0026] 借助下列實施例更詳細的說明本發(fā)明，但顯然，本發(fā)明的范圍不受限于這些實施 例。
[0027] 實施例1從土壤中篩選出的聚3-輕基丁酸降解菌株sp. DS1001 采用唯一碳源法，從吉林省啤酒廠土壤中篩選出對聚3-羥基丁酸具有降解作用的菌 株-假單胞菌sp. DS1001，其特征在于菌落呈圓形，黃白色，表面光滑無皺 紋，邊緣較整齊，表面較濕潤，易挑起；菌體呈短桿狀，革蘭氏陰性，有鞭毛，無芽孢和莢膜； 菌株能夠以聚乳酸、聚3-羥基丁酸或聚己內(nèi)酯等高分子化合物為唯一碳源生長，并對這些 化合物具有高效的降解作用；已于2010年11月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心保藏，地址：北京朝陽區(qū)大屯路，保藏號為CGMCC No. 4366。
[0028] 實施例2以sp. DS1001為出發(fā)菌株通過紫外誘變篩選出 sp. DSlOOla (1) 選擇生長良好的外漢避沿as sp. DS1001斜面菌種接入液體培養(yǎng)基，當菌種生長至 對數(shù)生長期后，取5mL菌液加入到無菌平皿中； (2) 將平皿置于磁力攪拌器上攪拌，在垂直距離為30cm的15W紫外燈(波長為254nm) 下分別照射0、30、60、90、120、150s。將不同照射時間的菌液梯度稀釋后，涂布于聚3-羥基 丁酸唯一碳源培養(yǎng)基中，37°C避光培養(yǎng)48h; (3) 計算致死率，挑選致死率在75%左右的90s作為誘變時間，在此誘變時間的平板中 挑選透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株； (4) 將挑選的菌株接種到以聚3-羥基丁酸為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，每隔24h 取樣測定聚3-羥基丁酸解聚酶活力，與原始菌株比較，選取活力最高的菌株，命名為 sp. DSlOOla。該菌株菌落呈圓形，顏色為白色，表面光滑無皺紋，邊緣較整齊， 表面較濕潤，易挑起；菌體呈短桿狀，革蘭氏陰性，有鞭毛，無芽孢和莢膜；誘變菌株在菌落 形態(tài)上變化不大，但對聚3-羥基丁酸的降解能力增強，其發(fā)酵液的最高聚3-羥基丁酸解聚 酶酶活力比原始菌活力提高了 51%(附圖1)。該菌株已于2013年12月25日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京朝陽區(qū)大屯路，保藏號為CGMCC No. 8638。
[0029] 實施例3粗酶液的制備及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化 粗酶液制備采用液體搖瓶發(fā)酵法，發(fā)酵30h后將發(fā)酵液置于14000rpm離心機中4°C條 件下離心lOmin，所得上清液即為粗酶液。
[0030] 液體搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成均以單因素和響應面實驗法進行了優(yōu)化， 具體優(yōu)化過程如下： (1)產(chǎn)酶時間曲線的測定 菌株在基本培養(yǎng)基(聚 3-羥基丁酸：0. 15% ;Na2HP04 ? 12H20 :1. 194% ;KH2P04 : 0 . 5 54% ; NH4C1 :0? 1% ;MgS04 ? 7H20 :0? 05% ;CaCl2 ? 2H20 :0? 0005%，121 °C高壓蒸汽滅菌 20 min)中發(fā) 酵，每6 h取發(fā)酵液測酶活，繪制發(fā)酵時間-酶活曲線（圖2)。結(jié)果顯示培養(yǎng)初期發(fā)酵液中 聚3-羥基丁酸解聚酶活性迅速上升，在培養(yǎng)30h時酶活最高，并且隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā) 酵液中酶活下降，確定產(chǎn)酶時間為30h。
[0031] (2)菌株培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化 對菌株的產(chǎn)酶條件進行單因素條件優(yōu)化，優(yōu)化了培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量和培養(yǎng)基的 初始pH。實驗確定該菌株的最適產(chǎn)酶溫度為30 °C，最適產(chǎn)酶接種量為5%，最適產(chǎn)酶裝液量 為100 mL/500 mL，最適產(chǎn)酶pH值為8.0 (圖3)。接種量對菌株產(chǎn)酶的影響較小，溫度及裝 液量對酶活性影響較大，菌株在中性和堿性培養(yǎng)條件下發(fā)酵液都保持較高的活性，但在酸 性條件下酶活較低。
[0032] (3)培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化 對菌株產(chǎn)酶的培養(yǎng)基條件進行優(yōu)化，實驗確定菌株最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件為：〇. 15% PHB，0? 2% NH4C1，1. 2/0. 45% Na2HP04 ? 12H20/KH2P04,0 . 07% MgS04 (圖 4)，另外培養(yǎng)基中還 加入0. 0005% CaCl2 ? 2H20,但是Ca2+的有無對菌株產(chǎn)酶的影響不大。
[0033] (4)產(chǎn)酶條件的響應面優(yōu)化 根據(jù)單因素條件的優(yōu)化結(jié)果，利用響應面的中心組合實驗設計進行進一步的優(yōu)化。設 計三因素五水平的響應面分析試驗，以培養(yǎng)溫度、pH值、裝液量為自變量，分別設為X2， X3，每個自變量的五個水平如表1進行編碼。
[0034] 表1中心組合試驗設計中自變量的范圍

【權利要求】
1. 一株高產(chǎn)聚3-輕基丁酸解聚酶的誘變菌株假單胞菌(Aet/offioaas sp. )DS1001a， 其特征在于菌落呈圓形，白色，表面光滑無皺紋，邊緣較整齊，表面較濕潤，易挑起；菌體呈 短桿狀，革蘭氏陰性，有鞭毛，無芽孢和莢膜；較原始菌株降解聚3-羥基丁酸的能力更強， 該菌株已于2013年12月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地 址：北京朝陽區(qū)大屯路，保藏號為CGMCC No. 8638。
2. 權利要求1所述的假單胞菌在發(fā)酵生產(chǎn)聚3-羥基丁酸解聚酶中的應用。
3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于，發(fā)酵所用的培養(yǎng)基成分為：聚3-羥基丁酸 0? 2%，NH4C1 0? 15% ; Na2HP04.12H20/KH2P0 4 1. 45 /0 . 48%，MgS04 0? 07% ;CaCl2.2H20 0? 0005%。
4. 如權利要求2-3所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵條件為：接種量5%，培養(yǎng)溫度 27. 5°C、培養(yǎng)基初始pH 8. 3,裝液量20%-30%，搖床轉(zhuǎn)速130rpm，培養(yǎng)時間30h。
5. 權利要求1所述的假單胞菌在轉(zhuǎn)化生產(chǎn)（R)-3-羥基丁酸中的應用。
6. 如權利要求5所述的應用，其特征在于，利用菌株發(fā)酵得到的粗酶液在最適反應條 件下降解聚3-羥基丁酸底物轉(zhuǎn)化生成（R)-3-羥基丁酸單體。
7. 如權利要求5-6所述的應用，其特征在于，所述最適反應條件為反應溫度50°C、反應 pH 為 8. 0。
【文檔編號】C12R1/38GK104328062SQ201410260125
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權日:2014年6月13日
【發(fā)明者】李凡, 陳珊, 張春雨 申請人:東北師范大學