一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的方法，利用的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，利用該方法可以簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)。本發(fā)明公開(kāi)了一對(duì)引物，由如下(1)和(2)所示的DNA分子組成：(1)SEQ?ID?No.3所示的DNA分子；(2)SEQ?ID?No.4所示的DNA分子。本發(fā)明選擇煙草自身單拷貝的內(nèi)源基因核糖核酸還原酶基因(RNR2)作為內(nèi)參基因，通過(guò)SYBR?GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因的拷貝數(shù)。本發(fā)明公開(kāi)的方法可以為今后轉(zhuǎn)基因煙草的拷貝數(shù)分析提供一種新的思路，滿(mǎn)足基因工程中對(duì)優(yōu)良轉(zhuǎn)化植株的篩選需求。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的方法；特別涉及一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于生產(chǎn)藥用蛋白、改善作物品質(zhì)、提高作物產(chǎn)量等領(lǐng)域的研究。目前植物轉(zhuǎn)基因所采用的方法主要是根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，但是農(nóng)桿菌所攜帶的含有目的基因的T-DNA區(qū)域是隨機(jī)的插入受體植物基因組中的，因而得到的轉(zhuǎn)基因植株往往含有一到多個(gè)拷貝的外源基因。轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的拷貝數(shù)是影響該基因的表達(dá)量的關(guān)鍵因素，多拷貝的外源基因會(huì)直接導(dǎo)致基因沉默或者不能穩(wěn)定表達(dá)。煙草(Nicotiana tabacum)是一種雙子葉的爺科的植物，目前廣泛的作為基因工程研究的模式植物，而轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因的拷貝數(shù)是直接影響目的基因的表達(dá)水平和穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵因 素，因此，鑒定出轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因的拷貝數(shù)是進(jìn)行后續(xù)研究的基礎(chǔ)。
[0003]目前，在植物的遺傳轉(zhuǎn)化后期的研究中，確定外源基因是否整合到轉(zhuǎn)化植株基因組上，以及確定轉(zhuǎn)化植株的拷貝數(shù)對(duì)于后期的研究是非常重要的，傳統(tǒng)的方法主要是使用Southern雜交，該方法的準(zhǔn)確性已經(jīng)得到了普遍的認(rèn)可，但是該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、每個(gè)泳道需要10-30yg的DNA樣品等缺點(diǎn)，而且如果外源基因在插入轉(zhuǎn)化植物基因組時(shí)發(fā)生重組，造成限制性酶切位點(diǎn)的丟失，就不能用Southern雜交進(jìn)行拷貝數(shù)的檢測(cè)，該方法需要昂貴的試劑，花費(fèi)的時(shí)間較多，需要的DNA材料也較多，而植物組培分化形成的抗性苗往往較弱不適于大量取樣，也存在鑒定出的多拷貝插入點(diǎn)不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是在PCR反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料或者特異性的熒光探針，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中熒光量的變化，獲得達(dá)到一定熒光量(閾值)所需的循環(huán)數(shù)Ct。通過(guò)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及其對(duì)應(yīng)的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，就可以準(zhǔn)確的對(duì)未知樣品進(jìn)行定量。相比于Southern雜交，該方法方便、快捷、需要的DNA量較少、且不需要使用放射性物質(zhì)，由于該方法的特異性強(qiáng)，因而得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確真實(shí)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不僅可以對(duì)特定的T-DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，也可以對(duì)轉(zhuǎn)基因品系中基因重組進(jìn)行檢測(cè)。由于植物的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，實(shí)時(shí)熒光定量方法使用較少的材料就可以進(jìn)行檢測(cè)，因此在植物培養(yǎng)的早期就可以進(jìn)行檢測(cè)篩選，避免了大量組培的工作。因而，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種可行的轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)分析的方法。
[0004]在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和Southern雜交所得的拷貝數(shù)結(jié)果十分接近，但是有部分結(jié)果顯示實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得的拷貝數(shù)稍高于Southern雜交。Ingham等在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因的拷貝數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得的拷貝數(shù)結(jié)果高于Southern雜交。這種情況可能是由于多重因素造成的，比如在Southern雜交中酶切消化不完全、基因重排、顯影本底的高低等因素都可能造成這種錯(cuò)誤的結(jié)果。因而，實(shí)時(shí)熒光定量PCR得到的拷貝數(shù)結(jié)果更加接近于客觀(guān)事實(shí)。
[0005]開(kāi)發(fā)一種能檢測(cè)鑒定出轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)進(jìn)行后續(xù)研究具有重要影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的方法，利用的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，利用本發(fā)明提供的方法可以簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)。
[0007]本發(fā)明提供一對(duì)引物，由如下⑴和(2)所示的DNA分子組成:
[0008](I) SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子；
[0009](2) SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子。
[0010]一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑盒包含上述的引物。
[0011]所述試劑盒還包含使用說(shuō)明書(shū)，說(shuō)明書(shū)中記載內(nèi)容如下:以梯度稀釋的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子分別為上游引物和下游引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；將稀釋度最小的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA模板的濃度記作1，計(jì)算得到其他稀釋度的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA模板的濃度與稀釋度最小的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA模板的濃度的比值，將I和計(jì)算得到的各個(gè)比值記作拷貝數(shù)濃度值；以拷貝數(shù)濃度值的Ig值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為橫坐標(biāo)，繪制內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式1，同時(shí)以待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，得到Ct值X1 ;將以值X1帶入內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式1，得到待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中的內(nèi)參基因的拷貝數(shù)濃度值的Ig值，即Y1;
[0012]以梯度稀釋的含有外源基因的質(zhì)粒為模板，以外源基因的上游引物和下游引物為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；將稀釋度最小的含有外源基因的質(zhì)粒模板的濃度記作1，計(jì)算得到其他稀釋度的含有外源基因的質(zhì)粒模板的濃度與稀釋度最小的含有外源基因的質(zhì)粒模板的濃度的比值，將I和計(jì)算得到的各個(gè)比值記作拷貝數(shù)濃度值；以拷貝數(shù)濃度值的Ig值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為橫坐標(biāo)繪制外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式2，同時(shí)以待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，得到Ct值X2 ;將Ct值X2帶入外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式2，得到待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中的外源基因的拷貝數(shù)濃度值的Ig值，即Y2 ；
[0013]Y2ZY1即為待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中的外源基因的拷貝數(shù)，當(dāng)Y2A1小數(shù)點(diǎn)后第一位大于5時(shí)，整數(shù)部分加1，小于等于5時(shí)，整數(shù)部分不變，整數(shù)部分即為轉(zhuǎn)基因煙草中的外源基因拷貝數(shù)；
[0014]所述稀釋度最小是指稀釋倍數(shù)最?。?br> [0015]所述模板的濃度單位相同；
[0016]所述內(nèi)參基因?yàn)楹颂呛怂徇€原酶(Ribonucleotide reductase) RNR2 ;
[0017]所述梯度稀釋的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA的濃度分別為0.0406 μ g/yL、0.00812 μ g/μ L、0.001624 μ g/μ L、0.0003248 μ g/μ L、0.00006496 μ g/μ L ；
[0018]所述非轉(zhuǎn)基因煙草具體為非轉(zhuǎn)基因煙草品種Κ346 ；
[0019]所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為:模板2 μ LUOymol.L-1的上游引物、下游引物各 0.3 μ L、SYBRfi Premix Ex Taq?II10 μ L,加入 ddH20 補(bǔ)足體系至 20 μ L ；[0020]所述SYBR? Premix Ex Taq?II具體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；
[0021]所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為:95°C 30s ；95°C 5s，60°C 30s, 40個(gè)循環(huán)。
[0022]一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，以梯度稀釋的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ IDN0.4所示的DNA分子分別為上游引物和下游引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；將稀釋度最小的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA模板的濃度記作1，計(jì)算得到其他稀釋度的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA模板的濃度與稀釋度最小的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA模板的濃度的比值，將I和計(jì)算得到的各個(gè)比值記作拷貝數(shù)濃度值；以拷貝數(shù)濃度值的Ig值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為橫坐標(biāo)，繪制內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式1，同時(shí)以待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，得到Ct值X1 ;將Ct值X1帶入內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式1，得到待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中的內(nèi)參基因的拷貝數(shù)濃度值的Ig值，即Y1 ;
[0023]以梯度稀釋的含有外源基因的質(zhì)粒為模板，以外源基因的上游引物和下游引物為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；將稀釋度最小的含有外源基因的質(zhì)粒模板的濃度記作1，計(jì)算得到其他稀釋度的含有外源基因的質(zhì)粒模板的濃度與稀釋度最小的含有外源基因的質(zhì)粒模板的濃度的比值，將I和計(jì)算得到的各個(gè)比值記作拷貝數(shù)濃度值；以拷貝數(shù)濃度值的Ig值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為橫坐標(biāo)繪制外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式2，同時(shí)以待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，得到Ct值X2 ;將Ct值X2帶入外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式2，得到待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中的外源基因的拷貝數(shù)濃度值的Ig值，即Y2 ；
[0024]Y2ZY1即為待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中的外源基因的拷貝數(shù)，當(dāng)Y2A1小數(shù)點(diǎn)后第一位大于5時(shí)，整數(shù)部分加1，小于等于5時(shí)，整數(shù)部分不變，整數(shù)部分即為轉(zhuǎn)基因煙草中的外源基因拷貝數(shù)；
[0025]所述模板的濃度單位相同；
[0026]所述內(nèi)參基因?yàn)楹颂呛怂徇€原酶基因RNR2 ；
[0027]所述外源基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)入的基因。
[0028]上述方法中，所述梯度稀釋的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA的濃度分別為
0.0406 μ g/μ L、0.00812 μ g/μ L、0.001624 μ g/μ L、0.0003248 μ g/μ L、0.00006496 μ g/μ L0
[0029]上述任一所述的方法中，所述實(shí)時(shí)突光定量PCR的反應(yīng)體系為:模板2μ L、
10μ mo I.I71 的上游引物、下游引物各 0.3 μ L、SYBR? Premix Ex Taq?II10 μ L，加入 ddH20補(bǔ)足體系至20 u L ；
[0030]SYBR? Premix Ex Taq?II具體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；
[0031]所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為:95°C 30s ；95°C 5s，60°C 30s, 40個(gè)循環(huán)。
[0032]所述內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式I具體為Y1 = -0.2858X1+5.6695。
[0033]上述任一所述的方法中，所述非轉(zhuǎn)基因煙草為非轉(zhuǎn)基因煙草品種K346。
[0034]所述轉(zhuǎn)基因煙草的外源基因具體為GFP基因；
[0035]所述轉(zhuǎn)基因煙草具體是通過(guò)在非轉(zhuǎn)基因煙草通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法方法導(dǎo)入PBI121-GFP質(zhì)粒得到的；
[0036]所述非轉(zhuǎn)基因煙草具體為非轉(zhuǎn)基因煙草品種K346 ；[0037]所述梯度稀釋的含有外源基因的質(zhì)粒的濃度具體分別為0.0356 μ g/yL、
0.00712 μ g/μ L、0.001424 μ g/μ L、0.0002848 μ g/μ L、0.00005696 μ g/μ L ；
[0038]所述外源基因的上游引物和下游引物分別具體為SEQ ID N0.5所示的DNA分子和SEQ ID N0.6所示的DNA分子；
[0039]所述外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式2具體為Y2 = -0.2826Χ3+2.1048。
[0040]上述引物、上述試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0041]所述轉(zhuǎn)基因煙草的外源基因具體為GFP基因； [0042]所述轉(zhuǎn)基因煙草具體是通過(guò)在非轉(zhuǎn)基因煙草通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法方法導(dǎo)入PBI121-GFP質(zhì)粒得到的；
[0043]所述非轉(zhuǎn)基因煙草具體為非轉(zhuǎn)基因煙草品種Κ346。
[0044]本發(fā)明選擇煙草自身單拷貝的內(nèi)源基因核糖核酸還原酶基因(RNR2)作為內(nèi)參基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因的拷貝數(shù)。本發(fā)明提供的方法可以為今后轉(zhuǎn)基因煙草的拷貝數(shù)分析提供一種新的思路，滿(mǎn)足基因工程中對(duì)優(yōu)良轉(zhuǎn)化植株的篩選需求。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045]圖1為轉(zhuǎn)GFP基因煙草的PCR檢測(cè)。
[0046]圖2為內(nèi)參基因RNR2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0047]圖3為外源基因GFP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0048]圖4為內(nèi)參基因RNR2熔解曲線(xiàn)。
[0049]圖5為外源基因GFP熔解曲線(xiàn)。
[0050]圖6為內(nèi)參基因RNR2引物的可靠性分析。
[0051]圖7為外源基因GFP引物的可靠性分析。
【具體實(shí)施方式】
[0052]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0053]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0054]非轉(zhuǎn)基因煙草品種Κ346 (Nicotiana tabacum cv.346)在文獻(xiàn)“羅聰.芒果遺傳多樣性及逆境和重要開(kāi)花時(shí)間相關(guān)基因研究[博士學(xué)位論文].南寧:廣西大學(xué)，2012”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0055]pBI121-GFP質(zhì)粒在文獻(xiàn)“羅聰.芒果遺傳多樣性及逆境和重要開(kāi)花時(shí)間相關(guān)基因研究[博士學(xué)位論文].南寧:廣西大學(xué)，2012”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0056]下述實(shí)施例中轉(zhuǎn)GFP基因煙草的構(gòu)建過(guò)程如下:將含有外源基因GFP的植物表達(dá)載體PBI121-GFP通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)入非轉(zhuǎn)基因煙草品種K346，通過(guò)以下PCR篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)GFP基因的煙草。
[0057]1、取農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法篩選得到的轉(zhuǎn)化煙草植株的幼嫩葉片，用改良的CTAB法提取煙草基因組DNA(方法參照文獻(xiàn)“羅聰.芒果遺傳多樣性及逆境和重要開(kāi)花時(shí)間相關(guān)基因研究[博士學(xué)位論文].南寧:廣西大學(xué)，2012”)。2、根據(jù)植物表達(dá)載體pBI121-GFP上GFP基因序列設(shè)計(jì)特異引物，引物序列為GFP1:5’ -ATGGGTAAAGGAGAAGAACT-3，(SEQ IDN0.1)，GFP2:5，-TTATTTGTATAGTTCATCCA-3’ (SEQ ID N0.2)(參照文獻(xiàn)“羅聰.芒果遺傳多樣性及逆境和重要開(kāi)花時(shí)間相關(guān)基因研究[博士學(xué)位論文].南寧:廣西大學(xué)，2012”)，目的條帶為718bp。3、以步驟I得到的基因組DNA為模板，以GFPl和GFP2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以PBI121-GFP為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因煙草K346的基因組DNA為模板為陰性對(duì)照，進(jìn)行上述PCR檢測(cè)，得到各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，各產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示。圖1中，I為陽(yáng)性對(duì)照；2為陰性對(duì)照；3-12為轉(zhuǎn)基因植株；M為DL2000Marker。篩選獲得具有718bp目的條帶的陽(yáng)性轉(zhuǎn)GFP基因的煙草作為下述實(shí)施例中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)拷貝數(shù)的材料。
[0058]SYBR? Premix Ex Taq?II購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。
[0059]實(shí)施例1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)
[0060]一、引物設(shè)計(jì)
[0061]選用煙草內(nèi)源的單拷貝基因一核糖核酸還原酶(Ribonucleotidereductase)RNR2 (該基因的拷貝數(shù)在文獻(xiàn) “Chaboute M E, Combettes B, Clement B, et al.Molecularcharacterizat1n of tobacco ribonucleotide reductase RNRI and RNR2cDNAs andcell cycle regulated express1n in synchronized plant cells.Plant MolecularB1logy, 1998，38:797-806”中公開(kāi)過(guò))作為內(nèi)參基因。設(shè)計(jì)內(nèi)參基因RNR2和外源基因GFP的引物如下:
[0062]上游引物RNR2U :5’ -TACCCGTCACTGGGAAAC-3，(SEQ ID N0.3)
[0063]下游引物RNR2D:5’ -GGAAGCCGTAGAAAGCAC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0064]以RNR2U和RNR2D為引物擴(kuò)增煙草中的內(nèi)參基因RNR2，目的片段長(zhǎng)度為158bp ；
[0065]上游引物GFPTU:5’ -AACTACTACTCCCACAACG-3’ (SEQ ID N0.5)
[0066]下游引物GFPTD:5’ -ATGGTCTGCTGGTGAACG-3’ (SEQ ID N0.6)
[0067]以GFPTU和GFPTD為引物擴(kuò)增煙草中的外源基因GFP，目的片段長(zhǎng)度為112bp。
[0068]二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)
[0069](一)實(shí)時(shí)突光定量PCR反應(yīng)體系以及程序
[0070]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系:模板2 μ LUOymol.l-1的上、下游引物各0.3 μ L、SYBR? Premix Ex Taq?II10 μ L,加入 ddH20 補(bǔ)足至 20 μ L。
[0071]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序:95°C 30s ；95°C 5s,60°C 30s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析。
[0072]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在羅氏Light cycler2.0熒光定量PCR儀上進(jìn)行。
[0073](二)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作
[0074]1、提取非轉(zhuǎn)基因煙草品種K346的基因組DNA作為內(nèi)參基因RNR2的標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度法測(cè)得基因組DNA濃度為0.0406 μ g/μ L，進(jìn)行5倍梯度稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)分別為5°，5—1，5_2，5_3，5_4，得到5個(gè)濃度稀釋的內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)品。將稀釋度最小的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA的濃度記作1，計(jì)算得到其他稀釋度的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA的濃度與稀釋度最小的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA的濃度的比值，將I和計(jì)算得到的各個(gè)比值記作拷貝數(shù)濃度值，求得的拷貝數(shù)濃度分別為5°拷貝/ μ L，5—1拷貝/ μ L，5_2拷貝/ μ L，5_3拷貝/ μ L，5_4拷貝/ μ L。提取5株轉(zhuǎn)GFP基因煙草的基因組DNA，作為5個(gè)轉(zhuǎn)GFP基因煙草檢測(cè)樣品。
[0075]2、分別以5個(gè)濃度稀釋的內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)品、5個(gè)轉(zhuǎn)GFP基因煙草檢測(cè)樣品、水(空白對(duì)照)作為模板，以?xún)?nèi)參基因RNR2引物(RNR2U和RNR2D)為引物，進(jìn)行步驟(一)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)。
[0076]以5個(gè)濃度稀釋的內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)品的初始模板拷貝數(shù)濃度的Ig值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式，結(jié)果如圖2所示。
[0077](三)外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作
[0078]1、以pBI121-GFP作為外源基因GFP的標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0.0356 μ g/μ L，進(jìn)行5倍梯度稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)分別為5^515-2,5-3,5'得到5個(gè)濃度稀釋的外源基因標(biāo)準(zhǔn)品。將稀釋度最小的含有外源基因的質(zhì)粒的濃度記作1，計(jì)算得到其他稀釋度的含有外源基因的質(zhì)粒的濃度與稀釋度最小的含有外源基因的質(zhì)粒的濃度的比值，將I和計(jì)算得到的各個(gè)比值記作拷貝數(shù)濃度值；求得的拷貝數(shù)濃度分別為5°拷貝/ μ L，5-1拷貝/ μ L，5_2拷貝/ μ L，5_3拷貝/ μ L，5_4拷貝/ μ L。
[0079]2、分別以5個(gè)濃度稀釋的外源基因標(biāo)準(zhǔn)品、5個(gè)轉(zhuǎn)GFP基因煙草檢測(cè)樣品(同二中所提取的5個(gè)檢測(cè)樣品)、非轉(zhuǎn)基因煙草品種Κ346的基因組DNAdK (空白對(duì)照)作為模板，以外源基因GFP引物(GFPTU和GFPTD)為引物，進(jìn)行步驟(一)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò) 增，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)。
[0080]以5個(gè)濃度稀釋的外源基因標(biāo)準(zhǔn)品的初始模板拷貝數(shù)濃度的Ig值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式，結(jié)果如圖3所示。
[0081]圖2表明，內(nèi)參基因RNR2的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式為Y1 = -0.2858Χ1+5.6695，R2 = 0.9994。
[0082]圖3表明，外源基因GFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式為Y2 = -0.2826Χ3+2.1048,R2 = 0.9989。
[0083]兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)公式的相關(guān)系數(shù)均接近于1，因此可以準(zhǔn)確的對(duì)樣品進(jìn)行定量。
[0084](四)引物特異性
[0085]RNR2基因的熔解曲線(xiàn)如圖4所示。
[0086]GFP基因的熔解曲線(xiàn)如圖5所示。
[0087]從圖4和圖5中可以看出，RNR2基因和GFP基因的熔解曲線(xiàn)都為單峰，說(shuō)明各自的引物特異性較好，在反應(yīng)中無(wú)非特異性擴(kuò)增，無(wú)引物二聚體，說(shuō)明得到的實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)是可靠的。
[0088](五)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因的定量檢測(cè)
[0089]步驟(二)中以5個(gè)濃度稀釋的內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)品、5個(gè)轉(zhuǎn)GFP基因煙草檢測(cè)樣品、水(空白對(duì)照)作為模板，以?xún)?nèi)參基因RNR2引物(RNR2U和RNR2D)為引物，進(jìn)行步驟(一)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示，擴(kuò)增結(jié)果顯示所有的煙草植株均有擴(kuò)增，而空白對(duì)照水沒(méi)有擴(kuò)增。
[0090]步驟(三)中分別以5個(gè)濃度稀釋的外源基因標(biāo)準(zhǔn)品、5個(gè)轉(zhuǎn)GFP基因煙草檢測(cè)樣品、非轉(zhuǎn)基因煙草品種Κ346的基因組DNAdK (空白對(duì)照)作為模板，以外源基因GFP引物(GFPTU和GFPTD)為引物，進(jìn)行步驟(一)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖7所示，擴(kuò)增結(jié)果顯示轉(zhuǎn)GFP基因煙草植株的樣品有擴(kuò)增，而非轉(zhuǎn)基因煙草品種Κ346樣品及空白對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增，說(shuō)明樣品沒(méi)有污染，結(jié)果可信。
[0091](六)由步驟(二)得到的5株轉(zhuǎn)GFP基因煙草中內(nèi)參基因RNR2和步驟(三)得到的這些煙草中外源基因GFP的Ct值和Tm值如表1所示。
[0092]表1檢測(cè)樣品中RNR2和GFP基因的Ct值和Tm值
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)引物，由如下(I)和⑵所示的DNA分子組成:
(1)SEQ ID N0.3 所示的 DNA 分子；
(2)SEQ ID N0.4 所示的 DNA 分子。
2.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物。
3.—種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)的方法，包括如下步驟:以梯度稀釋的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.3所示的DNA分子和SEQ ID N0.4所示的DNA分子分別為上游引物和下游引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；將稀釋度最小的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA模板的濃度記作1，計(jì)算得到其他稀釋度的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA模板的濃度與稀釋度最小的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA模板的濃度的比值，將I和計(jì)算得到的各個(gè)比值記作拷貝數(shù)濃度值；以拷貝數(shù)濃度值的Ig值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為橫坐標(biāo)，繪制內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式1，同時(shí)以待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，得到Ct值X1 ;將Ct值X1帶入內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式1，得到待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中的內(nèi)參基因的拷貝數(shù)濃度值的Ig值，即Y1 ; 以梯度稀釋的含有外源基因的質(zhì)粒為模板，以外源基因的上游引物和下游引物為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；將稀釋度最小的含有外源基因的質(zhì)粒模板的濃度記作1，計(jì)算得到其他稀釋度的含有外源基因的質(zhì)粒模板的濃度與稀釋度最小的含有外源基因的質(zhì)粒模板的濃度的比值，將I和計(jì)算得到的各個(gè)比值記作拷貝數(shù)濃度值；以拷貝數(shù)濃度值的Ig值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為橫坐標(biāo)繪制外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式2，同時(shí)以待檢測(cè)轉(zhuǎn) 曲線(xiàn)公式2，得到待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中的外源基因的拷貝數(shù)濃度值的Ig值，即Y2 ; Y2A1即為待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中的外源基因的拷貝數(shù)，當(dāng)Y2A1小數(shù)點(diǎn)后第一位大于5時(shí)，整數(shù)部分加1，小于或等于5時(shí)，整數(shù)部分不變，整數(shù)部分即為轉(zhuǎn)基因煙草中的外源基因拷貝數(shù)； 所述模板的濃度單位相同； 所述內(nèi)參基因?yàn)楹颂呛怂徇€原酶基因RNR2 ； 所述外源基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)入的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述梯度稀釋的非轉(zhuǎn)基因煙草的基因組 DNA 的濃度分別為 0.0406 μ g/μ L,0.00812 μ g/μ L、0.001624 μ g/μ L、0.0003248 μ g/μ L、0.00006496 μ g/μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為:模板2 μ L、10 μ mo I.I71的上游引物、下游引物各0.3 μ L、SYBRf^ Premix ExTaq?II10y L，加入ddH20補(bǔ)足體系至20 μ L ； SYBR? Premix Ex Taq?II具體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司； 所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為:95°C 30s ；95°C 5s, 60°C 30s, 40個(gè)循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的方法，其特征在于:所述非轉(zhuǎn)基因煙草為非轉(zhuǎn)基因煙草品種K346。
7.權(quán)利要求1所述的引物、權(quán)利要求2所述的試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104032007SQ201410260160
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】謝芝勛, 王盛, 謝麗基, 謝志勤, 黃莉, 鄧顯文, 羅思思, 黃嬌玲, 劉加波 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所