一株抗吡利霉素通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株抗吡利霉素通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明細(xì)胞株，分類命名為單克隆細(xì)胞株B號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.9302。本發(fā)明用高碘酸鈉法將吡利霉素的鄰二醇結(jié)構(gòu)氧化為醛基后與蛋白的氨基偶聯(lián)，得到的完全抗原免疫小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞，通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接ELISA篩選和三次亞克隆篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞株；擴大培養(yǎng)誘導(dǎo)得到吡利霉素的單克隆抗體。本發(fā)明單克隆細(xì)胞株B號制備方法簡便，完全抗原和包被抗原合成方便快捷，獲得的細(xì)胞株分泌的抗體有較好的靈敏度（IC50值為5ng/mL），滿足劑量依賴性的要求，為間接競爭?ELISA?試劑盒的研發(fā)推廣奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一株抗吡利霉素通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株抗吡利霉素通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，具體涉及單克隆細(xì)胞株B號及其產(chǎn)生的抗吡利霉素通用單克隆抗體，屬于食品安全免疫學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]吡利霉素是最新研制的半合成林可胺類抗生素，是林可霉素衍生物，該藥常用作奶牛乳房注入劑使用，體外及臨床試驗結(jié)果表明該藥對金黃色葡萄球菌、無乳球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌等所致的臨床及亞臨床型乳腺炎效果明顯。吡利霉素食物蓄積后對胃腸道有毒性，造成惡心、嘔吐、食欲不振腹瀉；過敏反應(yīng):可出現(xiàn)藥物性皮疹；可發(fā)生堿性磷酸酶、血清轉(zhuǎn)氨酶輕度升高及黃疸、腎功能異常。美國和歐盟規(guī)定吡利霉素在上市牛奶中的最聞殘留限量100 μ g/Lo
[0003]目前檢測吡利霉素的方法主要有儀器方法與免疫分析方法。儀器檢測方法雖然檢測準(zhǔn)確，但儀器昂貴，操作復(fù)雜，樣品前處理繁瑣。免疫分析方法相對于儀器檢測方法，具有低成本、高通量、高靈敏、對技術(shù)人員要求低等特點，因此適用于大量樣品的快速篩查。配合儀器，可廣泛應(yīng)用于檢驗檢疫、商檢執(zhí)法等部門，是非常具有推廣價值的食品安全快速篩查方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種對吡利霉素具有較好檢測靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，及其分泌的單克隆抗體在吡利霉素檢測中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案，一株抗吡利霉素通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其分類命名為單克隆細(xì)胞株B號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC N0.9302。
[0006]本發(fā)明提供的單克隆細(xì)胞株B號的制備，基本步驟為:
(1)免疫原的制備與鑒定:吡利霉素通過高碘酸鈉法與蛋白載體相連，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過SDS-PAGE鑒定；
(2)小鼠的免疫:將抗原與QuickAntibody免疫佐劑?混合均勻后,通過腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠。通過間接ELISA檢測血清效價和抑制；
(3)細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立:通過聚乙二醇(PEG4000)法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測陽性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細(xì)胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株B號；
(4)單克隆細(xì)胞株B號性質(zhì)的鑒定:抗體亞型的鑒定采用小鼠單克隆抗體亞型檢測試劑盒方法，測IC5tl值。
[0007]所述菌株單克 隆細(xì)胞株B號分泌產(chǎn)生的抗吡利霉素單克隆抗體，其由抗吡利霉素通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株B號所分泌產(chǎn)生。將抗吡利霉素單克隆抗體進(jìn)行純化，建立間接競爭ELISA，采用⑶I法將吡利霉素和蛋白偶聯(lián)合成包被抗原，并應(yīng)用于吡利霉素的檢測。
[0008]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明獲得抗吡利霉素單克隆抗體細(xì)胞株的制備方法簡便，完全抗原和包被抗原合成方便快捷，獲得的細(xì)胞株分泌的抗體有較好的靈敏度(IC5tl值為5ng/mL)。單克隆抗體不僅能應(yīng)用于批利霉素的酶標(biāo)記抗體、突光標(biāo)記抗體、膠體金標(biāo)記抗體等；而且在后續(xù)的競爭實驗中，滿足劑量依賴性的要求，為間接競爭ELISA試劑盒的研發(fā)推廣奠定了基礎(chǔ)。
[0009]生物材料樣品保藏:上述小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株B號，已于2014年5月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJi址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0.9302。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1、SDS-PAGE檢測純化后抗體純度。1:蛋白marker ；2:小鼠單克隆抗體。
[0011]圖2、抗原抗體競爭反應(yīng)對數(shù)曲線。
【具體實施方式】
[0012]本發(fā)明下面的實施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施 例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0013]骨髓瘤細(xì)胞SP2/0種子來源于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。6周齡的BALB/c純系雌性小鼠購自北京維通利華實驗動物中心。胎牛血清(上海洛神，Lot 20090525),細(xì)胞融合用 PEG 4000 (sigma), 50XHAT 儲液(sigma, H0262，093K8931)，50XHT (sigmaH0317, Lot 064K8927), 1640 培養(yǎng)基(Gibco，Lot ) DMSO (Amresco 0231 )，石蠟油(國藥試劑公司)。BSA (Sigma，A7638)，OVA (Sigma，A5378)。
[0014]實施例1單克隆細(xì)胞株B號的獲得及其產(chǎn)生的抗吡利霉素的單克隆抗體的鑒定 一、單克隆細(xì)胞株B號的獲得
1、吡利霉素完全抗原PIR-KLH的制備:取2mg PIR溶于水中，加入5.2 mg的高碘酸鈉，室溫活化40min。另取7mg KLH溶解于2.5 mL、0.01M、pH9.6的CBS溶液中，將上述活化后的吡利霉素溶液慢速逐滴加入KLH溶液中，室溫攪拌反應(yīng)4h，4°C透析三天，_20°C分裝保存。
[0015]2、吡利霉素包被抗原PIR-OVA的制備:取6mg PIR溶于DMF中，取IOmg CDI溶于DMF中，將兩溶液混合于37°C活化50min。取15mg OVA溶于3 mL,0.01 M、pH 9.6的CBS溶液中，將活化液滴加入蛋白液中，反應(yīng)過夜，4 °C透析三天，-20°C分裝保存。
[0016]3、動物免疫:選擇健康的6~8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。取批利霉素完全抗原(lmg/mL)與等量QuickAntibody免疫佐劑?混合均勻后，通過腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠，每只50 μ L，間隔時間為21天。在第四次加強免疫后的第10天，對小鼠進(jìn)行尾部靜脈取血，用間接ELISA法測定效價，其中，包被PIR-OVA的濃度為I μ g/mL。選擇抑制最好的小鼠進(jìn)行一次沖擊免疫，進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0017]4、細(xì)胞融合:在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為4000)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下:
(1)無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；
(2)收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；
(3)將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照數(shù)量比1: 10混合，離心后用50% PEG融合，時間Imin,之后按照從慢到快，加入RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50 XHAT的RPM1-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 °C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0018]5、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立:在細(xì)胞融合的第三天對融合細(xì)胞進(jìn)行RPM1-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天進(jìn)行用含20%胎牛血清、1%的100 XHT的RPM1-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第9天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。
[0019]篩選分兩步:第一步先用間接ELISA篩選出陽性細(xì)胞孔，第二步選用PIR為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競爭ELISA對陽性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測定。采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測。重復(fù)三次，獲得單克隆細(xì)胞株B號。
[0020]實施例2單克隆抗體的制備與鑒定
1、獲取抗體腹水和純化:選取10周齡BALB/c小鼠，接種細(xì)胞前7~14天，預(yù)先腹腔注射液體石蠟ImL/只。用生理鹽水調(diào)整單克隆細(xì)胞株B號濃度至2.0X 10 6個/ mL，腹腔接種單克隆細(xì)胞株B號，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于_20°C保存。
[0021]2、抗體亞型鑒定:
采用單克隆抗體亞型檢測試劑盒(Southern Biotech Cat N0.530005)對步驟I獲得的抗體進(jìn)行免疫球蛋白亞型的鑒定，具體方法為:用PIR-OVA以I μ g/mL包被在96孔酶聯(lián)板(每孔0.lmL)，4°C過夜，棄包被液，洗滌3次，按0.2mL/孔的量加入封閉液(含1%BSA的PBS)，37°C孵育I h后，棄封閉液，洗滌3次，用PBS以1:4000比例稀釋吡利霉素單克隆抗體，按0.1mL/孔的量加入到酶聯(lián)板內(nèi)，37°C孵育I h后洗滌3次，加入用PBS以1:5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的各類抗體(小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA及IgM)37°C孵育半小時后洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入辣根過氧化物酶底物反應(yīng)液(lmg/mL TMB), 37 °C反應(yīng)10 min,出現(xiàn)藍(lán)色即為陽性結(jié)果，最后按0.05mL/孔的量加入2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。
[0022]結(jié)果表明單克隆細(xì)胞株B號分泌的抗體為IgGl亞類。
[0023]SDS-PAGE檢測純化后抗體純度如圖1所示。
[0024]實施例3用單克隆細(xì)胞株B號分泌的抗體建立間接競爭ELISA方法的應(yīng)用
將單克隆細(xì)胞株B號通過體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于吡利霉素ELISA添加回收試驗，具體步驟如下:
(1)用碳酸鹽緩沖液(CBS)稀釋好的Iμ g/mL PIR-OVA作為包被原包被96孔酶標(biāo)板，每孔10(^匕371:包被2 11后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250 μ L，每次3 min，拍干；
(2)用含0.01%明膠的CBS進(jìn)行封閉，每孔200μ L，37°C封閉2 h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250 μ L,每次3 min,拍干；
(3)用含30%甲醇的磷酸鹽緩沖液(PBS)分別配置0，0.625，1.25，2.5，5，10，20，40 μ g/L的吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液以及待檢測樣品提取液，分別加入到已經(jīng)封閉好的酶標(biāo)板中，每孔50 μ L，每個樣品重復(fù)3個孔，再每孔加入50 μ L I: 4000稀釋的抗吡利霉素單克隆抗體，37°C反應(yīng)半小時后，洗板拍干；(4)每孔加入100μ L用含0.01%明膠的PBS I: 3000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37°C反應(yīng)半小時后，洗板拍干；
(5)每孔加入100μ L TMB顯色液，37°C顯色15 min后，每孔加入50 μ L 2M H2SO4終止液，450 nm測吸光值；
(6)添加回收及樣品前處理:稱取0.5 g奶粉樣品置入15mL聚四氟乙烯離心管中，分別添加150ng、300 ng及600 ng PIR0加提取液(1000mL 0.2M磷酸氫二鈉和625mL 0.1M檸檬酸混合)10mT,,振蕩5min, 5000r/min離心10min,取上清3mL加NaOH 330 μ L調(diào)pH至7左右后待測。用樣品稀釋液(0.01M PBS)稀釋3倍后，作為ELISA樣品提取液，采用間接競爭ELISA進(jìn)行添加回收試驗，其回收率分別為90%，82%，71%。
[0025]溶液的配置:
碳酸鹽緩沖液(CBS):稱取Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800mL混勻，調(diào)pH值至9.6，加雙蒸水定容至lOOOmL，4°C貯存?zhèn)溆茫?br> 磷酸鹽緩沖液(PBS):8.00 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.2 g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO4.12 H2O,溶于800 mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7.2~7.4，定容至1000 mL ；
PBST:含 0.05% 吐溫-20 的 PBS ；
TMB 顯色液:A 液=Na2HPO4.Iffi2O 18.43g，檸檬酸 9.33g，純水定容至 1000 mL ；B 液:60mg TMB溶于100 mL乙二醇中。A、B液按1: 5混合即為TMB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。
[0026]綜上所述僅為本 發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。
【權(quán)利要求】
1.一株抗吡利霉素通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其分類命名為單克隆細(xì)胞株B號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9302。
2.權(quán)利要求1所述菌株單克隆細(xì)胞株B號分泌產(chǎn)生的抗吡利霉素單克隆抗體，其特征在于:其由抗吡利霉素通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株B號所分泌產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述抗吡利霉素單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于:將抗吡利霉素單克隆抗體進(jìn)行純化，建立間接競爭ELISA，采用CDI法將吡利霉素和蛋白偶聯(lián)合成包被抗原，應(yīng)用于吡利霉素的 檢測。
【文檔編號】C12R1/91GK104004718SQ201410260782
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】胥傳來, 曹珊珊, 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:無錫杰圣杰康生物科技有限公司, 江南大學(xué)