一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明制備半抗原，將半抗原通過戊二醛法偶聯(lián)蛋白，得到鄰苯二甲酸二丁酯完全抗原，與弗氏佐劑混合均勻后，通過皮下注射免疫BALB/c小鼠；用重氮化法合成包被抗原用于小鼠血清和細(xì)胞上清的篩選。將免疫小鼠的脾細(xì)胞通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選和三次亞克隆，得到一株群選性的雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株C。本發(fā)明提供的單克隆細(xì)胞株C對(duì)DEHP、DINP也具有一定的識(shí)別能力，可以滿足目前市場(chǎng)上對(duì)鄰苯二甲酸酯類塑化劑免疫檢測(cè)產(chǎn)品的需求。
【專利說明】一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，涉及鄰苯二甲酸酯類塑化劑通用單克隆抗體的制備方法，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]塑化劑(Plasticizer),是一種增加材料的柔軟性或是材料液化的添加劑。其中最常見的塑化劑是鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)(Phthalate Esters, PAEs),是鄰苯二甲酸的酯化衍生物。
[0003]鄰苯二甲酸酯類塑化劑是具些許芳香氣味或無氣味的無色液體，中等黏度、高穩(wěn)定性、低揮發(fā)性、成本低廉、低水溶解度，但易溶于多數(shù)有機(jī)溶劑中。鄰苯二甲酸酯類在日常及工業(yè)上被廣泛使用，以鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)為最大宗，占塑化劑產(chǎn)量的四分之三，其次是鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)。鄰苯二甲酸酯類塑化劑被歸類為疑似環(huán)境荷爾蒙，其生物毒性主要屬雌激素與抗雄激素活性，會(huì)造成內(nèi)分泌失調(diào)，阻害生物體生殖機(jī)能，包括生殖率降低、流產(chǎn)、天生缺陷、異常的精子數(shù)、睪丸損害，還會(huì)引發(fā)惡性腫瘤、造成畸形兒。
[0004]近年來，酒、飲料、食用油以及方便食品中鄰苯二甲酸酯類塑化劑超標(biāo)事件頻發(fā)，人們談“塑”色變，使得鄰 苯二甲酸酯的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)成為迫切需求。
[0005]目前檢測(cè)PAEs的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS)等儀器檢測(cè)方法，而免疫分析方法相對(duì)較少。其中儀器檢測(cè)方法檢測(cè)準(zhǔn)確，但儀器昂貴，操作復(fù)雜，樣品前處理繁瑣。免疫分析方法相對(duì)于儀器檢測(cè)方法，具有低成本、高通量、高靈敏、對(duì)技術(shù)人員要求低等特點(diǎn)，因此適用于大量樣品的快速篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種鄰苯二甲酸酯類塑化劑通用性單克隆抗體的制備方法，通過細(xì)胞株的篩選，得到的抗體對(duì)鄰苯二甲酸酯類DBP、DIBP、BBP、DNP等具有較好檢測(cè)靈敏度，可以用來建立鄰苯二甲酸酯類總量的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其分類命名為單克隆細(xì)胞株C號(hào)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9303。
[0008]菌株單克隆細(xì)胞株C號(hào)分泌產(chǎn)生的鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體，其由鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株C號(hào)所分泌產(chǎn)生。所述鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體應(yīng)用于鄰苯二甲酸酯類的多殘免疫檢測(cè)。
[0009]提供的鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體的制備方法基本步驟為:
(O半抗原的制備:
a、酯化反應(yīng):稱取0.12mol的4-硝基鄰苯二甲酸于IOOmL三頸燒瓶，加入0.1mol正丁醇，加入6mL苯助溶，磁力攪拌，緩慢加入1.6mL濃硫酸，加熱升溫至120°C，反應(yīng)12h，減壓蒸去有機(jī)溶劑，將油狀殘留加入到冷水中并用10%的Na2CO3溶液洗至下層水層無色，上層得到暗紅色的油狀粗品，用無水乙醇重結(jié)晶得到4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯。
[0010]b、還原反應(yīng):稱取7mmol的還原鐵粉于50mL圓底燒瓶,加入2mL水、Immol氯化銨，水浴加熱15min。另取4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯1.4mmol,用5mL甲醇溶解,分3次加入上述反應(yīng)液中，回流反應(yīng)5h。趁熱過濾鐵粉，將濾液減壓蒸餾，得到的橙紅色殘留用少量熱甲醇溶解，低溫析出1.17mmol 4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯作為半抗原備用。
[0011](2)完全抗原的制備:采用戊二醛法合成免疫原，重氮化法合成包被原。
[0012]免疫原合成的具體步驟如下:將5mg半抗原用DMF溶解，與戊二醛溶液以1:1.2的摩爾比混合，室溫下活化30min后,將活化液逐滴加入IOmg KLH中，室溫反應(yīng)3_4h,用
0.1mol PBS透析5天即可；
包被原合成的具體步驟如下:A液制備:取0.023mmol半抗原于25mL燒杯中，加入2mLDMF,0.2mL水和0.2mL的lmol/L鹽酸，形成黃色溶液，冷至0_5°C。然后逐滴滴加lmol/L亞硝酸鈉溶液，用淀粉碘化鉀試紙監(jiān)測(cè)，直到試紙變藍(lán)灰色停止滴加，4°C下攪拌lh。B液制備:稱取150mg的OVA溶于6mL pH 9.0硼酸鹽緩沖液，4°C保存。在4°C攪拌下，將A液逐滴滴加到B液中，并用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使pH保持在9，4°C攪拌過夜，透析即得到包被原(DBP-OVA)。
[0013](3)動(dòng)物免疫與效價(jià)測(cè)定:采用小劑量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠，首次免疫用IOOyg偶聯(lián)抗原 與等量福氏完全佐劑混勻后進(jìn)行皮下注射，間隔3周后，再用IOOyg偶聯(lián)抗原與等量福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，此后每隔3周用半量偶聯(lián)抗原加強(qiáng)免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后采用腹腔免疫，通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)血清效價(jià)和抑制；
其具體ELISA程序如下:
1)包被:將包被抗原用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，100 μ L/孔，37 °C孵育
2h ；
2)洗滌:將板內(nèi)溶液傾去,每孔注入200μ L PBST溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗滌3次。以下洗滌方法相同；
3)封閉:拍干后，加入200yL/孔封閉液，37°C孵育2h。洗滌后烘干備用；
4)加樣:酶標(biāo)板上半部分加入PBS，50μ L/孔(上半部分稱為O標(biāo))，下半部分加入不同濃度的鄰苯二甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品，將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，50 μ L/孔(下半部分成為加標(biāo))，上下部分對(duì)應(yīng)加入不同稀釋梯度包被抗原的孔中，37°C孵育30min ;充分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，100 μ L/孔，37°C孵育30min，洗滌后拍干；
5)顯色:將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μ L的顯色液(TMB與底物液比例1:5)，37°C避光反應(yīng) 15min ；
6)終止和測(cè)定:取出酶標(biāo)板,每孔加入50μ L終止液(2mol/L的硫酸)終止反應(yīng),然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值A(chǔ)45tl ；
7)結(jié)果判讀:以O(shè)D值大于或等于陰性血清對(duì)照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所對(duì)應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價(jià)。上下部分對(duì)照，加標(biāo)OD值為O標(biāo)一半的，即是所加的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。[0014](4)細(xì)胞融合與篩選:在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為1450)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下:
a、無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
b、收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
C、將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照數(shù)量比1: 10的比例混合，離心后用50% PEG融合，時(shí)間I min，之后按照從慢到快，加入RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50XHAT的RPM1-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合的第三天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行RPM1-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天進(jìn)行用含20%胎牛血清、 1%的100 XHT的RPM1-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第9天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。
[0015]篩選分三步:第一步先用間接ELISA篩選出陽性細(xì)胞孔。第二步選用DBP、BBP、DIBP及DNP為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。第三步將第二步篩選出的孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，加入其它鄰苯二甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)一步進(jìn)行篩選，選擇對(duì)多種標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，即可得到能穩(wěn)定分泌鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體的細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株C號(hào)。
[0016](5)單克隆抗體的制備與鑒定:取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油I mL ;7天后每只小鼠腹腔注射I X IO6單克隆細(xì)胞株C號(hào)細(xì)胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20°C保存。
[0017]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明通過衍生得到半抗原4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯，再用戊二醛法合成完全抗原DBP-KLH，免疫BALB/c小鼠，用重氮化法合成包被原用于小鼠血清以及獲得了對(duì)DBP、DIBP, BBP, DNP等均具有較好親和力和檢測(cè)靈敏度的單克隆抗體；該單克隆抗體使得鄰苯二甲酸酯類的多殘免疫檢測(cè)方法成為了可能。
[0018]生物材料樣品保藏:上述小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株C號(hào)，已于2014年5月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCJi址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCN0.9303。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1該單克隆抗體對(duì)DBP、BBP, DIBP, DNP及DMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0021]本發(fā)明通過將DBP完全抗原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了對(duì)DBP、BBP, DIBP, DNP等均有較好靈敏度的通用性單克隆抗體。
[0022]實(shí)施例1鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體的制備 1、半抗原的合成
1.1酯化反應(yīng):稱取0.12mol的4-硝基鄰苯二甲酸于IOOmL三頸燒瓶，加入0.1mol正丁醇，加入6mL苯助溶,磁力攪拌,緩慢加入1.6mL濃硫酸,加熱升溫至120°C,反應(yīng)12h,減壓蒸去有機(jī)溶劑，將油狀殘留加入到冷水中并用10%的Na2CO3溶液洗至下層水層無色，上層得到暗紅色的油狀粗品，用無水乙醇重結(jié)晶得到4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯。
[0023]1.2還原反應(yīng):稱取7mmol的還原鐵粉于50mL圓底燒瓶，加入2mL水、Immol氯化銨，水浴加熱15min。另取4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯1.4mmol,用5mL甲醇溶解,分3次加入上述反應(yīng)液中，回流反應(yīng)5h。趁熱過濾鐵粉，將濾液減壓蒸餾，烘干，得到4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯作為半抗原備用。
[0024]2、完全抗原的制備
免疫原的合成:將5mg半抗原用DMF溶解，與戊二醛溶液以1:1.2的摩爾比混合，室溫下活化30min后，將活化液逐滴加入IOmg KLH中，室溫反應(yīng)3_4h，用0.1mol PBS透析5天即可；
包被原合成:
A液制備:取0.023mmol半抗原于25mL燒杯，加入2mL DMF,0.2mL水和0.2mL的lmol/L鹽酸，形成黃色溶液，冷至0_5°C。然后逐滴滴加lmol/L亞硝酸鈉溶液，用淀粉碘化鉀試紙監(jiān)測(cè)，直到試紙變藍(lán)灰色停止滴加，4°C下攪拌lh。
[0025]B液制備:稱取150mg的OVA溶于6mL pH9.0硼酸鹽緩沖液，4°C保存。在4°C攪拌下，將A液逐滴滴加到B液中，并用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使pH保持在9，4°C攪拌過夜，透析即得到包被原(DBP-0VA)。
[0026]3、動(dòng)物免疫:選擇健康的6~8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。取DBP完全抗原與等體積弗氏完全佐劑混合均勻后，通過皮下注射免疫BALB/c小鼠，每只IOOyg ;每間隔21天，采用DBP完全抗原與等體積弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，三免后7-10天采血，使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定小鼠血清效價(jià)和抑制，選擇抑制最好的小鼠，在四免后21天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)血清效價(jià)和抑制；
其具體ELISA程序如下:
1)包被:將包被抗原用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，100 μ L/孔，37 °C孵育
2h ；
2)洗滌:將板內(nèi)溶液傾去,每孔注入200μ L PBST溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗洗滌3次。以下洗滌方法相同；
3)封閉:拍干后，加入200yL/孔封閉液，37°C孵育2h。洗滌后烘干備用；
4)加樣:酶標(biāo)板上半部分加入PBS，50μ L/孔(上半部分稱為O標(biāo))，下半部分加入不同濃度的鄰苯二甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品，將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，50 μ L/孔(下半部分成為加標(biāo))，上下部分對(duì)應(yīng)加入不同稀釋梯度包被抗原的孔中，37°C孵育30min ;充分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，100 μ L/孔，37°C孵育30min，洗滌后拍干；
5)顯色:將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入IOOyL的顯色液(TMB與底物液比例1: 5)，37°C避光反應(yīng) 15min ;
6)終止和測(cè)定: 取出酶標(biāo)板,每孔加入50μ L終止液(2mol/L的硫酸)終止反應(yīng),然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值OD45tlt5
[0027]7)結(jié)果判讀:以O(shè)D45tl值大于或等于陰性血清對(duì)照孔的2.1倍卿P/N≥2.1)所對(duì)應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價(jià)。上下部分對(duì)照，加標(biāo)OD值為O標(biāo)一半的，即是所加的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。
[0028]4、細(xì)胞融合:在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為1450)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下:
(1)無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
(2)收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
(3)將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照數(shù)量比1: 10的比例混合，離心后用50% PEG融合，時(shí)間I min，之后按照從慢到快，加入RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50XHAT的RPM1-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0029]5、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立:在細(xì)胞融合的第三天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行RPM1-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天進(jìn)行用含20%胎牛血清、1%的100 XHT的RPM1-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第9天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選分三步:第一步先用間接ELISA篩選出陽性細(xì)胞孔。第二步選用DBP、BBP、DIBP和DNP為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。第三步將第二步篩選出的孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，加入其它鄰苯二甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)一步進(jìn)行篩選，選擇對(duì)多種標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，即可得到能穩(wěn)定分泌鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體的細(xì)胞株。
[0030]6、單克隆抗體的制備與鑒定:取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油I mL ；7天后每只小鼠腹腔注射IX IO6單克隆細(xì)胞株C號(hào)細(xì)胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20°C保存。
[0031]使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和間接ELISA，測(cè)定單克隆抗體對(duì)DBP、DIBP、BBP、DNP、DMP的IC50 分別為:10.5ng/mL、15ng/mL、15.5ng/mL、42.5ng/mL、64.3ng/mL ;此外該細(xì)胞株 C 號(hào)對(duì)DEHP, DINP也具有一定的識(shí)別能力，可以滿足目前市場(chǎng)上對(duì)鄰苯二甲酸酯類塑化劑免疫檢測(cè)產(chǎn)品的需求。
[0032]該單克隆抗體對(duì)BBP、DIBP、DNP、DMP、DEHP及DINP的IC5tl和交叉反應(yīng)率如表1所示。
[0033]表1
【權(quán)利要求】
1.一株鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其分類命名為單克隆細(xì)胞株C號(hào)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCN0.9303。
2.權(quán)利要求1所述菌株單克隆細(xì)胞株C號(hào)分泌產(chǎn)生的鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體，其特征在于:其由鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株單克隆細(xì)胞株C號(hào)所分泌產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述鄰苯二甲酸酯類通用性單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于:所述鄰苯二甲酸酯類通用性 單克隆抗體應(yīng)用于鄰苯二甲酸酯類的多殘免疫檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104004719SQ201410260785
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】匡華, 胥傳來, 郭玲玲, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請(qǐng)人:無錫杰圣杰康生物科技有限公司, 江南大學(xué)