一種用于在米曲霉細(xì)胞分泌表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其米曲霉基因工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于在米曲霉細(xì)胞分泌表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其米曲霉基因工程菌，該表達(dá)設(shè)備從5’至3’依次包括：(1)控制外源基因在米曲霉中轉(zhuǎn)錄的啟動子；(2)控制外源蛋白在米曲霉中分泌表達(dá)的信號肽的編碼序列；(3)用于外源蛋白親和純化的標(biāo)簽的編碼序列；(4)多克隆位點；(5)控制外源基因在米曲霉中終止轉(zhuǎn)錄的終止子；(6)用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的米曲霉乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)盒，其編碼序列如SEQ?ID?No:2所示。該表達(dá)設(shè)備利用營養(yǎng)缺陷型基因篩選標(biāo)記，提高轉(zhuǎn)化陽性率，縮短操作時間和工作量，適合大多數(shù)外源基因的分泌表達(dá)；該米曲霉基因工程菌可高效表達(dá)酸性、中性淀粉酶，在造紙業(yè)和紡織業(yè)具有重要應(yīng)用。
【專利說明】一種用于在米曲霉細(xì)胞分泌表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其米曲霉基因工程菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地涉及一種用于在米曲霉細(xì)胞分泌表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其米曲霉基因工程菌。
【背景技術(shù)】
[0002]米曲霉(Aspergillus oryzae)是發(fā)酵工業(yè)常用的菌株,是一種好氣性真菌,屬于半知菌亞門、曲霉屬。菌絲一般呈黃綠色，后為黃褐色；米曲霉菌絲由多細(xì)胞組成，是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除蛋白酶外，還可用 來分泌淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、糖苷酶、脂酶、肽酶和植酸酶等；其中，工業(yè)上常見的高峰淀粉酶(TAA)即源于米曲霉的α-淀粉酶。米曲霉是被FDA認(rèn)定的安全微生物(GRAS)，廣泛應(yīng)用于釀造業(yè)、調(diào)味品、飼料制造業(yè)、紡織、造紙、制漿等工業(yè)領(lǐng)域，并已被安全使用1000多年。目前，米曲霉RIB40已全基因測序，基于米曲霉的絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)也越來越受到廣泛關(guān)注。
[0003]除具有極好的合成和分泌蛋白的能力以外，A.0ryzae還具有真核微生物的蛋白分泌機(jī)制和與哺乳動物系統(tǒng)相似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾、加工性能；其表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系統(tǒng)相比具有很大的優(yōu)勢，比如外源蛋白表達(dá)后的蛋白修飾、內(nèi)含子識別、信號肽剪除和肽鏈的正確折疊及蛋白分泌。由于其適于蛋白生產(chǎn)的諸多優(yōu)點，而且對人類沒有毒性，米曲霉也已成為相關(guān)研究人員開展真菌細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)和生理生化研究的重要生物材料。日本資助支持了米曲霉基因組的測序工作，目前全基因組序列已經(jīng)完成并公布。米曲霉全基因組測序的完成為利用功能基因組學(xué)方法研究具有重要生物學(xué)意義的功能基因奠定了基石出(Machida M et al.Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae.Nature, 2005，438:1157-1161)。
[0004]自上世紀(jì)80年代以來，絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)被相繼報道，同源蛋白的高產(chǎn)量表達(dá)已經(jīng)證明，但是在相同條件下外源蛋白的表達(dá)大多數(shù)依然處于~mg/1，且由于絲狀真菌不存在天然質(zhì)粒，基因組數(shù)據(jù)較大，分泌表達(dá)過程復(fù)雜，造成目前尚未有如同大腸桿菌和畢赤酵母一樣工業(yè)化生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)(包括表達(dá)宿主和表達(dá)質(zhì)粒)。通過篩選米曲霉相關(guān)營養(yǎng)缺陷型，構(gòu)建相應(yīng)的回補表達(dá)載體，通過強(qiáng)啟動子、融合表達(dá)等手段實現(xiàn)來源于真菌和動植物基因的異源表達(dá)已有相關(guān)報道(Minetoki T et al.1mprovement of promoter activity bythe introduction of multiple copies of the conserved region III sequence, involvedin the efficient expression of Aspergillus oryzae amylase-encoding gene.ApplMicrobilo Biotechnolj 1998, 50(4):459 ~467.Shiba Y et al.High level secretoryproduction of phospholipase Alby Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus oryzae.Biosci Biotechnol Biochemj 2001, 65 (I):94 ~101)。1997 年，Randy Μ.Berka 等在米曲霉pyrG影響缺陷型系統(tǒng)中通過以PamyB和TamyB的控制嗜溫真菌Myceliophthorathermophila漆酶基因的異源表達(dá)，但表達(dá)量僅為~10mg/l (Novo N Biotec.Characterization of the gene encoding an extracellular laccase of Myceliophthorathermophile and analysis of the recombinant enzyme expressed in Aspergillus oryzae.Appl Environ Microbiol, 1997，63 (8): 3151-3157) ;2011 年Nobuo Yamashita等在米曲霉中以sC為篩選標(biāo)記,將來自于煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的蛋白酶抑制劑基因置于米曲霉TAA啟動子和終止子之間,通過誘導(dǎo)培養(yǎng)后實現(xiàn)該基因的異源表達(dá)(Nobuo Yamashitaet al.High-yields heterologous production of the novel Aspergillus fumigatuselastase inhibitor AFUEI in Aspergillus oryzae, J biosci bioeng，2011，112 (2): 114 ~117)。盡管如此，迄今為止尚未有關(guān)于這些營養(yǎng)缺陷型系統(tǒng)相應(yīng)的通用的可更換元件的可純化的通用表達(dá)載體的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于在米曲霉細(xì)胞分泌表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備及其米曲霉基因工程菌，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中米曲霉絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)對外源蛋白表達(dá)量低以及分離純化困難的缺陷。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]本發(fā)明的第一方面是提供一種用于在米曲霉細(xì)胞分泌表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備，所述表達(dá)設(shè)備從5’至3’依次包括以下元件:(I)控制外源基因在米曲霉中轉(zhuǎn)錄的啟動子；
(2)控制外源蛋白在米曲霉中分泌表達(dá)的信號肽的編碼序列；(3)用于外源蛋白親和純化的標(biāo)簽的編碼序列；(4)多克隆位點；(5)控制外源基因在米曲霉中終止轉(zhuǎn)錄的終止子；(6)用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的米曲霉乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒的編碼序列如SEQ ID: 2所示。
[0008]本發(fā)明中，所述的啟動子是能夠控制外源基因在米曲霉中轉(zhuǎn)錄的啟動子，較佳的為米曲霉α-淀粉酶啟動子(PamyB)，更佳的啟動子的序列是SEQ ID NO:1的第7位至第623位所示。
[0009]本發(fā)明中，所述的信號肽可以是本領(lǐng)域中能夠控制外源蛋白在米曲霉中分泌表達(dá)的任何信號肽(分泌肽)，較佳的信號肽的編碼序列為SEQ ID NO:1的第624位至第695位所示。
[0010]本發(fā)明中，所述用于外源蛋白親和純化的標(biāo)簽可以是本領(lǐng)域中能夠用于親和純化蛋白的任何標(biāo)簽，較佳的為His-Tag標(biāo)簽，更佳的標(biāo)簽的編碼序列如SEQ ID NO:1所示序列的第696位至第713位。
[0011]本發(fā)明中，所述多克隆位點可以是本領(lǐng)域各種常規(guī)的多克隆位點，優(yōu)選地，所述多克隆位點的編碼序列如SEQ ID NO:1所示序列的第714位至第784位。
[0012]本發(fā)明中，所述終止子是能夠控制外源基因在米曲霉中終止轉(zhuǎn)錄的終止子，較佳的是米曲霉α -淀粉酶終止子(TamyB)，更佳的終止子的序列是SEQ ID NO:1的第785位至第1681位所示。
[0013]最優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的表達(dá)設(shè)備中，所述米曲霉α-淀粉酶啟動子的編碼序列如SEQ ID NO:1 所示序列的第7位至第623位；所述信號肽的編碼序列如SEQ ID NO:1所示序列的第624位至第695位；所述用于外源蛋白親和純化的His-Tag標(biāo)簽的編碼序列如SEQ ID NO:1所示序列的第696位至第713位；所述多克隆位點的編碼序列如SEQ ID NO:1所示序列的第714位至第784位；所述米曲霉α -淀粉酶終止子的編碼序列如SEQ ID NO:1所示序列的第785位至第1681位。
[0014]優(yōu)選地，所述表達(dá)設(shè)備進(jìn)一步包括外源蛋白的編碼序列，所述外源蛋白的編碼序列位于多克隆位點之中、之前或之后。
[0015]本發(fā)明的第二方面還提供一種包括如上所述的表達(dá)設(shè)備的重組表達(dá)載體。
[0016]優(yōu)選地，載體質(zhì)粒是絲狀真菌表達(dá)載體，如pBC-Hygro、pBARGPEl、pAN7_l、pRTR1、pBC-phleo,但不限于這些載體,更佳的選自pBC-Hygro。
[0017]本發(fā)明的第三方面還提供一種表達(dá)外源蛋白的米曲霉基因工程菌，所述米曲霉基因工程菌的基因組中含有如上所述的表達(dá)設(shè)備。
[0018]所述米曲霉基因工程菌的宿主菌較佳的是米曲霉RIB40、3.042、AS3.863、AS3.951、HBR9、RIB326等，更佳地是米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株RIB40-PF1。本發(fā)明所使用的菌株RIB40-PF1為發(fā)明人自己篩選獲得，該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，位于中國北京)，保藏號為CGMCC NO:9129，保藏日為2014.05.08。
[0019]本發(fā)明的第四方面還提供一種如上所述的表達(dá)外源蛋白的米曲霉基因工程菌的制備方法，包括:將含有如上所述的表達(dá)設(shè)備的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株RIB40-PF1，挑選陽性克隆，制得所述表達(dá)外源蛋白的米曲霉基因工程菌。
[0020]本發(fā)明的第五方面還提供一種生產(chǎn)蛋白的方法，包括培養(yǎng)所述表達(dá)外源蛋白的米曲霉基因工程菌，從培養(yǎng)物中獲得該外源蛋白。 [0021]本發(fā)明的第六方面還提供一種如上所述的表達(dá)外源蛋白的米曲霉基因工程菌在制備工業(yè)酶制劑、飼料添加劑或蛋白質(zhì)藥物中的應(yīng)用。所述酶制劑為α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、β -葡萄糖苷酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、普魯蘭酶、、植酸酶、月旨肪酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶、纖維二糖酶等。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0023]1、本發(fā)明的表達(dá)設(shè)備在一環(huán)化質(zhì)粒上，易于保存和DNA操作。
[0024]2、本發(fā)明的表達(dá)設(shè)備首次利用米曲霉乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記，可提高轉(zhuǎn)化陽性率，縮短操作時間和工作量。
[0025]3、本發(fā)明的表達(dá)設(shè)備具有優(yōu)化的分泌表達(dá)能力，適合大多數(shù)外源基因的分泌表達(dá)。
[0026]4、本發(fā)明的表達(dá)設(shè)備的多克隆位點中含有稀有接口和平末端接口，兼容絕大多數(shù)外源基因的連接，節(jié)約操作時間提高工作效率。
[0027]5、本發(fā)明的表達(dá)設(shè)備可實現(xiàn)來源于動物、植物和真菌的外源蛋白質(zhì)基因在絲狀多細(xì)胞真核微生物米曲霉中的高效分泌表達(dá)。由于米曲霉培養(yǎng)條件粗放，適用于固體培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵；米曲霉本身沒有毒性，在產(chǎn)酶條件下不會產(chǎn)生真菌毒素和抗生素，符合國際食品安全認(rèn)證；米曲霉產(chǎn)生的胞外蛋白質(zhì)易于分離純化，成本低廉。因此本發(fā)明可以為洗滌、紡織、飼料、食品、造紙、醫(yī)藥等酶制劑行業(yè)提供基因工程生產(chǎn)菌株，提高酶制劑的生產(chǎn)效率降低生產(chǎn)成本。
[0028]6、本發(fā)明的表達(dá)設(shè)備(包括啟動子終止子)變短，最終構(gòu)建的表達(dá)盒較小，更利于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的連接操作和轉(zhuǎn)化效率的提高。表達(dá)量更加平穩(wěn)，不會受培養(yǎng)條件影響而有較大的波動。如果表達(dá)盒依賴于培養(yǎng)條件的波動較大，則對操作人員要求較高。本發(fā)明的表達(dá)設(shè)備的表達(dá)，菌體培養(yǎng)基的條件可以更加粗獷、低廉。菌體生長較快，減少時間就是降低成本。本發(fā)明表達(dá)盒可以和其他表達(dá)盒組合使用，同時表達(dá)兩個外源蛋白質(zhì)。
[0029]7、本發(fā)明的米曲霉基因工程菌首次采用篩選獲得的米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株RIB40-PF1，并結(jié)合米曲霉乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記，可高效表達(dá)酸性、中性淀粉酶，在淀粉工業(yè)、造紙業(yè)和紡織業(yè)具有很重要的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為米曲霉表達(dá)設(shè)備pBC12FA2的物理圖譜及其構(gòu)建過程。各酶切位點如圖所示，其中，PamyB: α -淀粉酶(TAA)啟動子；TamyB: α -淀粉酶(TAA)終止子；pyrF:米曲霉乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(ORPTase)基因篩選標(biāo)記；
[0031]圖2為米曲霉通用表達(dá)載體PBC2FNH構(gòu)建圖；
[0032]圖3為綠色熒光蛋白在米曲霉中的表達(dá)，其中，A:轉(zhuǎn)化子PFl-pBC12FNHEGFP-6誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌絲在綠色熒光光源(左)和普通光源(右)下的觀察結(jié)果；B:野生菌RIB40誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌絲在綠色熒光光源(左)和普通光源(右)下的觀察結(jié)果。
【具體實施方式】
[0033]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0034]本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。 [0035]一、表達(dá)設(shè)備
[0036]本發(fā)明提供了一種用于在米曲霉細(xì)胞分泌表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備。其中，米曲霉α-淀粉酶啟動子在該基因的5’端，約由617個核苷酸組成；米曲霉α-淀粉酶終止子在該基因的3’端，約由897個核苷酸組成；在該米曲霉α -淀粉酶啟動子后還連接著一段信號肽序列，編碼21個氨基酸序列的分泌肽。本發(fā)明取該米曲霉α -淀粉酶的啟動子、信號肽和終止子，并在信號肽后加入用于表達(dá)蛋白親和純化標(biāo)簽和多克隆位點，從而便于外源基因順利嵌入得以表達(dá)，并在終止子后連接上用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的米曲霉乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因編碼序列，最終構(gòu)成結(jié)構(gòu)為啟動子-信號肽-純化標(biāo)簽-MCS-終止子-篩選標(biāo)記的表達(dá)設(shè)備。該表達(dá)設(shè)備能夠在米曲霉中分泌表達(dá)各種外源蛋白，表達(dá)量高，易于分離純化，且成本低廉。
[0037]本發(fā)明的表達(dá)設(shè)備的制備方法如下:
[0038](I)通過PCR擴(kuò)增，分別得到包含分泌肽序列的米曲霉α-淀粉酶的啟動子(PamyB+signal peptide、PaS)、某外源淀粉酶基因(GpA2)，米曲霉α-淀粉酶終止子(TamyB)、乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因篩選標(biāo)記表達(dá)盒各自DNA序列。
[0039](2)將啟動子與信號肽序列(PaS)和淀粉酶基因(GpA2)進(jìn)行融合PCR得到的融合序列(PaSA2)，將終止子(TamyB)、乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因篩選標(biāo)記表達(dá)盒、PaSA2依次連接到表達(dá)載體pBC-Hygro中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體1，即pBC12FA2 ;通過定點突變插入6 XHis-Tag純化標(biāo)簽，得表達(dá)載體2，即pBC12NHA2，通過反向PCR定點刪除外源基因GpA2即得到包含該表達(dá)設(shè)備不包含外源基因的通用表達(dá)載體3，即pBC12FNH。
[0040](3)將外源目的基因插入到上述表達(dá)載體3中，使外源基因位于啟動子和終止子之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒4，即pBC12FNH-EGFP。
[0041]上述步驟(1)中用于連接的多克隆位點為骨架載體pBC-Hygro自帶；將啟動子、終止子和篩選標(biāo)記連接，可用限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法將各個元件連入表達(dá)載體，所述的限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接都是本領(lǐng)域常規(guī)做法。
[0042]上述步驟(3)中，將外源基因插入到上述表達(dá)載體3中，可用限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法，所述的限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接都是本領(lǐng)域常規(guī)做法。
[0043]二、米曲霉基因工程菌
[0044]本發(fā)明還提供了一種米曲霉基因工程菌，該基因工程菌是將本發(fā)明的表達(dá)設(shè)備通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化整合到米曲霉RIB40-PF1細(xì)胞，培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化子制備而得，具體制備步驟如下:
[0045](I)將本發(fā)明的含有表達(dá)設(shè)備的載體用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到米曲霉 RIB40-PF1 細(xì)胞；
[0046](2)將上述轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞進(jìn)行篩選、鑒定，得到表達(dá)外源蛋白的米曲霉基因工程菌。
[0047]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆:實驗室手冊》(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行，或按照制造廠商所建議的條件。
[0048]實施例中用到的緩沖液和培養(yǎng)基如下:
[0049](I)TE(1000ml):
[0050]ZnSO4.7H200.35g, MnCl2.4H200.5g, H3BO30.03g, CoCl2.6H200.945g,CuCl2.2H200.01g, NiCl2.6H200.12g, NaMoO4.2H200.18g，6M HCl 13ml，加去離子水定容至500mLo
[0051](2)磷酸鈉緩沖液(100ml, ρΗ5.8):
[0052]Na2HPO4.12Η200.5788g, NaH2PO4.2Η202.8996g。
[0053](3)Tris-HCl 緩沖液(100ml, ρΗ7.5):
[0054]Tris0.6057g，用 HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7.5。
[0055](4)溶液 1:
[0056]NaCl0.7M,鹿糖1.0g,溶于50ml磷酸鈉緩沖液中，定容(加水)至100ml。
[0057](5)溶液 II:
[0058]山梨醇 22.3085g, CaC120.578g, NaCl0.2045g，溶于 20ml Tr1-HCl 緩沖液中，定容(加水)至100ml。
[0059](6)溶液 II1:
[0060]PEG400030g, CaCl20.289g,溶于 10ml Tr1-HCl 緩沖液中，定容(加水)至 5Oml。
[0061](7) CM 培養(yǎng)基(100ml):
[0062]NaNO30.6g, KC10.05g, KH2PO40.08g, K2HPO40.104g,葡萄糖 lg，MgSO40.052g,Peptone0.2g, Yeast extract0.lg,尿苷 0.1221g, TElOOul ;若配成斜面，則加入 1.5 ~2.0g
瓊脂粉。
[0063](8) MM 培養(yǎng)基(100ml):
[0064]NaNO30.6g, KC10.05g, KH2PO40.08g, K2HPO40.104g,葡萄糖 lg，MgSO40.052g,TElOOul，蔗糖 20.54g。
[0065]瓊脂粉:上層0.8g，下層1.2g。
[0066](9)發(fā)酵培養(yǎng)基(100mL):
[0067]糊精2g，蔗糖 0.3g，蛋白胨 0.lg，酵母提取物 0.5g，NaNO30.lg, MgSO4.7H200.05g,FeSO4.7Η200.00lg。
[0068]實施例1.包含本發(fā)明的米曲霉表達(dá)設(shè)備的表達(dá)載體的構(gòu)建
[0069]1.1、米曲霉基因組的提取
[0070]將米曲霉Aspergillus oryzae RIB40 (National Research Institute of BrewingStockCulture，ATCC42149)接種于CM培養(yǎng)基上，于30°C下恒溫培養(yǎng)7天至孢子成熟。制備適量孢子懸液接種于CM培養(yǎng)基液體種子培養(yǎng)基中，于30°C 200rpm條件下培養(yǎng)2天至菌絲體濃度達(dá)到4~5g/L用于提取基因組，方法參照Omega真菌基因組提取試劑盒說明書。
[0071]1.2、米曲霉α-淀粉酶啟動子(PamyB)及其信號肽序列的分離
[0072]根據(jù)GeneBank上發(fā)布的amyB啟動子的序列，以上述提取的米曲霉基因組DNA為模板，以上游引物PaXf和下游引物Pamr進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增分離PaS (PamyB+signalpeptide)。其中:
[0073]上游引物PaXf序列為:
[0074]CCGCTCGAG GAATTCATGGTGTTTTGATCATTTT，其中含有 XhoI 酶切位點(該引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，下同)；
[0075]下游引物Pamr序列為:
[0076]AGGCGCGCCGCTAGC AGGCGTTGCAGCCAAAGC，其中含有 AscI 和 NheI 酶切位點。
[0077]1.3、米曲霉α -淀粉酶終止子(TamyB)的分離
[0078]根據(jù)GeneBank上發(fā)布的TamyB終止子的序列，以上述提取的米曲霉基因組DNA為模板，以上游引物TaNf和下游引物TaNr進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增分離PaS(PamyB+signalpeptide)。其中:
[0079]上游引物TaNf序列為:
[0080]ATAAGAATGCGGCCGCGGGTGGAGAGTATATG,其中含有 NotI 酶切位點；下游引物 TaNr 序列為:
[0081 ] ATAAGAATGCGGCCGCAATTCTTGAGGACCATTAC,其中含有 NotI 酶切位點。
[0082]1.4、外源輔助淀粉酶基因的分離
[0083]以連上了 GpA2(NCBI GenBank accension number:KJ093844)的 pMD19Tsimple 為模板，使用引物12A2mf和12A2Hr經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了 GpA2基因。其中
[0084]上游引物12A2mf序列為:
[0085]GCCTGCTAGCGGCGCGCC T AAAACCGCCGCGGAATGG，其中含有 AscI 和 NheI 酶切位點；
[0086]下游引物12A2Hr序列為:
[0087] CCCAAGCTT TTAAGCACATAAACTGCCCT，其中含有 HindIII 酶切位點。
[0088]1.5、米曲霉乳清苷磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶篩選標(biāo)記基因的分離
[0089]根據(jù)GeneBank上發(fā)布的米曲霉RIB40全基因組中pyrF的序列，以上述提取的米曲霉基因組DNA為模板，以上游引物FsNf和下游引物FxNr進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增分離pyrF表達(dá)盒。其中:[0090] 上游引物FsNf序列為:
[0091 ] GGAATTCCATATG TGAAAGACTGCTGCAAAGCC，其中含有 NdeI 酶切位點；
[0092]下游引物FxNr序列為:
[0093]GGAATTCCATATG AAGCAGTCGTACATACATGG，其中含有 NdeI 酶切位點。
[0094]以上所有PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件以及反應(yīng)體系參照Vazyme高保真酶試劑盒說明書,切膠純化參照Axygen試劑盒說明書。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收，連pEASY-Bluntclonning vector (Transgen, USA),菌落PCR驗證陽性克隆送測序,測序由睿迪生物測序公司完成。
[0095]1.6、PaSA2融合片段的構(gòu)建
[0096]以PCR分離純化后得到的PaS和GpA2為模板，以上游引物PaXf和下游引物12A2Hr進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，得到PaSA2片段，且引入酶切位點NheI和AscI。其反應(yīng)體系為:
【權(quán)利要求】
1.一種用于在米曲霉細(xì)胞分泌表達(dá)外源蛋白的表達(dá)設(shè)備，其特征在于，所述表達(dá)設(shè)備從5’至3’依次包括以下元件:(I)控制外源基因在米曲霉中轉(zhuǎn)錄的啟動子；(2)控制外源蛋白在米曲霉中分泌表達(dá)的信號肽的編碼序列；(3)用于外源蛋白親和純化的標(biāo)簽的編碼序列；(4)多克隆位點；(5)控制外源基因在米曲霉中終止轉(zhuǎn)錄的終止子；(6)用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的米曲霉乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)盒，所述用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的米曲霉乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)盒的編碼序列如SEQ ID:2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)設(shè)備，其特征在于，所述啟動子是米曲霉α-淀粉酶啟動子；所述用于外源蛋白親和純化的標(biāo)簽是His-Tag標(biāo)簽；所述終止子是米曲霉α-淀粉酶終止子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)設(shè)備，其特征在于，所述米曲霉α-淀粉酶啟動子的編碼序列如SEQ ID NO:1所示序列的第7位至第623位；所述信號肽的編碼序列如SEQ ID NO:1所示序列的第624位至第695位；所述用于外源蛋白親和純化的His-Tag標(biāo)簽的編碼序列如SEQ ID Ν0:1所示序列的第696位至第713位；所述多克隆位點的編碼序列如SEQ IDNOil所示序列的第714位至第784位；所述米曲霉α -淀粉酶終止子的編碼序列如SEQ ID NO:1所示序列的第785位至第1681位。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)設(shè)備，其特征在于，所述表達(dá)設(shè)備進(jìn)一步包括外源蛋白的編碼序列，所述外源蛋白的編碼序列位于多克隆位點之中、之前或之后。
5.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的表達(dá)設(shè)備的重組表達(dá)載體。
6.一種表達(dá)外源蛋白的米曲霉基因工程菌，其特征在于，所述米曲霉基因工程菌的基因組中含有根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的表達(dá)設(shè)備。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的米曲霉基因工程菌，其特征在于，所述米曲霉基因工程菌的宿主菌是米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株RIB40-PF1 (CGMCC NO:9129)。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)外源蛋白的米曲霉基因工程菌的制備方法，其特征在于，包括:將含有根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的表達(dá)設(shè)備的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化米曲霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株RIB40-PF1，挑選陽性克隆，制得所述表達(dá)外源蛋白的米曲霉基因工程菌。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)外源蛋白的米曲霉基因工程菌在制備工業(yè)酶制劑、飼料添加劑或蛋白質(zhì)藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/15GK104004760SQ201410260946
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】魏東芝, 高蓓, 毛佑志 申請人:華東理工大學(xué)