一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法，步驟如下：將表面羧基化的超順磁性納米粒子溶解于去離子水中，制成濃度為5～80mg/mL的磁流體溶液；將6mL～80mL表面羧基化的超順磁性納米粒子溶液，加入1L發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中；然后，加入濃度為1mol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH為2～6；最后將其置于400高斯～4000高斯磁場(chǎng)中，3～5分鐘后收集磁分離的細(xì)胞。本發(fā)明方法過(guò)程簡(jiǎn)單、耗能小、耗時(shí)短、設(shè)備簡(jiǎn)單、可連續(xù)操作、對(duì)分離的細(xì)胞活性影響較小，在生物催化、細(xì)胞固定化等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 細(xì)胞分離是發(fā)酵、生物催化轉(zhuǎn)化、細(xì)胞固定化等過(guò)程中經(jīng)常需要進(jìn)行的單元操作， 快速連續(xù)的細(xì)胞分離方法具有重要的意義。目前，實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)中多采用離心、沉淀或過(guò)濾 的方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞從液體中的分離，操作過(guò)程難以在封閉體系中連續(xù)操作，再分離大量細(xì)胞 時(shí)需要耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)胞活性損失較大。本研究提供一種簡(jiǎn)便快速的方法，從溶液中分離 細(xì)胞。
[0003] 磁性納米粒子粒徑小，比表面積大，具有較大的吸附量；粒徑均一，物理化學(xué)性質(zhì) 穩(wěn)定，不會(huì)因?yàn)橥ㄍ感詥?wèn)題對(duì)底物和產(chǎn)物產(chǎn)生的擴(kuò)散較大的影響；磁相響應(yīng)性強(qiáng)，通過(guò)磁力 可控制其在處理場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)；在外加磁場(chǎng)的作用下便于細(xì)胞與底物及產(chǎn)物的分離。本研究 將其用于細(xì)胞修飾，使普通細(xì)胞變成具磁響應(yīng)特性的細(xì)胞，進(jìn)而在外磁場(chǎng)作用下，細(xì)胞迅速 從溶液中分離出來(lái)。
[0004] 磁性納米粒子具有的特殊性能使其廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、生物工程級(jí)環(huán)境保護(hù) 等；在生物分離領(lǐng)域，較之傳統(tǒng)的離心法或過(guò)濾法，磁性載體分離技術(shù)耗能小、耗時(shí)短、設(shè)備 簡(jiǎn)單、對(duì)分離目標(biāo)活性影響較小。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題，在于提供一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的 方法，該方法過(guò)程簡(jiǎn)單、耗能小、耗時(shí)短、設(shè)備簡(jiǎn)單、可連續(xù)操作、對(duì)分離的細(xì)胞活性影響較 小，在生物催化、細(xì)胞固定化等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)問(wèn)題的：
[0007] -種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法，所述方法步驟如下：
[0008] 步驟1、將表面羧基化的超順磁性納米粒子溶解于去離子水中，制成濃度為5? 80mg/mL的磁流體溶液；
[0009] 步驟2、將6mL?80mL步驟1制得的表面羧基化的超順磁性納米粒子溶液，加入 1L發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中；
[0010] 步驟3、再向步驟2所得溶液中加入濃度為lmol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液，調(diào) 節(jié)其pH為2?6 ;
[0011] 步驟4、將步驟3所得的發(fā)酵液或細(xì)胞懸液置于400高斯?4000高斯磁場(chǎng)中，3? 5分鐘后收集磁分離的細(xì)胞。
[0012] 進(jìn)一步地，所述步驟1中表面羧基化的超順磁性納米粒子制備方法如下：
[0013] 將8. lg的FeCl3 · 6H20溶于142. 5mL去離子水，攪拌加熱至70°C ;將4. 4g的 FeCl2 · 4H20溶于10mL去離子水，過(guò)濾；將兩種溶液混合后劇烈攪拌，快速加入18ml濃氨 水，之后逐滴加入4. 66g油酸，繼續(xù)在70°C的溫度下快速攪拌1小時(shí)；制得的溶液用酒精沉 淀、洗滌2?3次，再用去離子水洗滌至中性，然后加入160ml的濃度為lOmg/mL ΚΜη04溶 液，超聲波清洗儀超聲振蕩8h，最后將制得的溶液用去離子水洗滌2?3次，冷凍干燥后得 表面羧基化的超順磁性納米粒子。
[0014] 進(jìn)一步地，所述步驟2中的發(fā)酵液或細(xì)胞懸液為單細(xì)胞懸液。
[0015] 進(jìn)一步地，所述步驟2中的發(fā)酵液或細(xì)胞懸液為乳酸菌細(xì)胞懸液、大腸桿菌細(xì)胞 懸液或酵母細(xì)胞懸液。
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟4中的所述磁場(chǎng)可為永磁場(chǎng)或電磁場(chǎng)。
[0017] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 1、本發(fā)明可在數(shù)分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞從溶液中的快速分離，克服了傳統(tǒng)生物分離方法 分離大量細(xì)胞時(shí)耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、細(xì)胞活性損失大的缺陷。
[0019] 2、本發(fā)明提供得分離細(xì)胞的方法，該法操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、對(duì)細(xì)胞活性影響較 小，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的連續(xù)分離和快速重復(fù)利用。
[0020] 總之，本發(fā)明方法過(guò)程簡(jiǎn)單、耗能小、耗時(shí)短、設(shè)備簡(jiǎn)單、可連續(xù)操作、對(duì)分離的細(xì) 胞活性影響較小，在生物催化、細(xì)胞固定化等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。 【【具體實(shí)施方式】】
[0021] 本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法，所述方法步驟如 下：
[0022] 步驟1、將表面羧基化的超順磁性納米粒子溶解于去離子水中，制成濃度為5? 80mg/mL的磁流體溶液；
[0023] 步驟2、將6mL?80mL步驟1制得的表面羧基化的超順磁性納米粒子溶液，加入 1L發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中；
[0024] 步驟3、再向步驟2所得溶液中加入濃度為lmol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液，調(diào) 節(jié)其pH為2?6 ;
[0025] 步驟4、將步驟3所得的發(fā)酵液或細(xì)胞懸液置于400高斯?4000高斯磁場(chǎng)中，3? 5分鐘后收集磁分離的細(xì)胞。
[0026] 所述步驟1中表面羧基化的超順磁性納米粒子制備方法如下：
[0027] 將8. lg的FeCl3 · 6H20溶于142. 5mL去離子水，攪拌加熱至70°C ;將4. 4g的 FeCl2 · 4H20溶于10mL去離子水，過(guò)濾；將兩種溶液混合后劇烈攪拌，快速加入18ml濃氨 水，之后逐滴加入4. 66g油酸，繼續(xù)在70°C的溫度下快速攪拌1小時(shí)；制得的溶液用酒精沉 淀、洗滌2?3次，再用去離子水洗滌至中性，然后加入160ml的濃度為10mg/mL ΚΜη04溶 液，超聲波清洗儀超聲振蕩8h，最后將制得的溶液用去離子水洗滌2?3次，冷凍干燥后得 表面羧基化的超順磁性納米粒子。
[0028] 所述步驟2中的發(fā)酵液或細(xì)胞懸液為單細(xì)胞懸液，較優(yōu)的為乳酸菌細(xì)胞懸液、大 腸桿菌細(xì)胞懸液或酵母細(xì)胞懸液。
[0029] 所述步驟4中的所述磁場(chǎng)可為永磁場(chǎng)或電磁場(chǎng)。
[0030] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0031] 實(shí)施例1 :表面富含羧基的超順磁性納米粒子的制備方法
[0032] 將8. lg的FeCl3 · 6H20溶于142. 5ml去離子水，攪拌加熱至70°C ;
[0033] 將4. 4g的FeCl2 · 4H20溶于10ml去離子水，過(guò)濾；
[0034] 將兩種溶液混合，在劇烈攪拌的條件下，快速加入18ml濃氨水，之后逐滴加入 4. 66g油酸，繼續(xù)在70°C的溫度下快速攪拌1小時(shí)；制得的溶液用酒精沉淀、洗滌2次，再 用去離子水洗滌至中性；
[0035] 向制得的溶液里然后加入160ml的ΚΜη04溶液（10mg/ml)，超聲波清洗儀超聲振 蕩8h，將制得的溶液用去離子水洗滌3次，加入適量的去離子水，超聲2h，冷凍干燥后得 表面羧基化的超順磁性納米粒子。
[0036] 實(shí)施例2 :利用實(shí)施例1制備的超順磁性納米粒子從發(fā)酵液中分離羅伊氏乳桿菌 細(xì)胞
[0037] 取培養(yǎng)24小時(shí)后的菌液lOOOmL，逐滴加入6mL濃度60mg/mL的表面羧基化的超 順磁性納米粒子，充分搖勻，調(diào)節(jié)溶液的pH為2 ;置于磁場(chǎng)強(qiáng)度約為400高斯的永磁體磁場(chǎng) 中，磁分離lOmin ;測(cè)磁分離后的上清液中的細(xì)胞濃度，結(jié)果表明98%的羅伊氏乳桿菌細(xì)胞 被有效磁分離。
[0038] 將上述中磁分離后的沉淀物重懸于去離子水中，得到磁修飾細(xì)胞懸液，重新置于 磁場(chǎng)強(qiáng)度約為4000高斯的永磁體磁場(chǎng)中，磁分離lOmin ;測(cè)磁分離后的上清液中的細(xì)胞濃 度，結(jié)果表明100 %的羅伊氏乳桿菌細(xì)胞被有效磁分離。
[0039] 實(shí)施例3 :利用實(shí)施例1制備的表面羧基化的超順磁性納米粒子從發(fā)酵液中分離 羅伊氏乳桿菌細(xì)胞
[0040] 取培養(yǎng)24小時(shí)后的菌液lOOOmL，逐滴加入80mL濃度5mg/mL的表面羧基化的超順 磁性納米粒子，充分搖勻，調(diào)節(jié)溶液的pH為4 ;置于磁場(chǎng)強(qiáng)度約為4000高斯的永磁體磁場(chǎng) 中，磁分離lOmin ;測(cè)磁分離后的上清液中的細(xì)胞濃度，結(jié)果表明96%的羅伊氏乳桿菌細(xì)胞 被有效磁分離。
[0041] 將上述中磁分離后的沉淀物重懸于去離子水中，得到磁修飾細(xì)胞懸液，重新置于 磁場(chǎng)強(qiáng)度約為4000高斯的永磁體磁場(chǎng)中，磁分離lOmin ;測(cè)磁分離后的上清液中的細(xì)胞濃 度，結(jié)果表明100 %的羅伊氏乳桿菌細(xì)胞被有效磁分離。
[0042] 實(shí)施例4 :利用實(shí)施例1制備的表面羧基化的超順磁性納米粒子從大腸桿菌細(xì)胞 懸液中分離大腸桿菌細(xì)胞
[0043] 取培養(yǎng)12小時(shí)后的菌液lOOOmL，在4°C下8000r/min離心分離出大腸桿菌細(xì)胞； 離心lOmin后棄上清液，用去離子水水洗滌菌體后再次離心，并重復(fù)兩次；將離心的菌體重 懸于lOOOmL超純水中，得到大腸桿菌細(xì)胞懸液，并向其中添加11. 6g氯化鈉。
[0044] 逐滴加入60mL濃度20mg/mL的表面羧基化的超順磁性納米粒子，充分搖勻；置于 磁場(chǎng)強(qiáng)度約為2000高斯的電磁磁場(chǎng)中，磁分離lOmin ;測(cè)磁分離后的上清液中的細(xì)胞濃度， 結(jié)果表明97%的大腸桿菌細(xì)胞被有效磁分離。
[0045] 實(shí)施例5 :利用實(shí)施例1制備的表面羧基化的超順磁性納米粒子從發(fā)酵液中分離 大腸桿菌細(xì)胞
[0046] 取培養(yǎng)24小時(shí)后的菌液lOOOmL，逐滴加入40mL濃度80mg/mL的表面羧基化的超 順磁性納米粒子，充分搖勻，調(diào)節(jié)溶液的pH為3 ;置于磁場(chǎng)強(qiáng)度約為4000高斯的永磁體磁 場(chǎng)中，磁分離lOmin ;測(cè)磁分離后的上清液中的細(xì)胞濃度，結(jié)果表明85%的大腸桿菌細(xì)胞被 有效磁分離。
【權(quán)利要求】
1. 一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法，其特征在于：所述方法步驟如 下： 步驟1、將表面羧基化的超順磁性納米粒子溶解于去離子水中，制成濃度為5?80mg/ mL的磁流體溶液； 步驟2、將6mL?80mL步驟1制得的表面羧基化的超順磁性納米粒子溶液，加入1L發(fā) 酵液或細(xì)胞懸液中； 步驟3、再向步驟2所得溶液中加入濃度為lmol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其 pH為2?6 ; 步驟4、將步驟3所得的發(fā)酵液或細(xì)胞懸液置于400高斯?4000高斯磁場(chǎng)中，3?5分 鐘后收集磁分離的細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法，其特征在 于：所述步驟1中表面羧基化的超順磁性納米粒子制備方法如下： 將8. lg的FeCl3 ·6Η20溶于142. 5mL去離子水，攪拌加熱至70°C;將4. 4g的FeCl2 ·4Η20 溶于10mL去離子水，過(guò)濾；將兩種溶液混合后劇烈攪拌，快速加入18ml濃氨水，之后逐滴 加入4. 66g油酸，繼續(xù)在70°C的溫度下快速攪拌1小時(shí)；制得的溶液用酒精沉淀、洗滌2? 3次，再用去離子水洗滌至中性，然后加入160ml的濃度為10mg/mLKMn0 4溶液，超聲波清洗 儀超聲振蕩8h，最后將制得的溶液用去離子水洗滌2?3次，冷凍干燥后得表面羧基化的超 順磁性納米粒子。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法，其特征在 于：所述步驟2中的發(fā)酵液或細(xì)胞懸液為單細(xì)胞懸液。
4. 如權(quán)利要求3所述的一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法，其特征在 于：所述步驟2中的發(fā)酵液或細(xì)胞懸液為乳酸菌細(xì)胞懸液、大腸桿菌細(xì)胞懸液或酵母細(xì)胞 懸液。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種從發(fā)酵液或細(xì)胞懸液中快速分離細(xì)胞的方法，其特征在 于：所述步驟4中的所述磁場(chǎng)可為永磁場(chǎng)或電磁場(chǎng)。
【文檔編號(hào)】C12N13/00GK104046612SQ201410261919
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】陳國(guó) , 林檬 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)