一種回收利用微生物提油后的生物質(zhì)來生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種回收利用微生物提油后的生物質(zhì)來生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法。本發(fā)明將微生物發(fā)酵提油后廢棄的生物質(zhì)再次用于微生物發(fā)酵以提取不飽和脂肪酸，減少廢物的排放，可以大大節(jié)省微生物培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的投入，明顯降低生產(chǎn)成本，且生產(chǎn)效率高。
【專利說明】一種回收利用微生物提油后的生物質(zhì)來生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種回收利用微生物提油后的生物質(zhì)來生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]Omega 3不飽和脂肪酸(PUFAs)特指有雙鍵位于倒數(shù)第三個(gè)碳原子上的一種不飽和脂肪酸，其中對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸有二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳六烯酸(DHA)和α亞麻酸(ALA)。人體本身并不能合成這些不飽和脂肪酸，只能通過在食物中的攝取。海洋魚類是這些不飽和脂肪酸的直接來源，魚油作為一種膳食補(bǔ)充劑其營養(yǎng)價(jià)值也得到了廣泛的認(rèn)識(shí)。但是由于海洋魚類資源有限，并不能支撐日益增長的不飽和脂肪酸的需求。日漸稀缺的魚類資源也導(dǎo)致魚油的價(jià)格日漸上漲。
[0003]研究表明，魚類體內(nèi)的不飽和脂肪酸來源于海洋微藻，因此，工業(yè)法生產(chǎn)海洋微藻已經(jīng)成為另外一種獲取不飽和脂肪酸的方法。試驗(yàn)表明，在一些真核生物細(xì)胞中，包括微藻、真菌和原生生物，含有大量的不飽和脂肪酸(10%-20%)，例如，破囊壺菌(Thraustochytrium)已被正式可以生產(chǎn)DHA,而在一些娃藻生物(Bacillar1phyceae)和綠藻(Chlorophyceae)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了 EPA的成分。這些發(fā)現(xiàn)利用微藻來去取代深海魚類來生產(chǎn)不飽和脂肪酸奠定了基礎(chǔ)。目前，利用真核微生物細(xì)胞來生產(chǎn)這些不飽和脂肪酸的這項(xiàng)技術(shù)還沒有完全普及，主要的問題在于微藻的繁殖方式和提取的成本較高，不利用商業(yè)化的生產(chǎn)。如何降低成本是該研究領(lǐng)域的一大研究方向。
[0004]利用傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，生產(chǎn)極高密度的生物量(大于100 g/L )是有效的降低生產(chǎn)成本的方法，而達(dá)到這一目的，就需要在發(fā)酵過程中連續(xù)不間斷的添加營養(yǎng)物質(zhì)，達(dá)到讓細(xì)胞持續(xù)分裂生長的目的。主要的營養(yǎng)物質(zhì)，如有機(jī)糖原和氮源，將在該生產(chǎn)方式中占到50%以上的成本。因此，尋找便宜的營養(yǎng)物質(zhì)則成為進(jìn)一步減低成本的有效途徑。
[0005]在真核細(xì)胞中，不飽和脂肪酸主要以三酰甘油的形式存在，就是普遍意義上的脂肪顆粒。細(xì)胞發(fā)酵完成之后，通常會(huì)將細(xì)胞膜破壞進(jìn)而將油脂和其他的生物物質(zhì)分離，獲得的油脂在進(jìn)一步純化得到所需的不飽和脂肪酸。在該過程中，細(xì)胞中的糖類物質(zhì)和蛋白類物質(zhì)通常都作為廢料丟棄。然而，這些物質(zhì)在經(jīng)過合適的處理之后是可以被回收利用的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種回收利用微生物提油后的生物質(zhì)來生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法，將微生物發(fā)酵提油后廢棄的生物質(zhì)再次用于微生物發(fā)酵以提取不飽和脂肪酸，減少廢物的排放，可以大大節(jié)省微生物培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的投入，明顯降低生產(chǎn)成本，且生產(chǎn)效率高。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種回收利用微生物提油后的生物質(zhì)來生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法，包括以下步驟:(1)微生物發(fā)酵:選擇富含不飽和脂肪酸的菌種，接種至基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在22-32°C，發(fā)酵100-144小時(shí)；
(2)提油:將步驟(1)發(fā)酵所得發(fā)酵液進(jìn)行提油，含油的物質(zhì)層和水層分離，收集水層的生物質(zhì)廢液；
(3)生物質(zhì)廢液回收:向生物質(zhì)廢液中加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，然后加入占生物質(zhì)廢液重量1-5%的活性炭,加熱生物質(zhì)廢液至55-60°C下攪拌混合，對(duì)生物質(zhì)廢液進(jìn)行脫色并同時(shí)濃縮，然后降至室溫，靜置過濾，獲得含糖量大于100g/L、總含氮量大于10g/L的生物質(zhì)廢液的濃縮液I ;
(4)生物質(zhì)廢液再利用發(fā)酵:選擇富含不飽和脂肪酸的菌種，接種至生物質(zhì)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，每升生物質(zhì)液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分:生物質(zhì)濃縮液I 100-400ml，Na2SO4 ll-15g, MgSO4.7H20 2_4g，KCl 0.4-0.6g, K2SO4 0.5-0.7g, (NH4)2SO4 0.95-1.lg,CaCl2 0.1-0.15g，葡萄糖10_20g，KH2PO4 0.9-1.2g，痕量金屬元素溶液0.5_3mL，復(fù)合維生素溶液l-2mL ;發(fā)酵溫度控制在22-32°C，發(fā)酵100-144小時(shí)。
[0008]本發(fā)明首先利用常規(guī)的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)第一批微生物，提油后，將廢棄的生物質(zhì)廢液脫色濃縮后，用于配制新的培養(yǎng)基(生物質(zhì)培養(yǎng)基)，二次培養(yǎng)微生物用于提油，從而將廢棄的生物質(zhì)二次利用，綠色環(huán)保，廢棄的生物質(zhì)的利用，可以大大減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)如有機(jī)碳源、氮源的使用，從而降低生產(chǎn)成本，且本發(fā)明限定了特定的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝，大大提高了生產(chǎn)效率，發(fā)酵密度可達(dá)到80g/L以上。
[0009]本發(fā)明中的培養(yǎng)基，除了生物質(zhì)濃縮液之外，其他的成分均為限定的化學(xué)成分，而不是非限定的化學(xué)成分，如大豆粉。利用可控的限定化學(xué)成分，可以保證每次發(fā)酵的成品的均一性和高效率。
[0010]本發(fā)明中的提油的基本原理是:首先利用溶液酸堿度來達(dá)到讓細(xì)胞破壁的作用，再根據(jù)油脂在水溶液中的溶解性低的原理進(jìn)行離心分離，油脂最后通過非極性溶劑如正己烷萃取得到。提油剩余的生物質(zhì)廢液，濃縮后來取代培養(yǎng)基中的一部分營養(yǎng)物質(zhì)二次發(fā)酵培養(yǎng)。
[0011]本發(fā)明利用活性炭脫色，可以吸附生物質(zhì)廢液中的毒素如苯酚類物質(zhì)、重金屬等，保證后續(xù)發(fā)酵的安全可靠。
[0012]作為優(yōu)選，步驟(1)中每升基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分:Na2SO4 ll_15g，MgSO4.7H20 2-4g, KCl 0.4-0.6g, K2SO4 0.5-0.7g, (NH4)2SO4 0.95-1.lg, CaCl2
0.l-0.15g，葡萄糖30-60g，KH2PO4 0.9-1.2g，痕量金屬元素溶液0.5_3mL，復(fù)合維生素溶液1-2 mLo
[0013]作為優(yōu)選,每升痕量金屬元素溶液包括如下含量的組分=MnCl2.4H20 2.7-3.3g,ZnSO4.7H20 2.5_3g，CoCl2.6H20 0.035-0.045g, Na2MoO4.2H20 0-0.045g, CuSO4.5H20
1.8-2.2 g, NiSO4.6H20 1.5-2.2g，F(xiàn)eSO4.7H20 8_16g，每升復(fù)合維生素溶液包括如下含量的組分:硫銨酸4-llg,泛鈣酸1.3-5.1 g,維生素B12 100-150 mg。
[0014]作為優(yōu)選，步驟(1)的發(fā)酵過程中采取補(bǔ)料工藝，在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)之后向發(fā)酵液中持續(xù)補(bǔ)加基礎(chǔ)補(bǔ)料液，基礎(chǔ)補(bǔ)料液的補(bǔ)加速率為每小時(shí)注入發(fā)酵液總體積的0.1%-0.2% ;每升基礎(chǔ)補(bǔ)料液包括如下含量的組分:Na2SO4 22_30g，MgSO4.7Η20 4_8g，KCl
l-2g, K2SO4 2-3g, (NH4)2SO4 2~4g, CaCl2 0.5-0.8g,葡萄糖 600_900g。采取補(bǔ)料工藝以達(dá)到高密度培養(yǎng)的目的，提高生產(chǎn)效率。采用本發(fā)明更新的補(bǔ)料工序，無需移除原有的培養(yǎng)液。
[0015]作為優(yōu)選，根據(jù)步驟(1)微生物的發(fā)酵密度不同，步驟(2)的提油方案可分為兩種:
方案一:
當(dāng)微生物的發(fā)酵密度達(dá)到130g/L以上時(shí)，提油方法為:先將發(fā)酵液在鼓式干燥機(jī)中進(jìn)行干燥至水分含量小于10%的粉狀物質(zhì)，所得的粉狀物質(zhì)與濃度為0.1-0.15mol/L的稀硫酸溶液按1-1.5:1的質(zhì)量比混合，50-80 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌混合1_2小時(shí)，然后500-1000r/min離心2_3小時(shí)，離心所得沉淀為含油的物質(zhì)層，離心所得上清液為水層，含油的物質(zhì)層用有機(jī)溶劑正己烷萃取得到油脂類物質(zhì)，水層為生物質(zhì)廢液進(jìn)入步驟(3)重新利用；方案二:
當(dāng)80g/L <微生物的發(fā)酵密度< 130g/L時(shí)，提油方法為:將發(fā)酵液放入沉淀罐中靜置沉淀24小時(shí)，抽掉上層清液，向沉淀物中加入體積濃度為5-10%的稀硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH至
2-3，然后加熱至30-35°C保持1-2小時(shí)，冷卻至室溫，然后500-1000 r/min離心4_6小時(shí)，離心所得沉淀為含油的物質(zhì)層，離心所得上清液為水層，含油的物質(zhì)層用有機(jī)溶劑正己烷萃取得到油脂類物質(zhì)，水層為生物質(zhì)廢液進(jìn)入步驟(3)重新利用。
[0016]當(dāng)微生物的發(fā)酵密度達(dá)到130g/L以上時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中的水分含量低，適合方案一的方法。當(dāng)80g/L <微生物的發(fā)酵密度< 130g/L時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中的水分含量高，若采用方案一的方法，能耗大， 因此，本發(fā)明針對(duì)發(fā)酵密度的不同，采取了不同的提油方法。
[0017]作為優(yōu)選，萃取時(shí)將含油的物質(zhì)層與有機(jī)溶劑按1:3-6的質(zhì)量比混合，攪拌混合40-60min，靜置分層，上層液為有機(jī)溶劑和DHA粗油，再將上層液放入減壓蒸餾器中除去有機(jī)溶劑得到DHA粗油。
[0018]作為優(yōu)選，步驟(4)的發(fā)酵過程中采取補(bǔ)料工藝，在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)之后向發(fā)酵液中持續(xù)補(bǔ)加生物質(zhì)補(bǔ)料液，生物質(zhì)補(bǔ)料液的補(bǔ)加速率為每小時(shí)注入發(fā)酵液總體積的
0.1%-0.2% ;每升生物質(zhì)補(bǔ)料液包括如下含量的組分=Na2SO4 22-30 g，MgSO4.7H20 4-8 g，KCl l-2g, K2SO4 2-3g，(NH4)2SO4 2_4g，CaCl2 0.5-0.8g，葡萄糖 300-500 g，生物質(zhì)廢液的濃縮液II 300-400mL ;所述生物質(zhì)廢液的濃縮液II為生物質(zhì)廢液的濃縮液I在55_60°C下繼續(xù)蒸發(fā)水分，至含糖量大于500g/L、總含氮量大于50g/L而得。采取本發(fā)明的補(bǔ)料工藝可以達(dá)到高密度培養(yǎng)的目的，提高生產(chǎn)效率，且發(fā)酵產(chǎn)物的油脂含量可達(dá)50-60%，DHA含量可達(dá)30-40%。采用本發(fā)明更新的補(bǔ)料工序，無需移除原有的培養(yǎng)液。且補(bǔ)料時(shí)，采用含糖量及含氮量更大的生物質(zhì)廢液的濃縮液II培養(yǎng)效果好。
[0019]作為優(yōu)選，步驟(1)和步驟(4)中富含不飽和脂肪酸的菌種選擇裂殖壺菌(Schizochytrium)、隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)、破囊壺菌(Thraustochytrium)中的一種。這些微生物均為可以進(jìn)行異養(yǎng)生長的微生物，可以通過聚酮化合物合成酶系統(tǒng)來合成有益的不飽和脂肪酸的微生物。
[0020]作為優(yōu)選，步驟(1)中接種量為基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基重量的1%_10%，步驟(4)中接種量為生物質(zhì)液體培養(yǎng)基重量的1%-10%。
[0021]作為優(yōu)選，步驟(1)和步驟(4)的發(fā)酵過程中都進(jìn)行通空氣培養(yǎng)，通入的空氣流量為1-3 vvm,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至24-48小時(shí)時(shí)控制通入的空氣含氧量為4_10%，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)48之后至72小時(shí)控制通入的空氣含氧量為3%以下，72小時(shí)之后空氣含氧量控制在0%。本發(fā)明通過控制發(fā)酵溫度及通入空氣的含氧量以提高微生物不飽和脂肪酸的產(chǎn)量。含氧量低有利于微生物產(chǎn)生更多的不飽和脂肪酸。
[0022]本發(fā)明的有益效果是:
1、將微生物發(fā)酵提油后廢棄的生物質(zhì)再次用于微生物發(fā)酵以提取不飽和脂肪酸，減少廢物的排放，可以大大節(jié)省微生物培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的投入，明顯降低生產(chǎn)成本，且生產(chǎn)效率高。
[0023]2、本發(fā)明中發(fā)酵培養(yǎng)的微生物細(xì)胞富含可食用的不飽和脂肪酸(DHA)，約80%-90%的DHA包含于甘油三酯(Triacylglycerol)中，而甘油三脂是易于被人體吸收。因此，本發(fā)明所得的DHA可以經(jīng)過簡單的提純處理就作為膳食補(bǔ)充劑，提供給需要DHA的人群，例如，嬰幼兒和產(chǎn)前或產(chǎn)后的孕婦。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基與生物質(zhì)液體培養(yǎng)基對(duì)于微生物細(xì)胞生長的對(duì)比圖。
[0025]圖2是不同碳氮比的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基與生物質(zhì)液體培養(yǎng)基對(duì)于微生物細(xì)胞油脂組成的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0027]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0028]實(shí)施例1:
一種回收利用微生物提油后的生物質(zhì)來生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法，包括以下步驟:
(I)微生物發(fā)酵:選擇選擇裂殖壺菌為菌種(市售菌種)，接種至基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，接種量為基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基重量的1%，發(fā)酵溫度控制在22°c，發(fā)酵144小時(shí)。
[0029]每升基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分=Na2SO4 llg, MgSO4.7H20 2g，KCl0.4g, K2SO4 0.5g, (NH4)2SO4 0.95g, CaCl2 0.lg，葡萄糖 30g，KH2PO4 0.9g，痕量金屬元素溶液0.5mL，復(fù)合維生素溶液lmL。
[0030]發(fā)酵過程中采取補(bǔ)料工藝，在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)之后向發(fā)酵液中持續(xù)補(bǔ)加基礎(chǔ)補(bǔ)料液，基礎(chǔ)補(bǔ)料液的補(bǔ)加速率為每小時(shí)注入發(fā)酵液總體積的0.1% ;每升基礎(chǔ)補(bǔ)料液包括如下含量的組分:Na2SO4 22g，MgSO4.7H20 4g，KCl Ig，K2SO4 2g, (NH4)2SO4 2g, CaCl20.5g,葡萄糖 600g。
[0031](2)提油:根據(jù)步驟(1)微生物的發(fā)酵密度不同，步驟(2)的提油方案可分為兩種:
方案一:
當(dāng)微生物的發(fā)酵密度達(dá)到130g/L以上時(shí)，提油方法為:先將發(fā)酵液在鼓式干燥機(jī)中進(jìn)行干燥至水分含量小于10%的粉狀物質(zhì)，所得的粉狀物質(zhì)與濃度為0.lmol/L的稀硫酸溶液按1:1的質(zhì)量比混合，50 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌混合2小時(shí),然后500r/min離心3小時(shí),離心所得沉淀為含油的物質(zhì)層，離心所得上清液為水層，含油的物質(zhì)層用有機(jī)溶劑正己烷萃取得到油脂類物質(zhì)，水層為生物質(zhì)廢液進(jìn)入步驟(3)重新利用；方案二:
當(dāng)80g/L <微生物的發(fā)酵密度< 130g/L時(shí)，提油方法為:將發(fā)酵液放入沉淀罐中靜置沉淀24小時(shí)，抽掉上層清液，向沉淀物中加入體積濃度為5%的稀硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH至3，然后加熱至30°C保持2小時(shí)，冷卻至室溫，然后500 r/min離心6小時(shí)，離心所得沉淀為含油的物質(zhì)層，離心所得上清液為水層，含油的物質(zhì)層用有機(jī)溶劑正己烷萃取得到油脂類物質(zhì)，水層為生物質(zhì)廢液進(jìn)入步驟(3)重新利用。
[0032]萃取時(shí)將含油的物質(zhì)層與有機(jī)溶劑按1:3的質(zhì)量比混合，攪拌混合40min，靜置分層，上層液為有機(jī)溶劑和DHA粗油，再將上層液放入減壓蒸餾器中除去有機(jī)溶劑得到DHA粗油。
[0033](3)生物質(zhì)廢液回收:向生物質(zhì)廢液中加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，然后加入占生物質(zhì)廢液重量1%的活性炭，加熱生物質(zhì)廢液至55°C下攪拌混合，對(duì)生物質(zhì)廢液進(jìn)行脫色并同時(shí)濃縮，然后降至室溫，靜置過濾，獲得含糖量大于100g/L、總含氮量大于10g/L的生物質(zhì)廢液的濃縮液I ;
(4)生物質(zhì)廢液再利用發(fā)酵:選擇裂殖壺菌為菌種，接種至生物質(zhì)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，接種量為生物質(zhì)液體培養(yǎng)基重量的1%，每升生物質(zhì)液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分:生物質(zhì)濃縮液 I 100ml, Na2SO4 llg, MgSO4.7H20 2g，KCl 0.4g, K2SO4 0.5g, (NH4)2SO40.95g, CaCl2 0.lg,葡萄糖1g, KH2PO4 0.9g,痕量金屬元素溶液0.5mL,復(fù)合維生素溶液ImL ;發(fā)酵溫度控制在22°C，發(fā)酵144小時(shí)。
[0034]步驟(4)發(fā)酵過程中采取補(bǔ)料工藝，在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)之后向發(fā)酵液中持續(xù)補(bǔ)加生物質(zhì)補(bǔ)料液，生物質(zhì)補(bǔ)料液的補(bǔ)加速率為每小時(shí)注入發(fā)酵液總體積的0.1% ;每升生物質(zhì)補(bǔ)料液包括如下含量的組分=Na2SO4 22g，MgSO4.7H20 4g，KCl lg, K2SO4 2g，(NH4)2SO4 2g，CaCl2 0.5g，葡萄糖300g，生物質(zhì)廢液的濃縮液II 300mL ;所述生物質(zhì)廢液的濃縮液II為生物質(zhì)廢液的濃縮液I在55°C下繼續(xù)蒸發(fā)水分，至含糖量大于500g/L、總含氮量大于50g/L而得。
[0035]每升痕量金屬元素溶液包括如下含量的組分=MnCl2.4H20 2.7g，ZnSO4.7H20
2.5g, CoCl2.6H20 0.035g, Na2MoO4.2H20 Og, CuSO4.5H20 1.8g, NiSO4.6H20 1.5g,FeSO4.7H20 Sg，每升復(fù)合維生素溶液包括如下含量的組分:硫銨酸4g，泛鈣酸1.3g，維生素 B12 10mg0
[0036]步驟(1)和步驟(4)的發(fā)酵過程中都進(jìn)行通空氣培養(yǎng)，通入的空氣流量為lvvm，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至24-48小時(shí)時(shí)控制通入的空氣含氧量為4%，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)48之后至72小時(shí)控制通入的空氣含氧量為3%以下，72小時(shí)之后空氣含氧量控制在0%。
[0037]實(shí)施例2:
一種回收利用微生物提油后的生物質(zhì)來生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法，包括以下步驟:
(I)微生物發(fā)酵:選擇選擇隱甲藻為菌種(市售菌種)，接種至基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，接種量為基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基重量的10%，發(fā)酵溫度控制在32°C，發(fā)酵100小時(shí)。
[0038]每升基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分=Na2SO4 15g, MgSO4.7H20 4g，KCl
0.6g, K2SO4 0.7g, (NH4)2SO4 1.lg, CaCl2 0.15g，葡萄糖 60g，KH2PO4 1.2g，痕量金屬元素溶液3mL，復(fù)合維生素溶液2mL。
[0039]發(fā)酵過程中采取補(bǔ)料工藝，在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)之后向發(fā)酵液中持續(xù)補(bǔ)加基礎(chǔ)補(bǔ)料液，基礎(chǔ)補(bǔ)料液的補(bǔ)加速率為每小時(shí)注入發(fā)酵液總體積的0.2% ;每升基礎(chǔ)補(bǔ)料液包括如下含量的組分:Na2SO4 30g，MgSO4.7H20 8g，KCl 2g，K2SO4 3g, (NH4)2SO4 4g, CaCl2
0.8g,葡萄糖 900g。
[0040](2)提油:根據(jù)步驟(1)微生物的發(fā)酵密度不同，步驟(2)的提油方案可分為兩種:
方案一:
當(dāng)微生物的發(fā)酵密度達(dá)到130g/L以上時(shí)，提油方法為:先將發(fā)酵液在鼓式干燥機(jī)中進(jìn)行干燥至水分含量小于10%的粉狀物質(zhì)，所得的粉狀物質(zhì)與濃度為0.15mol/L的稀硫酸溶液按1.5:1的質(zhì)量比混合，80 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌混合I小時(shí)，然后1000 r/min離心2小時(shí)，離心所得沉淀為含油的物質(zhì)層，離心所得上清液為水層，含油的物質(zhì)層用有機(jī)溶劑正己烷萃取得到油脂類物質(zhì)，水層為生物質(zhì)廢液進(jìn)入步驟(3)重新利用；
方案二:
當(dāng)80g/L <微生物的發(fā)酵密度< 130g/L時(shí)，提油方法為:將發(fā)酵液放入沉淀罐中靜置沉淀24小時(shí)，抽掉上層清液，向沉淀物中加入體積濃度為10%的稀硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH至2，然后加熱至35°C保持I小時(shí)，冷卻至室溫，然后1000 r/min離心4小時(shí)，離心所得沉淀為含油的物質(zhì)層，離心所得上清液為水層，含油的物質(zhì)層用有機(jī)溶劑正己烷萃取得到油脂類物質(zhì)，水層為生物質(zhì)廢液進(jìn)入步驟(3)重新利用。
[0041]萃取時(shí)將含油的物質(zhì)層與有機(jī)溶劑按1:6的質(zhì)量比混合，攪拌混合60min，靜置分層，上層液為有機(jī)溶劑和DHA粗油，再將上層液放入減壓蒸餾器中除去有機(jī)溶劑得到DHA粗油。
[0042](3)生物質(zhì)廢液回收:向生物質(zhì)廢液中加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，然后加入占生物質(zhì)廢液重量5%的活性炭，加熱生物質(zhì)廢液至60°C下攪拌混合，對(duì)生物質(zhì)廢液進(jìn)行脫色并同時(shí)濃縮，然后降至室溫，靜置過濾，獲得含糖量大于100g/L、總含氮量大于10g/L的生物質(zhì)廢液的濃縮液I ;
(4)生物質(zhì)廢液再利用發(fā)酵:選擇隱甲藻為菌種，接種至生物質(zhì)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，接種量為生物質(zhì)液體培養(yǎng)基重量的10%，每升生物質(zhì)液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分:生物質(zhì)濃縮液 I 400ml, Na2SO4 15g，MgSO4.7H20 4g，KCl 0.6g, K2SO4 0.7g, (NH4)2SO4
1.lg, CaCl2 0.15g,葡萄糖20g, KH2PO4 1.2g,痕量金屬元素溶液3mL,復(fù)合維生素溶液2mL ；發(fā)酵溫度控制在32°C，發(fā)酵100小時(shí)。
[0043]步驟(4)發(fā)酵過程中采取補(bǔ)料工藝，在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)之后向發(fā)酵液中持續(xù)補(bǔ)加生物質(zhì)補(bǔ)料液，生物質(zhì)補(bǔ)料液的補(bǔ)加速率為每小時(shí)注入發(fā)酵液總體積的0.2% ;每升生物質(zhì)補(bǔ)料液包括如下含量的組分=Na2SO4 30 g, MgSO4.7Η20 8 g，KCl 2g, K2SO4 3g，(NH4)2SO4 4g，CaCl2 0.8g，葡萄糖500 g，生物質(zhì)廢液的濃縮液II 400mL ;所述生物質(zhì)廢液的濃縮液II為生物質(zhì)廢液的濃縮液I在60°C下繼續(xù)蒸發(fā)水分，至含糖量大于500g/L、總含氮量大于50g/L而得。
[0044]每升痕量金屬元素溶液包括如下含量的組分=MnCl2.4H20 3.3g，ZnSO4.7H203g, CoCl2.6H20 0.045g, Na2MoO4.2H20 0.045g, CuSO4.5H20 2.2 g, NiSO4.6H20 2.2g,FeSO4WH2O 16g，每升復(fù)合維生素溶液包括如下含量的組分:硫銨酸llg，泛鈣酸5.lg，維生素 B12 150mg。
[0045]步驟(1)和步驟(4)的發(fā)酵過程中都進(jìn)行通空氣培養(yǎng)，通入的空氣流量為3 vvm,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至24-48小時(shí)時(shí)控制通入的空氣含氧量為10%，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)48之后至72小時(shí)控制通入的空氣含氧量為3%以下，72小時(shí)之后空氣含氧量控制在0%。
[0046]實(shí)施例3:
一種回收利用微生物提油后的生物質(zhì)來生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法，包括以下步驟:
(I)微生物發(fā)酵:選擇選擇破囊壺菌為菌種(市售菌種)，接種至基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，接種量為基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基重量的5%，發(fā)酵溫度控制在28°C，發(fā)酵120小時(shí)。
[0047]每升基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分=Na2SO4 12.5g, MgSO4.7H20 2.5g，KCl
0.5g, K2SO4 0.6g, (NH4)2SO4 lg, CaCl2 0.12g，葡萄糖 50g，KH2PO4 lg，痕量金屬元素溶液2mL，復(fù)合維生素溶液1.5mL。
[0048]發(fā)酵過程中采取補(bǔ)料工藝，在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)之后向發(fā)酵液中持續(xù)補(bǔ)加基礎(chǔ)補(bǔ)料液，基礎(chǔ)補(bǔ)料液的補(bǔ)加速率為每小時(shí)注入發(fā)酵液總體積的0.15% ;每升基礎(chǔ)補(bǔ)料液包括如下含量的組分:Na2SO4 25g，MgSO4.7H20 6g，KCl 1.5g, K2SO4 2.5g, (NH4)2SO4 3g,CaCl2 0.6g,葡萄糖 700g。
[0049](2)提油:根據(jù)步驟(1)微生物的發(fā)酵密度不同，提油方案可分為兩種:
方案一:
當(dāng)微生物的發(fā)酵密度達(dá)到130g/L以上時(shí)，提油方法為:先將發(fā)酵液在鼓式干燥機(jī)中進(jìn)行干燥至水分含量小于10%的粉狀物質(zhì)，所得的粉狀物質(zhì)與濃度為0.lmol/L的稀硫酸溶液按1:1的質(zhì)量比混合，70 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌混合1.5小時(shí),然后800 r/min離心2.5小時(shí)，離心所得沉淀為含油的物質(zhì)層，離心所得上清液為水層，含油的物質(zhì)層用有機(jī)溶劑正己烷萃取得到油脂類物質(zhì)，水層為生物質(zhì)廢液進(jìn)入步驟(3)重新利用；
方案二:
當(dāng)80g/L <微生物的發(fā)酵密度< 130g/L時(shí)，提油方法為:將發(fā)酵液放入沉淀罐中靜置沉淀24小時(shí)，抽掉上層清液，向沉淀物中加入體積濃度為8%的稀硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH至2.5左右，然后加熱至32°C保持1.5小時(shí)，冷卻至室溫，然后800 r/min離心5小時(shí)，離心所得沉淀為含油的物質(zhì)層，離心所得上清液為水層，含油的物質(zhì)層用有機(jī)溶劑正己烷萃取得到油脂類物質(zhì)，水層為生物質(zhì)廢液進(jìn)入步驟(3)重新利用。
[0050]萃取時(shí)將含油的物質(zhì)層與有機(jī)溶劑按1:4的質(zhì)量比混合，攪拌混合50min，靜置分層，上層液為有機(jī)溶劑和DHA粗油，再將上層液放入減壓蒸餾器中除去有機(jī)溶劑得到DHA粗油。
[0051](3)生物質(zhì)廢液回收:向生物質(zhì)廢液中加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，然后加入占生物質(zhì)廢液重量3%的活性炭，加熱生物質(zhì)廢液至60°C下攪拌混合，對(duì)生物質(zhì)廢液進(jìn)行脫色并同時(shí)濃縮，然后降至室溫，靜置過濾，獲得含糖量大于100g/L、總含氮量大于10g/L的生物質(zhì)廢液的濃縮液I (具體見下表)；

【權(quán)利要求】
1.一種回收利用微生物提油后的生物質(zhì)來生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)微生物發(fā)酵:選擇富含不飽和脂肪酸的菌種，接種至基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在22-32°C，發(fā)酵100-144小時(shí)； (2)提油:將步驟(1)發(fā)酵所得發(fā)酵液進(jìn)行提油，含油的物質(zhì)層和水層分離，收集水層的生物質(zhì)廢液； (3)生物質(zhì)廢液回收:向生物質(zhì)廢液中加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，然后加入占生物質(zhì)廢液重量1-5%的活性炭,加熱生物質(zhì)廢液至55-60°C下攪拌混合，對(duì)生物質(zhì)廢液進(jìn)行脫色并同時(shí)濃縮，然后降至室溫，靜置過濾，獲得含糖量大于100g/L、總含氮量大于10g/L的生物質(zhì)廢液的濃縮液I ; (4)生物質(zhì)廢液再利用發(fā)酵:選擇富含不飽和脂肪酸的菌種，接種至生物質(zhì)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，每升生物質(zhì)液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分:生物質(zhì)濃縮液I 100-400ml，Na2SO4 ll-15g, MgSO4.7H20 2_4g，KCl 0.4-0.6g, K2SO4 0.5-0.7g, (NH4)2SO4 0.95-1.lg,CaCl2 0.1-0.15g，葡萄糖10_20g，KH2PO4 0.9-1.2g，痕量金屬元素溶液0.5_3mL，復(fù)合維生素溶液l-2mL ;發(fā)酵溫度控制在22-32°C，發(fā)酵100-144小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中每升基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基包括如下含量的組分:Na2SO4 ll-15g，MgSO4.7H20 2_4g，KCl 0.4-0.6g, K2SO4 0.5-0.7g,(NH4)2SO4 0.95-1.lg, CaCl2 0.1-0.15g，葡萄糖 30_60g，KH2PO4 0.9_1.2g，痕量金屬元素溶液0.5-3mL，復(fù)合維生素溶液1-2 mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:每升痕量金屬元素溶液包括如下含量的組分:MnCl2.4H20 2.7-3.3g, ZnSO4.7H20 2.5_3g，CoCl2.6H20 0.035-0.045g,Na2MoO4.2H20 0-0.045g, CuSO4.5H20 1.8-2.2 g, NiSO4.6H20 1.5-2.2g, FeSO4.7H208_16g，每升復(fù)合維生素溶液包括如下含量的組分:硫銨酸4-11 g，泛鈣酸1.3-5.1 g，維生素 B12 100-150 mg ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)的發(fā)酵過程中采取補(bǔ)料工藝，在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)之后向發(fā)酵液中持續(xù)補(bǔ)加基礎(chǔ)補(bǔ)料液，基礎(chǔ)補(bǔ)料液的補(bǔ)加速率為每小時(shí)注入發(fā)酵液總體積的0.1%-0.2% ;每升基礎(chǔ)補(bǔ)料液包括如下含量的組分:Na2SO422-30g，MgSO4.7H20 4_8g，KCl l_2g，K2SO4 2_3g, (NH4)2SO4 2_4g, CaCl2 0.5-0.8g,葡萄糖 600-900g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:根據(jù)步驟(1)微生物的發(fā)酵密度不同，步驟(2)的提油方案可分為兩種: 方案一: 當(dāng)微生物的發(fā)酵密度達(dá)到130g/L以上時(shí)，提油方法為:先將發(fā)酵液在鼓式干燥機(jī)中進(jìn)行干燥至水分含量小于10%的粉狀物質(zhì)，所得的粉狀物質(zhì)與濃度為0.1-0.15mol/L的稀硫酸溶液按1-1.5:1的質(zhì)量比混合，50-80 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌混合1_2小時(shí)，然后500-1000r/min離心2_3小時(shí)，離心所得沉淀為含油的物質(zhì)層，離心所得上清液為水層，含油的物質(zhì)層用有機(jī)溶劑正己烷萃取得到油脂類物質(zhì)，水層為生物質(zhì)廢液進(jìn)入步驟(3)重新利用； 方案二: 當(dāng)80g/L <微生物的發(fā)酵密度< 130g/L時(shí)，提油方法為:將發(fā)酵液放入沉淀罐中靜置沉淀24小時(shí)，抽掉上層清液，向沉淀物中加入體積濃度為5-10%的稀硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH至2-3，然后加熱至30-35°C保持1-2小時(shí)，冷卻至室溫，然后500-1000 r/min離心4_6小時(shí)，離心所得沉淀為含油的物質(zhì)層，離心所得上清液為水層，含油的物質(zhì)層用有機(jī)溶劑正己烷萃取得到油脂類物質(zhì)，水層為生物質(zhì)廢液進(jìn)入步驟(3)重新利用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:萃取時(shí)將含油的物質(zhì)層與有機(jī)溶劑按1:3-6的質(zhì)量比混合，攪拌混合40-60min，靜置分層，上層液為有機(jī)溶劑和DHA粗油，再將上層液放入減壓蒸餾器中除去有機(jī)溶劑得到DHA粗油。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(4)的發(fā)酵過程中采取補(bǔ)料工藝，在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)之后向發(fā)酵液中持續(xù)補(bǔ)加生物質(zhì)補(bǔ)料液，生物質(zhì)補(bǔ)料液的補(bǔ)加速率為每小時(shí)注入發(fā)酵液總體積的0.1%-0.2% ;每升生物質(zhì)補(bǔ)料液包括如下含量的組分:Na2S0422-30 g, MgSO4.7H20 4-8 g, KCl l_2g，K2SO4 2_3g，(NH4)2SO4 2_4g，CaCl2 0.5_0.8g，葡萄糖300-500 g，生物質(zhì)廢液的濃縮液II 300-400mL ;所述生物質(zhì)廢液的濃縮液II為生物質(zhì)廢液的濃縮液I在55-60°C下繼續(xù)蒸發(fā)水分，至含糖量大于500g/L、總含氮量大于50g/L而得。
8.根據(jù)權(quán)利要求 1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)和步驟(4)中富含不飽和脂肪酸的菌種選擇裂殖壺菌、隱甲藻、破囊壺菌中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)中接種量為基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基重量的1%_10%，步驟(4)中接種量為生物質(zhì)液體培養(yǎng)基重量的1%_10%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)和步驟(4)的發(fā)酵過程中都進(jìn)行通空氣培養(yǎng)，通入的空氣流量為1-3 vvm,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至24-48小時(shí)時(shí)控制通入的空氣含氧量為4-10%，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)48之后至72小時(shí)控制通入的空氣含氧量為3%以下，72小時(shí)之后空氣含氧量控制在0%。
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK104131044SQ201410262970
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】顧慧雅 申請(qǐng)人:顧慧雅