一種光可控atp生物合成體系及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種光可控ATP生物合成體系及其制備方法。該方法包括如下步驟：(1)制備光系統(tǒng)Ⅱ微球或光系統(tǒng)Ⅱ膠囊；(2)將所述光系統(tǒng)Ⅱ微球或所述光系統(tǒng)Ⅱ膠囊分散到含有二醛交聯(lián)劑的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液中進行吸附；然后繼續(xù)分散于含有光系統(tǒng)Ⅱ的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液中進行吸附；(3)將經(jīng)步(2)處理后的光系統(tǒng)Ⅱ微球或光系統(tǒng)Ⅱ膠囊分散到含有ATP合成酶的蛋白脂質(zhì)體溶液中進行吸附，即得到所述光可控ATP生物合成體系。本發(fā)明中，光系統(tǒng)II在3D(微納米球和微納米膠囊)表面固定，增大作用面積和適用性；尺寸、結(jié)構(gòu)和功能可調(diào)控：可根據(jù)實際需要，通過選擇不同的合成方法任意改變球或膠囊的尺寸、結(jié)構(gòu)并包裹額外的功能性囊壁成分。
【專利說明】一種光可控ATP生物合成體系及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種ATP合成體系及其制備方法，具體涉及一種光可控ATP生物合成 體系及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] ATP是生物體內(nèi)的"能量貨幣"，在能量代謝過程中有重要作用。它為細胞內(nèi)的多 種耗能過程提供能量并參與調(diào)控多種生化過程，如神經(jīng)傳導(dǎo)、新陳代謝、肌肉收縮、生物發(fā) 光和物質(zhì)運輸?shù)鹊?。由于其多樣化的功能，如果能在亞細胞水平上模擬細胞中ATP的可控 合成，就將能夠?qū)崿F(xiàn)對多種生物過程的精細控制和研究。
[0003] 在生物體內(nèi)ATP是由ATP合酶催化合成的。利用ATP合酶構(gòu)建仿生體系的組裝結(jié) 構(gòu)就可以實現(xiàn)在人工載體上ATP合成的精細化控制，從而不僅能夠為由ATP驅(qū)動的納米雜 化器件（如分子馬達）提供動力，也可以為耗能的生化過程提供能量。細胞內(nèi)ATP的合成 至少需要兩個必要條件：嵌在閉合膜中的ATP合酶、膜兩側(cè)存在質(zhì)子梯度。因此，對ATP仿 生合成過程的研究主要集中于如何在膜兩側(cè)構(gòu)建質(zhì)子動力勢以推動ATP合酶的旋轉(zhuǎn)。
[0004] 質(zhì)子動力勢的來源主要有以下兩種：利用酸堿度不同的緩沖液直接形成和誘導(dǎo)體 系自身發(fā)生酸堿變化。體系自身發(fā)生變化又分為底物響應(yīng)（如葡萄糖氧化酶催化葡萄糖分 解產(chǎn)生葡萄糖酸）和光響應(yīng)兩種。其中光響應(yīng)由于其無需在反應(yīng)體系中外加溶液、對體系 干擾小、適用于封閉體系、光刺激易于添加和終止、適于長時間實驗、在空間范圍易控制等 優(yōu)勢受到研究人員的關(guān)注。目前，光響應(yīng)產(chǎn)生質(zhì)子梯度的研究集中于嵌在膜內(nèi)的質(zhì)子泵細 菌視紫紅質(zhì)和色素衍生物類小分子化合物。
[0005] 光系統(tǒng)II是一種光響應(yīng)的蛋白復(fù)合物，它能夠吸收傳遞轉(zhuǎn)換光能，分解水產(chǎn)生質(zhì) 子。它的活性功能的維持不完全依賴于嵌在膜內(nèi)，因此大大擴展了光響應(yīng)產(chǎn)生質(zhì)子梯度的 研究和應(yīng)用。目前尚無利用光系統(tǒng)II蛋白作質(zhì)子來源推動ATP合成的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種光可控ATP生物合成體系及其制備方法，在光照下，本 發(fā)明提供的ATP生物合成體系可產(chǎn)生ATP。
[0007] 本發(fā)明所提供的光可控ATP生物合成體系的制備方法，包括如下步驟：
[0008] (1)制備光系統(tǒng)II微球或光系統(tǒng)II膠囊；所述光系統(tǒng)II微球為光系統(tǒng)II微米球或 光系統(tǒng)II納米球，所述光系統(tǒng)II膠囊為光系統(tǒng)II微米膠囊或光系統(tǒng)II納米膠囊；
[0009] (2)將所述光系統(tǒng)II微球或所述光系統(tǒng)II膠囊分散到含有二醛交聯(lián)劑的2-(N-嗎 啡啉）乙磺酸緩沖液中進行吸附；然后繼續(xù)分散于含有光系統(tǒng)II的2-(N-嗎啡啉）乙磺酸 緩沖液中進行吸附；
[0010] (3)將經(jīng)步（2)處理后的光系統(tǒng)II微球或光系統(tǒng)II膠囊分散到含有ATP合成酶的 蛋白脂質(zhì)體溶液中進行吸附，即得到所述光可控ATP生物合成體系。
[0011] 通過所述方法，通過交聯(lián)劑中醛基的作用，形成了西佛堿的結(jié)構(gòu)，從而將光系統(tǒng)II 和ATP連接起來。
[0012] 上述的制備方法中，所述光系統(tǒng)II微米球的粒徑為1?20μπι，如2μ-- ;
[0013] 所述光系統(tǒng)II納米球的粒徑為200?900nm，如500nm ;
[0014] 所述光系統(tǒng)II微米膠囊的粒徑為1?20 μ m，如5 μ m ;
[0015] 所述光系統(tǒng)II納米膠囊的粒徑為200?900nm。
[0016] 上述的制備方法中，所述二醛交聯(lián)劑可為戊二醛、氧化海藻酸鈉、氧化肝素或氧化 纖維素，所述氧化海藻酸鈉、所述氧化肝素和所述氧化纖維素均能通過高碘酸氧化得到，即 將海藻酸鈉、肝素或纖維素中的羥基氧化成醛基。
[0017] 上述的制備方法中，步驟⑵中，所述2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液的pH值可為 5?8,如6, 2-(N_嗎啡啉）乙磺酸的摩爾濃度可為10?100mmol/L。
[0018] 上述的制備方法中，步驟（2)中，所述含有二醛交聯(lián)劑的2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩 沖液中，所述二醛交聯(lián)劑的質(zhì)量百分含量可為0.001?0.5%，如0.025% ;
[0019] 所述含有光系統(tǒng)II的2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液中，所述光系統(tǒng)II的濃度可為 0· 01 ?lmg chl/mL,如 0· 3 ?0· 5mg chl/mL、0. 3mg chl/mL 或 0· 5mg chl/mL。
[0020] 上述的制備方法中，步驟（3)中，所述含有ATP合成酶的蛋白脂質(zhì)體溶液中，所述 ATP合成酶的摩爾濃度可為20?500nmol/L，具體可為100?200nmol/L、150?200nmol/ L、100nmol/L、150nmol/L或200nmol/L，蛋白脂質(zhì)體的濃度可為1?10mg/mL，具體可為2? 8mg/mL、5 ?8mg/mL、2mg/mL、5mg/mL 或 8mg/mL〇
[0021] 上述的制備方法中，步驟（1)中，在制備所述光系統(tǒng)II微球或所述光系統(tǒng)II膠囊 的過程中添加蛋白質(zhì)、聚合物、明膠、膠原、透明質(zhì)酸或海藻酸鈉，以利于長時間維持蛋白活 性，如在制備過程中添加牛血清蛋白。
[0022] 本發(fā)明的制備方法中，所用的光系統(tǒng)II為一種能夠吸收光能催化水分解產(chǎn)生質(zhì) 子的反應(yīng)中心蛋白，具體可為光系統(tǒng)II核心復(fù)合物或富含光系統(tǒng)II的類囊體膜；具體可來 自于藍藻、菠菜、萵苣等植物。
[0023] 本發(fā)明提供的制備方法還包括重復(fù)步驟（2)至少一次的步驟。
[0024] 本發(fā)明進一步提供了由上述方法制備得到的光可控ATP生物合成體系。
[0025] 所述光可控ATP生物合成體系含有ADP。
[0026] 本發(fā)明提供的光可控ATP生物合成體系可用于產(chǎn)生ATP，具體在光照下進行，如在 采用的光源為氙燈或白熾燈，具體可為單色光或復(fù)合光。
[0027] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0028] (1)質(zhì)子梯度來源為光系統(tǒng)II分解水產(chǎn)生的質(zhì)子，與現(xiàn)有方法不同；
[0029] (2)光系統(tǒng)II在3D (微納米球和微納米膠囊）表面固定，增大作用面積和適用性；
[0030] (3)尺寸、結(jié)構(gòu)和功能可調(diào)控：可根據(jù)實際需要，通過選擇不同的合成方法任意改 變球或膠囊的尺寸、結(jié)構(gòu)并包裹額外的功能性囊壁成分；
[0031] (4)可自發(fā)熒光：由于囊壁成分之間形成了西佛堿的化學(xué)鍵，因而可自發(fā)熒光；
[0032] (5)可長時間保存：保存30天以上體系分散性良好，仍維持光照產(chǎn)生ATP的能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1為實施例1制備的PSII微球的透射電鏡照片。
[0034] 圖2為實施例1制備的PSII微球的激光共聚焦顯微圖。
[0035] 圖3為實施例1制備的PSII微球-ATP合酶體系在光照下產(chǎn)生ATP的數(shù)據(jù)圖。

【具體實施方式】
[0036] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038] 下述實施例中所用的光系統(tǒng)II的提取方法如下：
[0039] 取新鮮菠菜葉，洗凈，4°C下放置。在攪拌機中把菠菜葉攪拌成米粒大小，用紗布過 濾。取濾液離心，收集葉綠體，放入低滲溶液（20mMTricine，50mMNaCl，5mMMgCl 2，pH8. 0)中 漲破，攪拌離心，取沉淀物用高滲緩沖液（0. 4M蔗糖，20mM MES，50mM NaCl，5mM MgCl2, pH6. 5) 洗漆，勻楽至2mg chl/mL。滴加20% Triton X-100,攪拌處理30分鐘，離心，取沉淀，反復(fù) 洗滌去除多余Triton X-100,所得則為富含光系統(tǒng)II的類囊體膜。
[0040] 下述實施例中所用的ATP合成酶的提取方法如下：
[0041] 取新鮮菠菜葉，洗凈，4°C下放置。在攪拌機中把菠菜葉攪拌成米粒大小，用紗布過 濾。取濾液離心，收集葉綠體，放入低滲溶液（20mMTricine，50mMNaCl，5mMMgCl 2, pH8. 0) 中漲破，攪拌離心，取沉淀物用高滲緩沖液（0. 4M鹿糖，20mM Tricine，50mM NaCl，5mM MgCl2， pH7. 0)洗漆，勻楽至5mg chl/mL。加入等體積提取緩沖液（20mM Tricine，20mM NaCl，5mM MgCl2,60mM辛基葡萄糖苷，pH7. 0)，4°C下攪30分鐘，離心取上清液，加入硫酸銨粉末，離心 收集沉淀，分散沉淀物得粗蛋白溶液，把粗蛋白溶液在濃度依次為60 %、52 %、44 %、36 %、 28 %和20%的蔗糖密度梯度溶液中離心分離，則得到ATP合成酶溶液。
[0042] 實施例1、制備光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系
[0043] (1)共沉淀制備光系統(tǒng)II凝膠微球
[0044] (a)用二次水配置0. 33M的氯化鈣和碳酸鈉溶液，等體積混合，同時加入用20mmol MES (2-(N-嗎啡啉）乙磺酸）緩沖液（pH值為6)配制的20mg/mL的BSA (牛血清蛋白）溶 液0. 5mL及2mg/mL的光系統(tǒng)II溶液0. 5mL，迅速混合均勻攪拌40s，靜置2min，離心收集得 到BSA和光系統(tǒng)II共沉淀的碳酸鈣微球。
[0045] (b)把碳酸鈣微球分散在含0· 025wt % GA (戊二醛）的MES (2- (N-嗎啡啉）乙磺 酸）溶液中，交聯(lián)3h，離心洗滌，用0. 1M EDTA去除模板碳酸鈣粒子；繼續(xù)分散在含0. 3mg chl/mL光系統(tǒng)II的MES溶液中，交聯(lián)3h.
[0046] (c)離心洗滌后，重復(fù)步驟（b)，再在小球外層交替交聯(lián)一層GA和光系統(tǒng)II即得 到BSA/PSII/GA共價交聯(lián)的凝膠小球，直徑為2微米左右。將小球分散在緩沖液中4°C保 存。以上步驟均在暗中和4°C中進行。
[0047] 該步驟制備的BSA/PSII/GA共價交聯(lián)的凝膠小球的透射電鏡照片如圖1所示，激 光共聚焦顯微圖如圖2所示，由兩圖可知，本實施例制備的微球結(jié)構(gòu)均勻，分散性好，有自 熒光性質(zhì)（通過共聚焦顯微鏡觀察在無外加熒光劑的情況下仍有熒光則可說明是有自熒 光）。
[0048] (2)制備含ATP合酶的蛋白脂質(zhì)體
[0049] 把提取得到的ATP合成酶溶液與去垢劑溶液10% Triton-100和緩沖液混合，加入 500 μ L10mg/mL的脂質(zhì)體溶液中，4°C攪拌lh，隨后依次加入Bio-beads (生物珠子）室溫攪 拌lh，重復(fù)3次，即得到蛋白脂質(zhì)體溶液，液氮中保存。ATP合成酶的終濃度為200nM，蛋白 脂質(zhì)體的終濃度為8mg/mL。
[0050] (3)制備光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系
[0051] 把步驟（1)制備的光系統(tǒng)II凝膠微球分散到步驟（2)制備的蛋白脂質(zhì)體溶液中， 震蕩均勻，吸附40min，4°C離心洗滌。加入含5mM ADP和10mM NaH2P04的MES溶液至終體積 為2mL,在室溫下暗置lh。
[0052] 本實施例制備的光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系的活性測定：
[0053] 將本實施例制備的光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系置于經(jīng)5cm水浴和紅光濾片處理 的氙燈光源前光照。在光照的不同時間點，從體系中取出i〇yL的樣品，加入到熒光素-熒 光素酶ATP測量體系（ENLITENATPAssaySystem)中，用發(fā)光儀測量發(fā)光信號，從而計算出 體系中ATP的含量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，與非光照樣品相比較，光照后本發(fā) 明的體系中ATP濃度持續(xù)上升，實現(xiàn)了光響應(yīng)的ATP仿生合成，證明本發(fā)明的系統(tǒng)II/ATP 合酶組裝體系能夠產(chǎn)生ATP。
[0054] 將本實施例制備的光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系在4°C下避光放置30天后，取出按 上述方法測量其活性，觀察到光照后ATP的產(chǎn)量維持了 50%。
[0055] 實施例2、制備光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系
[0056] (1)制備光系統(tǒng)II微膠囊
[0057] 將粒徑為5微米的碳酸錳粒子分散到含有0. 2M氯化鈉的2mg/mL聚丙烯酰胺的溶 液中吸附30min后，離心分離，充分洗滌，再分散到含有0. 025Wt% GA的溶液中，反應(yīng)3h，充 分洗滌，再分散到含有〇. 5mg/mL光系統(tǒng)II、2mg/mL BSA的40mmol MES緩沖溶液（pH = 6) 中，振湯吸附4h，GA上的基與蛋白的氣基反應(yīng)，從而把蛋白固定在微粒表面，完成了 ^ 組裝周期，依次重復(fù)吸附GA、光系統(tǒng)II的操作，直到所需的層數(shù)。用0. 1M EDTA去除模板碳 酸錳粒子，即得到BSA/PSII/GA共價交聯(lián)的直徑為5微米的微膠囊。微膠囊分散在緩沖液 中4 C保存。
[0058] (2)含ATP合成酶的蛋白脂質(zhì)體的制備同實施例1中步驟（2)，所不同的是ATP合 成酶的終濃度為150nM，蛋白脂質(zhì)體的終濃度為5mg/mL。
[0059] (3)制備光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系
[0060] 實施例制備的光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系的活性測定：
[0061] 同實施例1中，不同之處在于：光源為氙燈光源經(jīng)過680nm帶通濾光片過濾。結(jié)果 表明：隨著光照時間的增長，本實施例制備的光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系持續(xù)產(chǎn)生ATP。
[0062] 實施例3、制備光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系
[0063] (1)制備光系統(tǒng)II微球
[0064] 將粒徑為500nm的二氧化硅粒子分散到含0. 2M氯化鈉的lmg/mL聚丙烯酰胺的溶 液中吸附30min后，離心分離，充分洗滌，再分散到含有0. 025Wt% GA的溶液中，反應(yīng)3h，充 分洗滌，再分散到含有〇. 5mg/mL光系統(tǒng)II、2mg/mL BSA的40mmol MES緩沖溶液（pH = 6) 中，振蕩吸附4h，完成了一個組裝周期，依次重復(fù)吸附GA、光系統(tǒng)II的操作，直到所需的層 數(shù)。納米二氧化硅粒子是生物相容的，對質(zhì)子無影響，可不除核。得到了直徑為500nm左右 的微球。小球分散在緩沖液中4°C保存。
[0065] (2)含ATP合酶的蛋白脂質(zhì)體的制備同實施例1中步驟（2)，所不同的是ATP合成 酶的終濃度為ΙΟΟηΜ，蛋白脂質(zhì)體的終濃度為2mg/mL。
[0066] (3)制備光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系
[0067] 實施例制備的光系統(tǒng)II/ATP合酶組裝體系的活性測定：
[0068] 同實施例1中，不同之處在于：光源為紅光單色光源。結(jié)果表明：隨著光照時間的 增長，實施例制備的光系統(tǒng)Π /ATP合酶組裝體系持續(xù)產(chǎn)生ATP。
【權(quán)利要求】
1. 一種光可控ATP生物合成體系的制備方法，包括如下步驟： (1) 制備光系統(tǒng)II微球或光系統(tǒng)II膠囊；所述光系統(tǒng)II微球為光系統(tǒng)II微米球或光系 統(tǒng)II納米球，所述光系統(tǒng)II膠囊為光系統(tǒng)II微米膠囊或光系統(tǒng)II納米膠囊； (2) 將所述光系統(tǒng)II微球或所述光系統(tǒng)II膠囊分散到含有二醛交聯(lián)劑的2-(N-嗎啡 啉）乙磺酸緩沖液中進行吸附；然后繼續(xù)分散于含有光系統(tǒng)II的2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩 沖液中進行吸附； (3) 將經(jīng)步（2)處理后的光系統(tǒng)II微球或光系統(tǒng)II膠囊分散到含有ATP合成酶的蛋白 脂質(zhì)體溶液中進行吸附，即得到所述光可控ATP生物合成體系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述光系統(tǒng)II微米球的粒徑為1? 20 μ m ； 所述光系統(tǒng)II納米球的粒徑為200?900nm ; 所述光系統(tǒng)II微米膠囊的粒徑為1?20μπι; 所述光系統(tǒng)II納米膠囊的粒徑為200?900nm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于：所述二醛交聯(lián)劑為戊二醛、氧化 海藻酸鈉、氧化肝素或氧化纖維素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)中，所述 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液的pH值為5?8, 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸的摩爾濃度為10? 100mmol/L〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)中，所述含有二 醛交聯(lián)劑的2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液中，所述二醛交聯(lián)劑的質(zhì)量百分含量為0. 001? 0. 5% ； 所述含有光系統(tǒng)II的2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液中，所述光系統(tǒng)II的濃度為0. 01? lmg chl/mL〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的制備方法，其特征在于：步驟（3)中，所述含有 ATP合成酶的蛋白脂質(zhì)體溶液中，所述ATP合成酶的摩爾濃度為20?500nmol/L，蛋白脂質(zhì) 體的濃度為1?10mg/mL。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)中，在制備所述 光系統(tǒng)II微球或所述光系統(tǒng)II膠囊的過程中添加蛋白質(zhì)、聚合物、明膠、膠原、透明質(zhì)酸或 海藻酸鈉。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項所述方法制備的光可控ATP生物合成體系。
9. 權(quán)利要求8所述的光可控ATP生物合成體系在產(chǎn)生ATP中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用在光照下進行；所述光照所用 的光源為氙燈或白熾燈。
【文檔編號】C12P19/32GK104059954SQ201410264588
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】李峻柏, 馮熙云, 蔡鵬 , 賈怡, 費進波, 董偉光, 李潔齡 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所