利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法及應(yīng)用。該方法以嗜熱厭氧梭菌初級(jí)腳手架蛋白基因設(shè)計(jì)引物；設(shè)計(jì)引物對(duì)A和引物對(duì)B；使用引物A擴(kuò)增得到的cipA與線性化的質(zhì)粒載體連接，得到陽(yáng)性質(zhì)粒，用作陽(yáng)性對(duì)照并與引物對(duì)B結(jié)合起來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為不同模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光定量PCR反應(yīng)出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)Ct；抽提待測(cè)樣品中嗜熱厭氧梭菌的基因組，使用引物對(duì)B進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)樣品中的cipA基因片段拷貝濃度，即為嗜熱厭氧梭菌菌體數(shù)量。該方法用于檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌在不溶性底物中的生長(zhǎng)情況，與傳統(tǒng)方法相比，準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)便。
【專利說(shuō)明】利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法及應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于發(fā)酵和分子檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 嗜熱厭氧梭菌的方法及應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 嗜熱厭氧梭菌（又名熱纖梭菌，Clostridium thermocellum)是一種嚴(yán)格嗜熱厭 氧的纖維素降解細(xì)菌，能夠?qū)⒗w維素降解形成纖維二糖和纖維糊精，其中纖維二糖可進(jìn)一 步被利用產(chǎn)生乙醇和氫氣并伴隨著有機(jī)酸（如乙酸、乳酸）的釋放。在能夠降解纖維素的嗜 熱厭氧梭菌中，熱纖梭菌是降解纖維素速率最快的微生物之一，因此在纖維素生物降解和 纖維素酒精大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)方面具有很大的應(yīng)用潛力。利用這種細(xì)菌生產(chǎn)生物燃料具有以 下優(yōu)點(diǎn)：①發(fā)酵過(guò)程中不需要氧氣；②能夠降解多種復(fù)雜的碳水化合物（如淀粉、纖維素、 半纖維素和膠質(zhì)等），具有高效的胞外纖維素酶系統(tǒng)--纖維小體，能夠直接用于微生物的 轉(zhuǎn)化過(guò)程如聯(lián)合生物過(guò)程；③細(xì)胞的產(chǎn)量很低，較多的底物能夠轉(zhuǎn)化成代謝產(chǎn)物如乙醇和 氫氣等；④最適的生長(zhǎng)溫度為55?60°C，高溫既便于酒精的回收，也使污染的概率降低。
[0003] 在微生物培養(yǎng)過(guò)程中，微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的關(guān)系是研究的重點(diǎn)。針對(duì)嗜熱厭 氧菌在不溶性物底物木質(zhì)纖維素中的生長(zhǎng)測(cè)定，至今沒(méi)有很好的方法。常用的微生物生長(zhǎng) 測(cè)定方法--比濁法和干重法要求培養(yǎng)液不含非細(xì)胞固形物，否則將造成正偏差。長(zhǎng)期以 來(lái)人們用于測(cè)定嗜熱厭氧菌在不溶物底物木質(zhì)纖維素中的生長(zhǎng)的方法主要是依靠蛋白質(zhì) 含量來(lái)表征細(xì)胞的生長(zhǎng)，但費(fèi)時(shí)長(zhǎng)且操作繁瑣，而且只能間接表示細(xì)胞生長(zhǎng)，并沒(méi)有直接定 量測(cè)出細(xì)胞濃度。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方 法的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌在不 溶性底物中生長(zhǎng)狀態(tài)的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧 梭菌的方法，包括如下步驟：
[0008] (1)設(shè)計(jì)引物：根據(jù)GenBank中已報(bào)道的嗜熱厭氧梭菌（Clostridium thermocellum)初級(jí)腳手架蛋白基因 cipA序列設(shè)計(jì)引物；設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增目的基因 cipA的 引物對(duì)A和用于熒光定量PCR的引物對(duì)B，引物對(duì)A和引物對(duì)B相同或不同；當(dāng)引物對(duì)A和 引物對(duì)B不同時(shí)，引物A擴(kuò)增的片段包含引物對(duì)B擴(kuò)增的片段，即引物對(duì)B擴(kuò)增的片段與引 物A擴(kuò)增的片段的部分相同；
[0009] (2)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的建立：
[0010] ①基因組提?。簭氖葻釁捬跛缶崛』蚪M；
[〇〇11] ②目的基因 cipA的擴(kuò)增：以基因組為模板，以引物對(duì)A為PCR引物，進(jìn)行PCR，得 到目的基因 cipA ;
[0012] ③陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建：將步驟②得到的目的基因 CipA與線性化的質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn) 化入宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，篩選鑒定，得到陽(yáng)性質(zhì)粒；
[0013] (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：
[0014] ①質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中cipA基因片段拷貝數(shù)的測(cè)定：使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性質(zhì) 粒濃度，根據(jù)測(cè)定的核酸濃度，通過(guò)以下公式計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中cipA基因片段拷貝數(shù)：
[0015] 拷貝數(shù)
【權(quán)利要求】
1. 一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 設(shè)計(jì)引物：根據(jù)GenBank中已報(bào)道的嗜熱厭氧梭菌（Clostridium thermocellum) 初級(jí)腳手架蛋白基因 cipA序列設(shè)計(jì)引物；設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增目的基因 cipA的引物對(duì)A和用于 熒光定量PCR的引物對(duì)B，引物對(duì)A和引物對(duì)B相同或不同；當(dāng)引物對(duì)A和引物對(duì)B不同時(shí)， 引物A擴(kuò)增的片段包含引物對(duì)B擴(kuò)增的片段； (2) 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的建立： ① 基因組提?。簭氖葻釁捬跛缶崛』蚪M； ② 目的基因 cipA的擴(kuò)增：以基因組為模板，以引物對(duì)A為PCR引物，進(jìn)行PCR，得到目 的基因 cipA ; ③ 陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建：將步驟②得到的目的基因 cipA與線性化的質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化入 宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，篩選鑒定，得到陽(yáng)性質(zhì)粒； (3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立： ① 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中cipA基因片段拷貝數(shù)的測(cè)定：使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒濃 度，根據(jù)測(cè)定的核酸濃度，通過(guò)以下公式計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中cipA基因片段拷貝數(shù)： 拷貝數(shù)/
(堿基數(shù)X345);堿基數(shù)為陽(yáng)性質(zhì)粒 的喊基數(shù)； ② 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將已測(cè)定濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行熒光定量PCR，所用 的引物為引物對(duì)B ;以不同模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光定量PCR反應(yīng)出現(xiàn)熒光信號(hào) 的初始循環(huán)數(shù)Ct為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4) 檢測(cè)待測(cè)樣品中的嗜熱厭氧梭菌數(shù)量： ① 抽提待測(cè)樣品中嗜熱厭氧梭菌的基因組； ② 按步驟（3)②進(jìn)行熒光定量PCR，其中設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照中用水代 替模板，陽(yáng)性對(duì)照中的模板為步驟（2)制備的陽(yáng)性質(zhì)粒； ③ 將待測(cè)樣品的循環(huán)閾值Ct與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，得到待測(cè)樣品中的cipA基因片段拷貝 濃度，計(jì)算出的cipA基因片段的初始拷貝數(shù)即為嗜熱厭氧梭菌菌體數(shù)量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法，其特征在 于：所述的引物對(duì)B為PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物不超過(guò)300bp的引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法，其特征在 于： 步驟⑴中所述的引物對(duì)A為引物cipA(0rd)-F和引物cipA(0rd)-R; cipA(0rd)-F:5' -GGAATTCTACAACAGCAATCC-3' ； cipA(0rd)-R:5' -ATTGGATCATCTGACGGCGGT-3' ； 步驟⑴中所述的引物對(duì)B為引物cipA(Ql)-F和引物cipA(Ql)-R: cipA(Ql)-F:5, -GTAACGGCAGCTACAACGGAAT-3,； cipA(Ql)-R :5' -CTTTACCCCATACAAGAACACC-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法，其特征在 于： 步驟⑵②中所述的PCR的反應(yīng)條件為：94°C lmin ;94°C30s、50?65°C30s、72°C40s， 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72°C lOmin ; 所述的PCR的擴(kuò)增體系為：每100 μ L體系中各成分如下：Premix Taq50 μ L、引物對(duì)A 中的上下游引物各40nmol、基因組2 μ L,水為余量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法，其特征在 于： 步驟（2)③中所述的線性化的質(zhì)粒載體為T載體； 步驟（2)③中所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌宿主細(xì)胞； 步驟（2)③中所述的篩選鑒定先依據(jù)所選用的質(zhì)粒載體選擇相應(yīng)的抗生素進(jìn)行初篩， 再通過(guò)菌落PCR進(jìn)行鑒定，最后通過(guò)測(cè)序進(jìn)行陽(yáng)性質(zhì)粒的最后確定。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法，其特征在 于： 步驟（3)①中所述的紫外分光光度計(jì)為超微量紫外分光光度計(jì)； 步驟（3)@中所述的熒光定量？〇?的反應(yīng)條件為：951：3〇8;951：58、6〇1：348,40個(gè)循 環(huán)：95°C 15s,60°C lmin,95°C 15s ;劃?rùn)M線部分用于分析擴(kuò)增產(chǎn)物的熔點(diǎn)曲線，通過(guò)熔解峰 是否單一判斷產(chǎn)物的特異性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法，其特征在 于：所述的熒光定量PCR的擴(kuò)增體系為：2倍濃度的SYBR Premix Ex Taq ΠΙΟ μ L，引物對(duì) Β中的上下游引物各8nmol，50倍濃度染料ROX Reference Dye 110. 4yL，模板2yL，去離 子水補(bǔ)足至20 μ L。
8. 權(quán)利要求1?7任一項(xiàng)所述利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的方法的應(yīng) 用，其特征在于：所述的方法用于檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌在不溶性底物中的生長(zhǎng)情況。
9. 一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌在不溶性底物中生長(zhǎng)狀態(tài)的方法，其 特征在于包括如下步驟： (1) 在不溶性底物中培養(yǎng)嗜熱厭氧梭菌； (2) 取樣，按照權(quán)利要求1?7任一項(xiàng)所述利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌的 方法進(jìn)行檢測(cè)； (3) 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，得到嗜熱厭氧梭菌在不溶性底物中生長(zhǎng)狀態(tài)的數(shù)據(jù)。
10. 權(quán)利要求9所述利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)嗜熱厭氧梭菌在不溶性底物中生長(zhǎng)狀 態(tài)的方法的應(yīng)用，其特征在于：所述的方法用于評(píng)價(jià)不同不溶性底物的可降解性能。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK104087659SQ201410264687
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】朱明軍, 湯虹 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)