一種雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法，通過Solexa高通量測序技術(shù)鑒定與雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)的microRNA，并通過生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步分析microRNA相關(guān)靶基因的功能及其作用的信號通路，整合microRNA本身及其靶基因的信息，篩選出與腸炎沙門氏菌感染相關(guān)的microRNA。選擇腸炎沙門氏菌感染后第7天這一時(shí)間點(diǎn)，作為樣品采集點(diǎn)；對處理組和對照組中多個(gè)個(gè)體進(jìn)行混池測序，每個(gè)組內(nèi)的混池≥3；首次大規(guī)模分析鑒定與雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)的microRNA，將為深入研究microRNA在腸炎沙門氏菌感染中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為雞的分子抗病遺傳育種提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
【專利說明】—種雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)為革蘭氏陰性菌,是世界公認(rèn)的食源性致病菌之一，不僅對蛋雞生產(chǎn)造成重大影響，而且它能通過家禽副產(chǎn)品給人類的健康帶來很大的威脅。這種病菌主要是通過動(dòng)物性食源致人中毒甚至死亡，主要包括肉、蛋和奶及相關(guān)制品等。沙門氏菌能侵入細(xì)胞內(nèi)部釋放毒素，侵入過程為首先在自己表面形成一個(gè)針狀突起用來和目標(biāo)細(xì)胞接觸，一些特殊的蛋白通過此針狀突起到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而使沙門氏菌細(xì)胞侵入到目標(biāo)細(xì)胞中釋放毒性蛋白。
[0003]microRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20~25個(gè)核苷酸。microRNA作為重要的基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子廣泛參與發(fā)育、凋亡、腫瘤、免疫和機(jī)體-微生物相互作用等生理病理過程。microRNA可對宿主天然免疫和獲得性免疫進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，包括細(xì)菌、病毒感染。
[0004]近年來，Solexa高通量測序技術(shù)成為各物種microRNA分析鑒定的有力工具，并且與病毒感染相關(guān)的雞microRNA已有研究。目前還沒有通過Solexa測序鑒定與雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法，選擇腸炎沙門氏菌感染后第7天這一時(shí)間點(diǎn)，作為樣品采集點(diǎn)；利用Solexa方法對處理組和對照組中多個(gè)個(gè)體(> 6)進(jìn)行混池測序，每個(gè)組內(nèi)混池> 3 ;首次大規(guī)模分析鑒定與雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)的mic1RNA，將為深入研究microRNA在腸炎沙門氏菌感染中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為雞的分子抗病育種提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。其具體技術(shù)方案為:
[0006]—種雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法,包括以下步驟:
[0007]I)將雞分為試驗(yàn)組與對照組，試驗(yàn)組接種腸炎沙門氏菌，對照組接種磷酸鹽緩沖液(PBS)，接種后采集腸道組織樣品，提取總RNA。
[0008]2)試驗(yàn)組隨機(jī)選取6-9個(gè)個(gè)體，混池建3個(gè)庫(Tpl，Tp2，Τρ3)，對照組隨機(jī)選取5-6個(gè)個(gè)體,混池建3個(gè)庫(Cpl, Cp2, Cp3)。用Illumina Hiseq2000測序平臺所構(gòu)建文庫
進(jìn)行高通量測序。
[0009]3)測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過引物與接頭序列去除，并經(jīng)過對測序片段堿基的質(zhì)量檢驗(yàn)和長度篩選，最終選擇質(zhì)量可靠的測序片段。然后統(tǒng)計(jì)microRNA的種類及數(shù)量，并對microRNA長度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0010]4)參考基因組比對[0011]將樣本預(yù)處理后的凈讀數(shù)(clean read)與參考基因組序列比對。與已知microRNA前體及成熟體比對統(tǒng)計(jì)信息
[0012]5) Rfam數(shù)據(jù)庫比對
[0013]選取Rfam數(shù)據(jù)庫來注釋測序得到的miCToRNA序列，盡可能的發(fā)現(xiàn)并去除其中可能的核糖體RNA,胞質(zhì)microRNA,核仁microRNA,核內(nèi)RNA,轉(zhuǎn)運(yùn)RNA。
[0014]6) microRNA 表達(dá)量計(jì)算
[0015]非編碼microRNA表達(dá)量計(jì)算是將與參考基因組序列匹配的干凈讀數(shù)(來自過濾后數(shù)據(jù))采用cufflink軟件,并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算每條microRNA表達(dá)量。microRNA表達(dá)量計(jì)算采用FPKM(每I百萬個(gè)比對上的片段中比對到外顯子的每I千個(gè)堿基上的片段數(shù)目)計(jì)算度量指標(biāo)，計(jì)算microRNA區(qū)間內(nèi)microRNA表達(dá)量。
[0016]7)microRNA差異表達(dá)分析及新microRNA的預(yù)測
[0017]根據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果，用P < 0.05作為差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0018]8) microRNA革巴基因預(yù)測
[0019]針對差異表達(dá)分析得到的microRNA,利用miRanda算法預(yù)測差異microRNA的(已知，潛在或預(yù)測的)革巴基因(Target Gene)。miRanda算法從(l)microRNA-3 1非翻譯區(qū)序列匹配、與(2)能量穩(wěn)定性評估計(jì)算的二步計(jì)算預(yù)測步驟，綜合預(yù)測microRNA的靶基因。3'非翻譯區(qū) 來自加州大學(xué)圣克魯茲分?；蚪M生物信息學(xué)中心(UCSCGenomeB1informatics)和ENSEMBLE數(shù)據(jù)庫中基因的3'非翻譯區(qū)序列。為了進(jìn)行差異microRNA靶基因的功能分析，進(jìn)一步從靶基因結(jié)果中選取可信度得分更好的結(jié)果。篩選標(biāo)準(zhǔn)是:得分> 200 ；自由能< -20千卡/摩爾(kcal/mol)。
[0020]9) microRNA靶基因基因本體(GO)功能分析
[0021]基因本體功能聚類常用于對目標(biāo)組基因特征進(jìn)行功能注釋與分類，即差異表達(dá)mic1RNA靶基因的功能聚類(富集度)分析。分別對基因本體中生物學(xué)過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組分(CC)進(jìn)行富集度分析。本分析方法采用基因本體注釋系統(tǒng)，針對高度可信度靶基因預(yù)測結(jié)果展開分析。富集度分析采用超幾何分布算法，并采用多重假設(shè)檢驗(yàn)校驗(yàn)超幾何分布統(tǒng)計(jì)量的P值，獲得校正后P值，即Q值，選擇P < 0.05作為基因本體富集的標(biāo)準(zhǔn)。
[0022]10) microRNA靶基因信號通路功能分析
[0023]生物通路分析采用京都基因與基因組百科全書(KEGG)生物通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集度分析(Enrichment Analysis)。富集度分析采用超幾何分布算法,并采用多重假設(shè)檢驗(yàn)校驗(yàn)超幾何分布統(tǒng)計(jì)量的P值，獲得校正后P值，即Q值，選擇P < 0.05作為信號通路富集的標(biāo)準(zhǔn)。
[0024]優(yōu)選地,所述相關(guān)microRNA具體為:
[0025]gga-miR-490-5p 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: I 所示；
[0026]gga-miR-216a 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示；
[0027]gga-miR-193a-3p 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 所示；
[0028]gga-miR-133b 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:4 所示；
[0029]gga-miR-215-5p 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:5 所示；
[0030]gga-miR-147其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；[0031]gga-miR-1662 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:7 所示。
[0032]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0033]本發(fā)明可以通過Solexa高通量測序技術(shù)鑒定與雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)的microRNA,并通過生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步分析microRNA相關(guān)祀基因的功能及其作用的信號通路，整合microRNA本身及其靶基因的信息，篩選出與腸炎沙門氏菌感染相關(guān)的microRNAο
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是不同長度讀數(shù)數(shù)的分布圖，其中圖1a為對照組不同長度讀數(shù)數(shù)目的分布圖，圖1b為試驗(yàn)組不同長度讀數(shù)數(shù)目的分布圖；
[0035]圖2是顯著富集的免疫相關(guān)基因本體-生物學(xué)過程類別；
[0036]圖3是顯著富集的基因本體-分子功能類別；
[0037]圖4是顯著富集的信號通路。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0039]將白來航蛋雞分為試驗(yàn)組與對照組，試驗(yàn)組接種腸炎沙門氏菌，對照組接種磷酸鹽緩沖液(PBS)，接種后第7天采集小腸組織樣品，用試劑盒提取總RNA。
[0040]試驗(yàn)組隨機(jī)選取9個(gè)個(gè)體，混池建3個(gè)庫(Tpl，Tp2,Tp3)，對照組隨機(jī)選取9個(gè)個(gè)體，混池建3個(gè)庫(Cpl, Cp2，Cp3)。
[0041]利用Solexa高通量測序技術(shù)對樣品進(jìn)行高通量測序。
[0042]原始數(shù)據(jù)經(jīng)過引物與接頭序列去除，并經(jīng)過對測序片段堿基的質(zhì)量檢驗(yàn)和長度篩選，最終選擇質(zhì)量可靠的測序片段(表1)。
[0043]統(tǒng)計(jì)microRNA (sRNA)的種類(用unique表示)及數(shù)量(用total表示)，并統(tǒng)計(jì)microRNA的長度分布(圖1)。
[0044]測序結(jié)果采用bowtie軟件與參考基因組比對,將microRNA定位到相應(yīng)染色體,統(tǒng)計(jì)各染色體上讀數(shù)的數(shù)目(表2)。
[0045]利用生物信息學(xué)方法計(jì)算試驗(yàn)組與對照組間各microRNA的差異表達(dá)，得到差異表達(dá)microRNA數(shù)目和倍數(shù)變化(表3)。
[0046]預(yù)測差異表達(dá)的microRNA的靶基因，并對靶基因進(jìn)行基因本體和信號通路分析(圖 2-4)。
[0047]綜合差異表達(dá)microRNA及其靶基因功能分析結(jié)果，得出與腸炎沙門氏菌感染相關(guān)的 microRNA。
[0048]表1:各文庫測序獲得的讀數(shù)
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將白來航蛋雞分為試驗(yàn)組與對照組，試驗(yàn)組接種腸炎沙門氏菌，對照組接種磷酸鹽緩沖液，接種后第7天采集腸道組織樣品，用試劑盒提取總RNA ； 2)試驗(yàn)組隨機(jī)選取6-9個(gè)個(gè)體，混池建3個(gè)庫:Tpl，Τρ2，Τρ3，對照組隨機(jī)選取5_6個(gè)個(gè)體，混池建3個(gè)庫:Cpl, Cp2, Cp3 ； 3)采用IlluminaHiseq2000測序平臺的單端50bp測序模式對樣本進(jìn)行高通量測序； 4)測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)引物與接頭序列去除，并經(jīng)過對測序片段堿基的質(zhì)量檢驗(yàn)和長度篩選，最終選擇質(zhì)量可靠的測序片段用于后續(xù)分析； 5)統(tǒng)計(jì)microRNA的種類及數(shù)量,并對microRNA做長度分布統(tǒng)計(jì)； 6)參考基因組比對 將樣本預(yù)處理后的干凈數(shù)據(jù)讀數(shù)與參考基因組序列比對，已知microRNA前體及成熟體比對統(tǒng)計(jì)信息； 7)Rfam數(shù)據(jù)庫比對 選取Rfaml0.1數(shù)據(jù)庫來注釋測序得到的mic1RNA序列，盡可能的發(fā)現(xiàn)并去除其中可能的核糖體RNA,胞質(zhì)microRNA,核仁microRNA,核內(nèi)RNA,轉(zhuǎn)運(yùn)RNA ； 8)microRNA表達(dá) 量計(jì)算 非編碼microRNA表達(dá)量計(jì)算是將與參考基因組序列匹配的干凈讀數(shù)，采用cufflink軟件，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算每條microRNA表達(dá)量，microRNA表達(dá)量計(jì)算采用FPKM計(jì)算度量指標(biāo)，計(jì)算microRNA區(qū)間內(nèi)microRNA表達(dá)量； 9)microRNA差異表達(dá)分析及預(yù)測新microRNA IO) microRNA靶基因預(yù)測 針對差異表達(dá)分析得到的microRNA，利用miRanda算法預(yù)測來自比對組所得到的差異microRNA的祀基因，miRanda算法從(DmicroRNA-S'非翻譯區(qū)序列匹配與(2)能量穩(wěn)定性評估計(jì)算的二部計(jì)算預(yù)測步驟綜合預(yù)測microRNA的靶基因； IDmicroRNA靶基因基因本體功能分析 基因本體功能聚類常用于對目標(biāo)組基因特征進(jìn)行功能注釋與分類，即差異表達(dá)microRNA的預(yù)測靶基因的功能聚類分析，采用基因本體注釋系統(tǒng)，針對高度可信度靶基因預(yù)測結(jié)果展開分析，富集度分析采用超幾何分布算法，并采用多重假設(shè)檢驗(yàn)校驗(yàn)超幾何分布統(tǒng)計(jì)量的P值，獲得校正后P值，即Q值； 12)microRNA靶基因生物通路功能分析 生物通路分析采用京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集度分析； 13)腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的鑒定 整合microRNA本身結(jié)果與其靶基因功能分析結(jié)果，獲得雞與腸炎沙門氏菌感染相關(guān)的 microRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞腸炎沙門氏菌感染相關(guān)microRNA的檢測方法，其特征在于，所述相關(guān)microRNA具體為: gga-miR-490-5p其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； gga-miR-216a其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； gga-miR-193a-3p其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；gga-miR-133b其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；gga-miR-215-5p其核苷酸序列如SEQID NO:5所示；gga-miR-147其核苷酸序列如SEQID NO:6所示；gga-miR-1662 其核苷酸序列如SEQID NO:7所示。
【文檔編號】C12Q1/04GK104032016SQ201410267885
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】李顯耀, 吳桂賢, 劉麗英, 齊玉凱, 王莎莎 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)