一種細粒棘球蚴檢測試劑盒及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種細粒棘球蚴檢測試劑盒，由無菌去離子水、PCR反應液、TaqDNA聚合酶、GoldViewDNA染料、溴酚藍上樣緩沖液、標準品、對照品組成，PCR反應液由PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、檢測用引物組成。本發(fā)明試劑盒即可快速、準確地檢測出被檢標本中的細粒棘球蚴DNA，也可用于細粒棘球蚴感染的分子流行病學調查及療效監(jiān)測。本試劑盒的模板DNA制備步驟簡單費用低，尤其是大規(guī)模檢測時，不僅省時省力而且節(jié)省了大量的試劑和耗材，提高了工作效率。本試劑盒是建立在分子生物學基礎上的一種敏感性高、特異性強的檢測方法，提高檢測準確率，降低假陽性率，可在檢測細粒棘球蚴這種食源性寄生蟲中的應用。
【專利說明】一種細粒棘球蚴檢測試劑盒及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術，涉及一種檢測細粒棘球蚴這種食源性寄生蟲的試劑盒，可 以對感染細粒棘球蚴的標本進行鑒別檢測。

【背景技術】
[0002] 棘球蚴病，俗稱包蟲病，是由帶科棘球屬的細粒棘球絳蟲阪 的幼蟲寄生于人、牛、羊、豬等動物的肝臟、肺、腦、脾等多種臟器引起的疾病。
[0003] 棘球蚴病呈世界性分布，導致全球性的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟問題，受到人們的普遍關 注。細粒棘球蚴能感染牛、羊、豬、馬、駱駝等家畜以及多種野生動物和人。細粒棘球蚴對動 物機體的危害主要是對臟器的機械性壓迫作用和毒素作用，導致臟器萎縮、機能障礙。動物 的臨床癥狀隨寄生部位和感染數(shù)量的不同差異明顯，輕度感染或初期癥狀均不明顯。由于 蚴體生長力強，體積大，不僅壓迫周圍組織使之萎縮和功能障礙，還易造成繼發(fā)感染，如果 蚴體包囊破裂，可引起過敏反應，往往造成動物嚴重的病癥，甚至死亡。棘球蚴病的癥狀和 體征千變萬化，靠臨床診斷有一定的困難，常引起忽視或誤診，從而延誤救治時機而引起嚴 重損失，所以準確診斷棘球蚴病并及時治療是控制該病比較有效的方法。
[0004] 對棘球蚴病的防治中，避免吞食含有細粒棘球蚴的內臟是最有效的預防措施。因 此，要控制棘球蚴病的流行必須嚴格控制食源性寄生蟲病在畜禽中流行，把好屠宰檢疫關。 然而，目前食品安全衛(wèi)生問題非常嚴峻，但屠宰檢疫技術卻相當落后，極易造成漏檢。這嚴 重影響了肉品質量，同時也給消費者的健康造成巨大威脅。因此，對棘球蚴病建立一種操作 簡單、快速、敏感、特異的檢測方法勢在必行。PCR方法是一種操作簡單、敏感性高、特異性強 的分子生物學檢測方法，它可以在一個反應體系中擴增DNA樣本的目的基因片段，特別適 用于感染的大量臨床樣本的快速診斷。因此，建立細粒棘球蚴PCR快速檢測方法，可為臨床 上防治該病提供科學依據(jù)，而且對提高動物疫病的檢測、監(jiān)控水平，保障動物源性食品安全 具有重要意義。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種細粒棘球蚴檢測試劑盒，該試劑盒由無菌去離子水、PCR 反應液、DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚藍上樣緩沖液、標準品、對照品組成。 PCR反應液由PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、檢測用引物組成。
[0006] 檢測用引物分別為檢測細粒棘球蚴的上游引物和下游引物共2條， 細粒棘球蚴上游引物（SEQ ID No :1) :5' -CGTTTGTTGCGTTAGGGTG-3'， 細粒棘球蚴下游引物（SEQ ID No :2) :5' -AACCACGAGCGTCAACCTG-3'。
[0007] 標準品為細粒棘球蝴(及的重組質粒，其核苷酸序列如SEQ ID No :3 所示。
[0008] 對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陽性對照為有細粒棘球蚴DNA片段的DNA 樣品，陰性對照為無細粒棘球蚴DNA的DNA樣品。
[0009] 本試劑盒保存于-20 °C，盡量減少反復凍融。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述試劑盒在檢測細粒棘球蚴這種食源性寄生蟲中 的應用。
[0011] 本發(fā)明試劑盒使用方法： 每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。標準品用無菌去離子水稀釋為60 ng/μ 1。
[0012] 1. PCR反應管制備：總體積為25 μ 1，PCR反應液于冰上融化及制備PCR反應管。 依次取PCR反應液22. 8 μ 1，7? DNA聚合酶0· 2 μ 1，濃度60 ng/ μ 1的樣品DNA (待檢測 樣本、標準品、陽性對照品、陰性對照品）2 μ 1于PCR反應管中混合。用手指輕彈制備好的 PCR反應管或用微量移液器吹打混勻，瞬時高速離心2 s。
[0013] 2.擴增檢測：把PCR反應管置于PCR儀上，設置反應條件為：95 °C預變性5 min， 94 °C變性45 s、59 °C退火45 s、72 °C延伸60 s共30個循環(huán)，72 °C延伸8min，4 °C保存。
[0014] 3.檢測結果判定：將1 g瓊脂糖溶于100 ml的0. 5 XTBE電泳緩沖液中，然后加入 5 μ 1 GoldView DNA染料，混勻后煮沸，傾倒凝膠板。凝膠冷卻凝固后，將PCR產物8 μ 1與 適量上樣緩沖液混合，加入凝膠孔中進行電泳。電泳結束后取出凝膠置于紫外燈下觀察、拍 照。標準品孔和陽性對照孔均有目的條帶而陰性對照孔無任何條帶說明PCR反應檢測成 功。被檢樣本孔出現(xiàn)的電泳條帶與標準品孔、陽性對照孔相應條帶大小一致則判定為陽性， 反之則為陰性。
[0015] 本發(fā)明提供了一種細粒棘球蚴單重PCR檢測試劑盒，其優(yōu)點是一個反應即可快 速、準確地檢測出被檢標本中的細粒棘球蚴DNA，也可用于細粒棘球蚴感染的分子流行病學 調查及療效監(jiān)測。本方法的模板DNA制備步驟簡單費用低，尤其是用于大量樣品的大規(guī)模 檢測時，不僅省時省力而且節(jié)省了大量的試劑和耗材，提高了工作效率。本方法是建立在分 子生物學基礎上的一種敏感性高、特異性強的檢測方法，大大提高了檢測準確率，降低了假 陽性率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是細粒棘球蚴標準品的PCR產物電泳結果。
[0017] 圖2是細粒棘球蚴陽性樣本的PCR檢測結果。
[0018] 圖3是本發(fā)明對采集的部分標本檢測結果。

【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明結合附圖和具體實施例作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用于說明 目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0020] 實施例一 本發(fā)明提供一種細粒棘球蚴檢測試劑盒，該試劑盒由無菌去離子水、PCR反應液、 DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚藍上樣緩沖液、標準品、對照品組成。 PCR反應液有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、檢測用引物組成。
[0021] 檢測用引物分別為檢測細粒棘球蚴的上游引物和下游引物共2條(表1): 表：u.!

【權利要求】
1. 一種細粒棘球蚴檢測試劑盒，其特征在于，由無菌去離子水、PCR反應液、DNA聚 合酶、GoldView DNA染料、溴酚藍上樣緩沖液、標準品、對照品組成，其特征在于，PCR反應液 由PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、檢測用引物組成，檢測用引物分別為 ： 細粒棘球蚴上游引物：5'-CGTTTGTTGCGTTAGGGTG-3'， 細粒棘球蚴下游引物：5'-AACCACGAGCGTCAACCTG-3'， 標準品為細粒棘球蝴(凡的重組質粒，其核苷酸序列如SEQ IDNo :3所示， 對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陽性對照為有細粒棘球蚴DNA片段的DNA樣品，陰性 對照為無細粒棘球蚴DNA的DNA樣品。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種細粒棘球蚴檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒保存于-20 °C，盡量減少反復凍融。
3. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒在檢測細粒棘球蚴中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104059973SQ201410268876
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權日:2014年6月16日
【發(fā)明者】杜愛芳, 俞穎超, 卓洵輝, 陽毅敏 申請人:浙江大學