一種利用氫氣提高白樺細胞中總三萜和白樺脂醇含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種利用氫氣提高白樺細胞中總三萜和白樺脂醇含量的方法。以白樺懸浮細胞為材料，按50g/L接種量接種于100mL?B5液體培養(yǎng)基中，附加0.1～0.3mg/L6-BA和0.5～4.0mg/L?TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白1g/L，pH5.5～6.0。在細胞懸浮培養(yǎng)第8天通入氫氣使其終濃度為0.5-1.5mmol/L，培養(yǎng)12h后收獲，白樺脂醇含量最高為1.11mg/gDW，是對照組185.1％。培養(yǎng)24h后收獲，細胞內總三萜含量達到24.37mg/gDW，為對照組的181.32％。氫氣具有無毒無害的優(yōu)勢，方便代謝產物的分離和純化。該發(fā)明為解決天然植物藥物來源緊缺和工業(yè)化大規(guī)模生產白樺三萜和白樺脂醇藥物提供了一種新途徑。
【專利說明】一種利用氫氣提高白樺細胞中總三萜和白樺脂醇含量的方 法

【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及氫氣促進次生代謝物的合成，它屬于生物工程【技術領域】。

【背景技術】：
[0002] 氫是自然界廣泛存在且分子結構最簡單的元素，宇宙中90%的成分是由氫組成 的。氫氣是無色、無嗅、無味、具有一定還原性的雙原子氣體。在潛水醫(yī)學領域，氫氣被廣泛 應用于高深入的氫氧混合潛水過程中。氫氣的溶解度比較低，且不能被機體大量吸收，所 以，人們一直沒有重視氫在高等生物體內的作用。氫氣的還原性是氫氣最重要的化學性質， 我們在中學就學習過，氫氣可以還原加熱氧化銅為銅。但是許多人并不知道，氫氣還具有獨 特的生物學特征，過去生物學領域一直認為氫氣屬于生理性惰性氣體，認為氫氣是沒有任 何生物學效應的氣體。但是自2007年國際著名雜志《Nature Medicine》報道，氫氣具有神 奇的選擇性抗氧化作用，患者只需要呼吸35min濃度為2%的氫氣，就可以非常有效地治療 腦缺血再灌注損傷。呼吸氫氣也可以治療新生兒腦缺血缺氧后腦病。隨后，氫氣在植物學、 基礎醫(yī)學和臨床轉化研究方面成為新的研究熱點。認為氫氣的巨大應用潛力還沒有真正得 到認識。
[0003] 到目前為止，國際上關于氫氣生物醫(yī)學的研究論文已經接近500篇，平均2天就增 加1篇。由于氫氣在醫(yī)學上沒有可以借鑒的領域，作為一種治療性氣體，目前最有效的方式 是通過飲用氫氣飽和水，臨床應用可以通過呼吸氫氣氧氣混合氣體和注射氫氣飽和溶液。
[0004] 實驗表明氫水，h2吸入，和腹膜內、靜脈內注射氫的飽和鹽水對活性氧引起的疾病 都具有保護作用。這些研究中所積累的證據表明，H 2可以保護各種細胞，組織和器官免受氧 化損傷。在細菌和藻類中H2的代謝已經進行了許多調查。一些早期的研究表明在一些高 等植物中H 2演變和吸收發(fā)光的樹葉和假設存在的氫化酶。然而，在高等植物中很少有研究 審查制氫的生理作用和支持這一進程的機制。
[0005] 近年來，利用植物離體培養(yǎng)技術生產有用次生代謝物質的研究取得了很大的進 展，如紫草細胞生產紫草素、人參細胞培養(yǎng)生產皂甙、洋地黃細胞培養(yǎng)生產生物堿等都達到 工業(yè)化的生產規(guī)模，用長春花細胞培養(yǎng)生產抗癌生物堿已經達到了中試水平（劉春朝等， 1997 ;胡立勇，2004)。然而次生代謝產物的低產現象是制約細胞培養(yǎng)植物天然產物技術 產業(yè)化應用的核心問題之一，理解和掌握植物細胞次生代謝調控規(guī)律是解決這一問題的基 礎。雖然，國內外研究者針對植物培養(yǎng)細胞中次生代謝物低產問題進行了研究，包括優(yōu)質細 胞系的選育、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、培養(yǎng)技術改進以及活性物質合成關鍵酶基因的克隆等（郭 肖紅等，2005 ;徐茂軍，2009 ;錢丹丹等，2011)。但到目前為止，植物細胞中次生代謝物的低 產問題仍未得到很好的解決。
[0006] 白樺（Betula platyphylla suk)樹葉和樹皮中含有重要的次生代謝產物白 樺三萜（TBP)，主要類型包括羽扇豆烷型、達瑪烷型、齊墩果烷型三萜物質（Zhang，2003)， 是極具開發(fā)潛力的抗癌、治療心血管疾病、護肝的先鋒藥物（李薇，2000 ;葉銀英，2000， 2001)。與初生代謝相比，植物次生代謝具有非常強的可調控性。針對植物培養(yǎng)細胞中天然 活性物質的低產問題，國內外研究者進行了大量的研究探索。研究探討植物細胞中與次生 代謝產物合成有關的機制不但有助于掌握植物次生代謝的調控規(guī)律而且對生產實踐中解 決植物培養(yǎng)細胞次生產物低產問題具有重要意義。針對能促進白樺三萜合成的作用，研究 其調控白樺懸浮培養(yǎng)細胞中三萜合成的分子機制，重點探討H 2誘導對三萜合成的影響等， 建立氫氣調控白樺三萜合成的技術體系，為解決植物細胞培養(yǎng)生產次生代謝物中低產的問 題提供可靠而穩(wěn)定的技術。
[0007] 本發(fā)明的內容：
[0008] 為保護白樺自然資源，建立可持續(xù)開發(fā)利用的資源生產程序，利用無毒無害的氫 氣誘導來自白樺誘導的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細胞，進行總三萜和白樺脂醇的合成與生產， 同時利用高效液相色譜法進行定量檢測。為進行工業(yè)化法大規(guī)模生產總三萜和白樺脂醇類 藥物的提供了新方法。
[0009] 實施方案：
[0010] (1)懸浮細胞的培養(yǎng)
[0011] 在超凈工作臺上，切下腋芽，用70%酒精浸泡5min，再用5%的次氯酸鈉溶液消毒 10-20min，然后放于已滅菌的培養(yǎng)皿中，接種到預先經過高溫高壓滅菌的各種組合的培養(yǎng) 基上（NT+L Omg/L水解酪蛋白+3%蔗糖+0· 5?4 Omg/LBA，(λ 2?4 Omg/L NAA)進行愈傷 組織的誘導。每瓶接種大約3-5個腋芽。先用暗培養(yǎng)一周后進行光培養(yǎng)。培養(yǎng)約7周后， 獲得愈傷組織。愈傷組織經過繼代培養(yǎng)后，迅速增殖。
[0012] 選擇細胞生長速度快，松散且總三萜物質含量高的愈傷組織，進行繼代和懸浮培 養(yǎng)。并在有利于白樺懸浮細胞生長和次生代謝產物積累的B5+0. 1?0. 3mg/L6-BA+0. 5? 4. Omg/LTDZ懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞系。獲得高產白樺三萜和白樺脂醇懸浮細胞系，經過濾， 烘干，粉碎，有機溶劑（95%乙醇）提取步驟，利用液相色譜方法對白樺酯醇和白樺脂醇檢 測和定量分析。
[0013] ⑵白樺酯醇的提取和測定
[0014] 白樺酯醇的提取和測定采用范桂枝等2007,張澤等2004的方法。提取試劑：95% 乙醇；提取方法：超聲波提取法；測定方法：高效液相色譜法，檢測波長210nm，流動相為 乙腈和水（V:V = 8:2)，流速 1. OmL/min。
[0015] 本專利具有以下特點：
[0016] 1)氫氣處理具有無毒無害的優(yōu)勢，同時生產環(huán)境不受地域、季節(jié)、水質、病蟲害、氣 候等自然環(huán)境的影響。
[0017] 2)生產周期短，生產過程不產生大量廢渣廢水，安全無污染，具有生態(tài)效益。
[0018] 3)培養(yǎng)的白樺懸浮細胞具有生產白樺三萜和白樺脂醇等多種物質的能力，實現了 白樺天然植物資源及其藥用成分的開發(fā)利用。
[0019] 4)利用高效液相色譜方法進行白樺脂醇進行檢測，方法簡單，提取溶劑清潔無毒， 操作方便。
[0020] 5)為解決抗艾滋病和抗腫瘤天然藥物來源緊缺，加速臨床大規(guī)模應用，提供一種 新途徑，具有很高的經濟效益和社會效益。

【具體實施方式】
[0021] 1)植物材料來源
[0022] 白樺取自東北林業(yè)大學白樺強化種子園內的優(yōu)樹。選擇腋芽，消毒后接種到預 先經過高溫高壓滅菌的各種組合的培養(yǎng)基上（NT+1. Omg/L水解酪蛋白+3 %蔗糖+0. 5? 4. Omg/LBA，0. 2?4. Omg/L NAA)進行愈傷組織的誘導。愈傷組織經過繼代培養(yǎng)后，迅速增 殖。挑選生長狀態(tài)良好的愈傷組織將其多次繼代后轉移至液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。經過6代 以上的轉接，建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)細胞體系，懸浮培養(yǎng)繼代周期為15d，接種量為5g細胞于 100mL液體培養(yǎng)基中。2)培養(yǎng)條件
[0023] 以白樺懸浮細胞為實驗材料，按50g/L接種量接種于100mL B5液體培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)條件為：120印111，251：，光照強度200(^，光周期1611，濕度40%?50%，培養(yǎng)周期為10(1。 培養(yǎng)基成分為B5基本培養(yǎng)基，附加激素及濃度為0. 0. 1-0. 3mg/L6-BA和0. 5-4mg/L TDZ，蔗 糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L，pH5. 5?6. 0,121°C高溫高壓滅菌20min。
[0024] 3)富氫水的制備添加
[0025] 將SHC型氫氣發(fā)生器（購自山東塞克塞斯氫能源有限公司）的氫氣輸出口插入已 滅菌蒸餾水中半個小時，蒸餾水即變?yōu)?9. 99%的富氫水，在白樺懸浮細胞培養(yǎng)至第8天時 添加入培養(yǎng)基中，終濃度分別為〇. 5-1. 5mmol/L，添加后12至24h收獲細胞。
[0026] 4)總三萜的提取及含量測定
[0027] 精密稱取0.05g細胞干樣，加入2ml95%乙醇并浸泡24h。70°C水浴lh后再超聲 40min，取lOOyL上清液于10ml離心管中并置于70°C水浴蒸干。加入200μ?5%香草醛-冰 乙酸和800μ L高氯酸，70°C水浴15min，冰上迅速冷卻。乙酸乙酯定容至5ml后測定其在 551nm的吸光值（對照組為200 μ L5%香草醛-冰乙酸+800微升高氯酸+4ml乙酸乙酯）。
[0028] 總三萜的標準曲線以齊墩果酸為標準品進行繪制，其回歸方程為y = 45. 036x+0. 0417,，相關系數R2 = 0. 9983,齊墩果酸在0. 005?0. 025mg/mL含量范圍內具 有良好的線性關系。
[0029] 5)白樺脂醇的提取及含量測定
[0030] 白樺脂醇的提取參照范桂枝等2007,張澤等2004的方法法，具體方法如下：精密 稱取0. 5g細胞干樣，加入25mL鹽酸-乙醇溶液（2 : 8)，加熱回流3h，放冷，搖勻并濾過， 精密量取續(xù)濾液15mL，加蒸餾水15mL，置于80°C水浴上蒸去乙醇，然后用乙醚萃取3次，每 次20mL，合并乙醚萃取液并于40°C低溫蒸干，加 lml甲醇溶解殘渣，并將其用0. 45 μ m有機 濾膜濾過，此為樣品檢測液，然后利用高效液相色譜進行檢測。
[0031] 高效液相色譜（HPLC)檢測條件：用Waters公司600-717-2487色譜系統(tǒng)，色譜 柱HiQ sil C18V4. 6_X250mm ;流動相為乙腈：水=9 :1 ;柱溫25°C ;靈敏度16AUFS ;流速 1. OmL/min ;檢測波長 210nm，進樣 20uL。
[0032] 白樺脂醇線性關系考察：精密吸取濃度為0. 5mg/mL的白樺脂醇標準品溶液0. 2、 0.4、0.6、0.8、11^，分別置于511^容量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2(^1^ 進樣，測定其峰面積積分值。以濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。白 樺脂醇回歸方程為：Y = 3E+06X-128674。結果表明，白樺脂醇在0. 2?lmg/ml范圍內具有 良好的線性關系。
[0033] 本發(fā)明的效果：本發(fā)明利用氫氣來促進細胞生產三萜的能力，獲得的白樺總三萜 和白樺脂醇含量大大提高。由上述技術方案，以白樺懸浮細胞為材料進行實驗，其結果是： 氫氣處理后，白樺脂醇含量最高為1. Ilmg/gDW，是對照組185. 1%。培養(yǎng)12-24h后收獲，細 胞內總三萜含量達到24. 37mg/gDW，為對照組的181. 32%。因此，這是一種很有工業(yè)應用前 景的白樺總三萜和白樺脂醇的生產方法。
[0034] 附圖1 :白樺固體愈傷組織
[0035] 附圖2:白樺懸浮細胞
[0036] 附圖3 :白樺脂醇標準品出峰圖
[0037] 附圖4 :H2處理白樺脂醇出峰圖
[0038] 附圖5 :總三萜含量測定的標準曲線（以齊墩果酸為標準品）
[0039] 附圖6 :白樺脂醇含量測定的標準曲線。
【權利要求】
1. 本發(fā)明專利提出氫氣促進白樺三萜合成技術為：以白樺懸浮細胞為實驗材料，按 5〇g/L接種量接種于lOOmL B5液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：120rpm，25°C，光照強度20001x， 光周期16h，濕度40 %?50 %，培養(yǎng)周期為10d。培養(yǎng)基成分為B5基本培養(yǎng)基，附加激素 及濃度為〇. 1?〇. 3mg/L6-BA和0. 5?4. Omg/L TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L， pH5. 5?6. 0,121 °C高溫高壓滅菌20min。在細胞懸浮培養(yǎng)第8天加入富氫水使其終濃 度為0. 5-1. 5mmol/L，培養(yǎng)12至24h后收獲，白樺脂醇含量最高為1. Ilmg/gDW，是對照組 185. 1%，細胞內總三萜含量達到24. 37mg/gDW，為對照組的181. 32%。
2. 根據權利要求書1所述的方法，其中的液體培養(yǎng)基為為B5基本培養(yǎng)基，附加激素及 濃度為〇· 1?〇· 3mg/L6-BA和0· 5?4. Omg/L TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L。
3. 根據權利要求書1所述的方法，其中的白樺細胞接種量為5g鮮細胞含50ml培養(yǎng)液 的100ml三角瓶中，搖床轉速120r/min。
4. 根據權利要求書1所述的方法，其中富氫水是通過SHC型氫氣發(fā)生器制備而得的，在 懸浮培養(yǎng)第八天加入，培養(yǎng)周期為10天，且富氫水的終濃度為〇. 5-1. 5mmol/L。
5. 根據權利要求書1所述的方法，其中的收獲時間為富氫水添加12-24h后收獲懸浮細 胞。
6. 根據權利要求書1所述的方法，其中氫氣處理后白樺脂醇含量最高為1. Ilmg/gDW， 是對照組185. 1%。細胞內總三萜含量達到24. 37mg/gDW，為對照組的181. 32%。
【文檔編號】C12P33/00GK104087644SQ201410270442
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權日:2014年6月18日
【發(fā)明者】曾凡鎖, 姜濤, 詹亞光, 辛穎, 孫豐坤, 齊鳳慧, 范桂枝, 由香玲, 尹靜 申請人:東北林業(yè)大學, 曾凡鎖, 姜濤