一種稀少精子體外培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種稀少精子體外培養(yǎng)基，含有以下組分：氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸鉀、乳酸鈣、碳酸氫鈉、葡萄糖、丙酮酸鈉、谷氨酰胺、?；撬帷⒓和煽蓧A、L-天冬酰酸、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、依地酸、慶大霉素、酚紅。本發(fā)明優(yōu)點在于：本發(fā)明的稀少精子體外培養(yǎng)基與以往傳統(tǒng)洗精液不同，特別適用于臨床嚴重少、弱精子癥、睪丸及附睪獲取的精子樣本體外處理和培養(yǎng)，以提高少、弱精子和睪丸精子的運動能力，使單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射操作時尋找有運動能力的精子變得容易而安全。
【專利說明】一種稀少精子體外培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種稀少精子體外培養(yǎng)基，具體地說，是一種用于特殊精子的體外處 理、培養(yǎng)，以提高精子運動能力的體外培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前全世界約有20%育齡夫婦患有不孕癥，不孕癥中男性原因占50%左右，而在 男性不育癥中約60%以上，原因為少、弱精子癥，甚至為無精子癥。自1992年卵胞漿內(nèi)單精 子注射（ICSI)技術(shù)問世以來，使精液中無精子的患者可利用睪丸、附睪中獲取的精子去生 育一個自己的孩子。但是睪丸精子不具有運動能力或僅有微弱的震顫運動力，顯微鏡下直 接觀察睪丸穿刺物中的精子時無法確定其死活。盡管通過體外培養(yǎng)可以使部分睪丸精子產(chǎn) 生活動力，但活動力較弱，很少出現(xiàn)前向運動精子，仍有多數(shù)精子并未出現(xiàn)活動力。
[0003] 隨著輔助生殖技術(shù)在男性不育治療中的應(yīng)用，促進了通過體外培養(yǎng)來提高精子運 動和受精能力的研究。目前有許多人嘗試著將許多物質(zhì)：像血清、腹腔液、卵泡液和其他的 化學修飾藥物如孕酮、腺苷類似物和甲基黃嘌呤等用來提高人精子的運動和受精能力。但 是市面上尚沒有一種專門針對少、弱精子，睪丸精子的體外培養(yǎng)的專門培養(yǎng)液。
[0004] 中國專利文獻CN103805559A公開了一種用于精液樣品洗滌或精子培養(yǎng)保存的精 子洗滌培養(yǎng)液，其特征是含有一定濃度的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NGF)，能夠明顯提高精液樣品中的 精子活力和存活率。中國專利文獻CN103352025A公開了改善人精子運動能力的體外培養(yǎng) 液及其應(yīng)用，該培養(yǎng)液含有果糖6-磷酸（F6P)，該發(fā)明改善人精子運動能力的體外培養(yǎng)液， 對離體后純化的人精子進行培養(yǎng)，除了維持精子運動還能顯著提高了正常人精子的活力， 為改進輔助生育技術(shù)提供了有意義的參考。但是關(guān)于一種用于特殊精子的體外處理、培養(yǎng)， 以提高精子運動能力的體外培養(yǎng)基目前還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對市面上輔助生殖技術(shù)使用的各種培養(yǎng)液中沒有一種專門針 對少、弱精子，睪丸精子的體外培養(yǎng)的專用培養(yǎng)液而研發(fā)，提供一種稀少精子體外培養(yǎng)基。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是，提供一種稀少精子體外培養(yǎng)基的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是，提供一種體外處理稀少精子的方法。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種稀少精子體外培養(yǎng)基，每升所述 的培養(yǎng)基中含有以下組分：氯化鈉98. 0 mmol、氯化鉀4. 5 mmol、硫酸鎂0. 20 mmol、磷酸鉀 0. 35 mmol、乳酸興 21. 4 mmol、碳酸氧納 20. 0 mmol、葡萄糖 2. 90 mmol、丙麗酸納 0. 33 mmol、 谷氨酰胺1. 〇 mmol、牛磺酸〇. 1 mmol、己酮可可堿2. 0 mmol、L-天冬酰酸0. 1 mmol、L-天冬 氨酸 0· 1 mmol、甘氨酸 1. 0 mmol J腦氨酸 0· 1 mmol、L_ 絲氨酸 0· 1 mmol、依地酸 lOOumol、 慶大霉素1. 〇 mmol、〇. 5%酚紅1 ml。
[0009] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的培養(yǎng)基在稀少精子體 外處理和培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0010] 所述的稀少精子為臨床嚴重少、弱精子癥、睪丸及附睪獲取的精子。
[0011] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種體外處理稀少精子的方 法，包括以下步驟：將獲取的精子置Modified-HTF 1. 5ml液中處理，離心后去上清后，添加權(quán) 利要求1所述的稀少精子體外培養(yǎng)基lml，再置5% C02箱中培養(yǎng)30分鐘至3小時。
[0012] 本發(fā)明優(yōu)點在于： 1、 本發(fā)明通過綜合各種化學物質(zhì)組合的培養(yǎng)基，將它用于培養(yǎng)精液中無活動能力的 少、弱活精子，能明顯刺激那些原本精液中微弱擺動，不前向運動的精子產(chǎn)生活動，并且對 精子生存能力無明顯的影響； 2、 本發(fā)明的稀少精子體外培養(yǎng)基與以往傳統(tǒng)洗精液不同，特別適用于臨床嚴重少、弱 精子癥、辜丸及附辜獲取的精子樣本體外處理和培養(yǎng)，以提商少、弱精子和辜丸精子的運動 能力，使單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射（ICSI)操作時尋找有運動能力的精子變得容易而安全。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1.稀少精子處理流程。
[0014] 圖2.稀少精子體外培養(yǎng)基使用前后運動精子數(shù)比較。
[0015] 圖3.稀少精子體外培養(yǎng)基使用前后前向運動精子數(shù)比較。
[0016] 圖4. (Fitc-psa熒光染色）稀少精子頂體完整率的檢測。
[0017] 圖5. (Fitc-psa熒光染色）正常精子頂體完整率的檢測。
[0018] 圖6. (Fitc-psa熒光染色）精卵結(jié)合后，頂體發(fā)生反應(yīng)的精子。

【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0020] 實施例1 本發(fā)明的稀少精子體外培養(yǎng)基成分： 氯化鈉 98. 0 mmol/L、氯化鉀 4. 5 mmol/L、硫酸鎂 0. 20 mmol/L、磷酸鉀 0. 35 mmol/L、乳 酸隹丐21. 4 mmol/L、碳酸氧納20. 0 mmol/L、葡萄糖2. 90 mmol/L、丙麗酸納0. 33 mmol/L、谷 氨酰胺1. 〇 mm〇l/L、牛磺酸0. 1 mmol/L、己酮可可堿2. 0 mmol/L、L-天冬酰酸0. 1 mmol/L、 L-天冬氨酸 0. 1 mmol/L、甘氨酸 1. 0 mmol/L、L_ 脯氨酸 0. 1 mmol/L、L_ 絲氨酸 0. 1 mmol/L、 依地酸 l〇〇umol/L、慶大霉素 1. 0 mmol/L、0. 5% 酚紅 1 ml/L。
[0021] 稀少精子體外培養(yǎng)基使用步驟：見圖1，將睪丸精子獲取后或是體外獲取的精 液中，精子濃度少于2X10 6/ml，活動率小于10%的樣本，將其置Modified-HTF (Irvine Scientific company)l. 5ml液中處理，離心后去上清后，添加稀少精子體外培養(yǎng)基lml，再置 5% C02箱中培養(yǎng)30分鐘至3小時不等。
[0022] 實施例2 1、研究材料和方法 研究對象： (1)精液標本來源于醫(yī)院男科不育門診就診的11例少弱精癥患者的精子，.禁欲48h? 7d，手淫方式取精于干燥無菌的取精杯內(nèi)，60min內(nèi)完全液化。按WH05推薦方法進行精液常 規(guī)分析。
[0023] (2) 54例無精子癥患者顯微外科手術(shù)行睪丸活檢術(shù)獲取的精子進行分析。
[0024] 2、研究方法主要試劑 1) 含5% HSA的HTF培養(yǎng)液（美國Ivrine公司，90125); 2) 稀少精子體外培養(yǎng)基(采用實施例1所述的配比配置)。
[0025] 3、顯微外科手術(shù)獲取的睪丸精子，置含5% HSA的HTF培養(yǎng)液中，睪丸組織用剪刀 或用彎成7字形的注射器針頭體視鏡下處理完加入稀少精子體外培養(yǎng)液lml放入37°C、 5% c培養(yǎng)。處理后顯微鏡下計數(shù)精子濃度。
[0026] 4、體外獲取的少、弱精子待液化后顯微鏡下計數(shù)其濃度：將密度少于2X106/ml， 活動率小于 10% 的樣本，將其置 Modified-HTF (Irvine Scientific company) 1. 5ml 液中處 理，離心后去上清后，添加稀少精子體外培養(yǎng)基lml，再置5% C02箱中培養(yǎng)30分鐘至3小時 后。
[0027] 5、分別取部分組織觀察精子的活動力，測定精子存活率。取有存活精子的病例進 行冷凍保存。精子的活動力及存活率按WHO標準判斷。
[0028] 6、統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)以X±S表示，采用t檢驗。
[0029] 7、結(jié)果 從表1得知，65例嚴重少、弱精子樣本使用本發(fā)明研制的"稀少精子體外培養(yǎng)液"培養(yǎng) 2小時后觀察，原來不動的精子均有不同程度的活力改變；其中15例"輸精管缺如"患者通 過顯微取精后的樣本，體外培養(yǎng)2小時后有86. 7%的精子出現(xiàn)了前向運動。39例梗阻性無 精癥患者睪丸顯微手術(shù)取精后的樣本，體外培養(yǎng)2小時后可觀察到有74. 3%的精子出現(xiàn)前 向運動能力。另外11例外周獲取的少、弱精子樣本，體外培養(yǎng)2小時后觀察，出現(xiàn)前向運動 精子的比例占72.7%。

【權(quán)利要求】
1. 一種稀少精子體外培養(yǎng)基，其特征在于，每升所述的培養(yǎng)基中含有以下組分：氯化 鈉 98. 0 mmol、氯化鉀 4. 5 mmol、硫酸儀 0. 20 mmol、憐酸鉀 0. 35 mmol、乳酸?丐 21. 4 mmol、碳 酸氫鈉20. 0 mmol、葡萄糖2. 90 mmol、丙酮酸鈉0. 33 mmol、谷氨酰胺1. 0 mmol、?；撬?. 1 mmol、己酮可可喊2. 0 mmol、L_天冬酉先酸0· 1 mmol、L_天冬氨酸0· 1 mmol、甘氨酸1. 0 mmol、 L-脯氨酸0· 1 mmol、L-絲氨酸0· 1 mmol、依地酸100 umol、慶大霉素1. 0 mmol、0· 5%酚紅1 ml〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基在稀少精子體外處理和培養(yǎng)中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的稀少精子為臨床嚴重少、弱精子 癥、辜丸及附辜獲取的精子。
4. 一種體外處理稀少精子的方法，其特征在于，包括以下步驟：將獲取的精子置 Modified-HTF 1. 5ml液中處理，離心后去上清后，添加權(quán)利要求1所述的稀少精子體外培養(yǎng) 基lml，再置5% C02箱中培養(yǎng)30分鐘至3小時。
【文檔編號】C12N5/076GK104046590SQ201410270739
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】劉鋒, 高一豐, 李錚 申請人:郜鴻生物科技（上海）有限公司