基于微波超聲波技術的芝麻餅粕ace抑制肽的制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于微波超聲波技術的芝麻餅粕ACE抑制肽的制備方法及用途，屬于農產品加工領域。芝麻餅粕經過粉碎加水溶解，然后微波（超聲波）預處理，再在所得芝麻餅粕溶液中加入堿性蛋白酶酶解，對酶解體系施加超聲波輔助酶解、最后滅酶，離心，超濾，濃縮噴霧干燥得到粉末狀產品。該方法可以提高芝麻餅粕中蛋白的水解效率，提高酶的利用率。利用該方法制備的芝麻餅粕ACE抑制肽的ACE抑制活性高，多肽純度高。本發(fā)明實現(xiàn)了芝麻餅粕的深加工和綜合利用，對于提高其附加值具有重要意義。
【專利說明】基于微波超聲波技術的芝麻餅粕ACE抑制肽的制備方法及用途

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于ACE抑制肽制備【技術領域】，涉及基于超聲波技術的芝麻餅柏的ACE抑制肽的制備方法及用途。

【背景技術】
[0002]人體內的血壓受許多因素調節(jié)，來源于食品蛋白的ACE抑制肽可以抑制ACE活性而達到降血壓的作用，且安全性高，毒副作用小，成為了近幾年的研究熱點之一。芝麻是我國四大食用油料作物的佼佼者，在芝麻油制備過程中產生大量的芝麻餅柏下腳料。芝麻餅柏中含有豐富的蛋白質，多肽，氨基酸，礦物質，維生素，芝麻素等，營養(yǎng)價值豐富，其主要的用途是作為生產飼料的原料。應用單一。邵元龍等研究了芝麻多肽的水解工藝以及多肽的抗氧化活性。王連翠，唐張輝等利用酶法制備芝麻柏多肽研究得到了最佳水解工藝條件。然而，利用酶法制備芝麻餅柏ACE抑制肽，超濾得到分子量小于3kDa的小分子芝麻餅柏ACE抑制肽僅限于本課題組的報道。
[0003]超聲波技術，微波技術對于有效成分的提取，高分子的降解，酶解反應等都有很好的促進作用。并且具有高效、廉價、無污染、操作簡單、技術易推廣應用等特點。近年來，超聲波輔助原料酶解技術已經得到了廣泛的應用。微波技術的應用較多集中在有效成分的提取、合成方面，而應用到多肽制備及其功能特性的研究則較少。Sakaklbara等觀察到,在三種不同的超聲強度下蔗糖酶水解速度均高于對照。王猛等利用微波技術提取葡萄籽柏中的花青素，和常規(guī)工藝比，花青素的提取率高，提取時間短。然而利用超聲波或者微波對芝麻餅柏預處理，同時將超聲與芝麻餅柏的酶解過程相結合的研究僅限于本研究課題組的報生口 ο
[0004]基于該研究課題組的微波超聲波技術制備芝麻餅柏ACE抑制肽，可以提高蛋白水解效率，酶的利用率，降低生產成本。從而得到一種活性較高，純度高的ACE抑制肽。
[0005]
【發(fā)明內容】
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本發(fā)明的目的是將微波(超聲波)技術預處理原料芝麻餅柏，并且將超聲波技術應用到芝麻餅柏的酶解反應中，制備具有抑制體內ACE活性的芝麻餅柏ACE抑制肽的方法及用途。
[0006]本發(fā)明上述目的是通過以下技術手段實現(xiàn)的:先將芝麻餅柏粉碎，加微波(超聲波)處理溶解，然后用堿性蛋白酶進行ACE抑制肽的制備，同時在水解過程中施加超聲波，最后離心，超濾，濃縮并且噴霧干燥得到分子量小于3kDa的粉末產品。
[0007]基于超聲波技術的芝麻餅柏的ACE抑制肽的制備方法，按照下述步驟進行:
(1)對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:5.5~1:50的質量比加入水形成混懸液，采用頻率30MHz，功率為20~60W的微波處理2~8min ;或者是采用工作/間歇時間為2 s/4 s,頻率為20kHz，功率200~1000W，初始溫度30~70°C的超聲波處理5~30min。使其中蛋白溶解到水中形成水溶液；
(2)加入堿性蛋白酶進行酶解，酶的加入量為1000~5000u/g(酶活和底物質量比)，酶解溫度為30~70°C，pH為7~11，在酶解開始后對酶解體系采用，頻率為20 kHz，功率20~80W的超聲波處理，酶解時間為O~150min，酶解結束，停止超聲波處理。酶解結束后，酶解液90°C水浴15min滅酶，在自然冷卻到室溫。
[0008](3)離心取上清液真空抽濾(Φ9 cm)，選用截留分子量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子質量在3 kDa (截留分子量為IkDa的超濾膜可以使最大分子量為3kDa的物質通過)以下的產物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產品。
[0009]本發(fā)明采用微波預處理芝麻餅柏，超聲波輔助酶解，與經過同樣的酶解過程但是不施加微波、超聲波、不超濾的對照試驗相比，可以使ACE抑制肽的得率顯著提高，ACE抑制率從30.95%提高到了 68.34%，IC50值從6.03 mg/mL降到了 2.62mg/ml ;采用超聲波預處理芝麻餅柏，超聲波輔助酶解，與經過同樣的酶解過程但是不施加超聲波、不超濾的對照試驗相比，可以使ACE抑制肽的得率顯著提高的同時，ACE抑制率從30.95%提高到了 68.45%，IC50值從6.03 mg/mL降到了 2.75mg/ml。大大提高了酶解效率和產品活性。
[0010]

【具體實施方式】
[0011]本發(fā)明測定芝麻餅柏水解肽的ACE抑制率，IC50值(IC5tl值指的是對ACE抑制率達到50%時的多肽水溶液的濃度，該值越小，則表示其對ACE的抑制活性就越高)來反映芝麻餅柏水解物對ACE的抑制活性。
[0012]實施例1
對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，采用工作/間歇時間定為2 s/4 S、功率為400W，超聲處理20 min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻餅柏蛋白水溶液；以酶活1700 u/g (酶活和底物質量比)加入堿性蛋白酶(無錫杰能科生物工程有限公司，100000u/g)，溫度為46°C，pH值為8.88，功率為50W，其他條件和預處理的超聲波一樣，超聲處理24min后停止酶解,酶解液90°C水浴15min滅酶。自然冷卻至室溫，離心取上清液真空抽濾(Φ9 cm)，選用截留分子質量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子量在3 kDa下的產物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產品。測定ACE抑制率，IC50值，具體測定方法如下:
用6 mLpH 8.3,0.1 mol/L硼酸緩沖液溶解3 mg酶解產物，25 μ L ACE (I u ACE溶于10 mL的pH 8.3,0.1 mol/L的硼酸緩沖液中，該緩沖液含0.3 mol/L NaCl)加入到含10μ L樣品的離心管中，37°C保溫5 min，隨后加入6.5 mmol/L的馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-Hippury 1-L-histidyl-L-leucine, HHL) 40 μ L,在 37°C恒溫反應 30 min,加入 85 “1^濃度為I mol/L的HCl終止反應，同時用10 μ L的pH 8.3硼酸緩沖液作空白對照反應，所得反應液直接用于HPLC分析。
[0013]HPLC 條件=ZORBAX-C18 柱(4.6 X 150 mm,填料粒徑 5 μ m);檢測波長 228 nm ;進樣量8 μ L ;柱溫25°C ;流動相為超純水-乙腈(80:20，各含0.5%。三氟乙酸)；流速1.0 mL/min。計算公式如下:
R=(A-B)/A*100%
式中:R — ACE抑制率，% ；
A—空白對照組Hip的峰面積；
B—添加ACE抑制肽組Hip的峰面積。
[0014]稱取一定質量樣品配成不同濃度的溶液，以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪成圓滑的曲線，從曲線中計算IC5tl值。
[0015]對照試驗:對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，不施加超聲，再按照上述相同酶解過程處理，但是不施加超聲，酶解結束后的滅酶，離心，取上清液噴霧干燥以及測定方法均按照上述方法處理。
[0016]經過測定，對照組的酶解產物多肽的ACE抑制率為30.95%，IC50值為6.03mg/ml,實驗組的酶解產物多肽的ACE抑制率為72.5%，IC5tl值為3.82mg/ml?？梢姡谕冗^程條件下，伴隨著多肽的純度的提高，采用超聲波的酶解產物多肽的ACE抑制率顯著提高了，IC5tl值明顯降低了。
[0017]實例2
對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，功率為40W，微波處理5.5 min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻餅柏蛋白水溶液；以酶活1700 u/g (酶活和底物質量比)加入堿性蛋白酶(無錫杰能科生物工程有限公司，10000u/g)，溫度為46°C，pH值為8.88，采用工作/間歇時間定為2 s/4 S、功率為40W，超聲處理24min其他條件和預處理的超聲波一樣，超聲處理24min后停止酶解，酶解液90°C水浴15min滅酶。自然冷卻至室溫,離心取上清液真空抽濾(Φ9 cm),選用截留分子質量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子量在3 kDa下的產物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產品。測定水解產物多肽得率和ACE抑制率，IC5tl值，具體測定方法參照實例I。
[0018]對照試驗:對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，不施加微波，再按照上述相同酶解過程處理，但是不施加超聲，酶解結束后的滅酶，離心，超濾以及測定方法均按照上述方法處理。
[0019]經過測定，對照組的酶解產物多肽的ACE抑制率為28.25%，IC50值為5.73mg/ml,實驗組的酶解產物多肽的ACE抑制率為66.0%，IC5tl值為3.85mg/ml?？梢?，在同等過程條件下，伴隨著多肽的純度的提高，采用超聲波的酶解產物多肽的ACE抑制率顯著提高了，IC5tl值明顯降低了。
[0020]實例3
對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，采用工作/間歇時間定為2 s/4 S、功率為800W，超聲處理20 min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻餅柏蛋白水溶液；以酶活2500 u/g(酶活和底物質量比)加入堿性蛋白酶(無錫杰能科生物工程有限公司，100000u/g)，溫度為46°C，pH值為8.88，功率為40W，其他條件和預處理的超聲波一樣，超聲處理30min后停止酶解,酶解液90°C水浴15min滅酶。自然冷卻至室溫，離心取上清液真空抽濾(Φ9 cm)，選用截留分子質量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子量在3 kDa下的產物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產品。測定水解產物多肽得率和ACE抑制率，IC50值。具體測定方法參照實例I。
[0021]空白試驗參照實例I。
[0022]經過測定，對照組的酶解產物多肽的ACE抑制率為31.25%，IC50值為5.93mg/ml,實驗組的酶解產物多肽的ACE抑制率為66.70%，IC5tl值為3.80mg/ml?？梢?，在同等過程條件下，伴隨著多肽的純度的提高，采用超聲波的酶解產物多肽的ACE抑制率顯著提高了，IC5tl值明顯降低了。
[0023]實例4對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，功率為40W，微波處理5min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻餅柏蛋白水溶液；以酶活1700 u/g (酶活和底物質量比)加入堿性蛋白酶(無錫杰能科生物工程有限公司，10000u/g)，溫度為46°C，pH值為8.88，采用工作/間歇時間定為2 s/4 S、功率為50W，超聲處理30min其他條件和預處理的超聲波一樣，超聲處理24min后停止酶解，酶解液90°C水浴15min滅酶。自然冷卻至室溫,離心取上清液真空抽濾(Φ9 cm),選用截留分子質量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子量在3 kDa下的產物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產品。測定水解產物多肽得率和ACE抑制率，IC5tl值，具體測定方法參照實例I。
[0024]空白試驗參照實例2。
[0025]經過測定，對照組的酶解產物多肽的ACE抑制率為32.02%, IC50值為6.73mg/ml,實驗組的酶解產物多肽的ACE抑制率為67.20%，IC5tl值為2.67mg/ml。可見，在同等過程條件下，伴隨著多肽的純度的提高，采用超聲波的酶解產物多肽的ACE抑制率顯著提高了，IC5tl值明顯降低了。
【權利要求】
1.基于超聲波技術的芝麻餅柏的ACE抑制肽的制備方法，其特征在于按照下述步驟進行: (1)對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:5.5~1:50的質量比加入水形成混懸液，采用頻率30MHz，功率為20~60W的微波處理2~8min ;使其中蛋白溶解到水中形成水溶液； (2)加入堿性蛋白酶進行酶解，在酶解開始后對酶解體系采用，頻率為20kHz，功率20~80W的超聲波處理，酶解時間為O~150min，酶解結束，停止超聲波處理； 酶解結束后，酶解液90°C水浴15min滅酶，在自然冷卻到室溫； (3)離心取上清液真空抽濾(Φ9cm)，選用截留分子量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子質量在3 kDa以下的產物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產品。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于超聲波技術的芝麻餅柏的ACE抑制肽的制備方法，其特征在于步驟(1)中或者是采用工作/間歇時間為2 s/4 s，頻率為20kHz，功率200~1000W，初始溫度30~70°C的超聲波處理5~30min。
3.根據(jù)權利要求1所述的基于超聲波技術的芝麻餅柏的ACE抑制肽的制備方法，其特征在于步驟(2)中酶的加 入量為1000~5000u/g，酶解溫度為30~70°C，pH為7~11。
【文檔編號】C12P21/06GK104131056SQ201410271440
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權日:2014年6月18日
【發(fā)明者】王振斌, 梁秋芳, 馬海樂, 王林, 王世清 申請人:江蘇大學