綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步pcr分子鑒定方法
【專利摘要】綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法，涉及一種鮑的DNA分子標(biāo)記檢測(cè)。(1)采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取綠鮑、皺紋盤鮑及其雜交子一代基因組DNA；(2)以所提取的基因組DNA為模板進(jìn)行多重PCR和常規(guī)PCR的平行擴(kuò)增；(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋憾嘀豍CR反應(yīng)程序和常規(guī)PCR反應(yīng)程序；(4)對(duì)兩個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠電泳；(5)將電泳圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)；(6)對(duì)電泳結(jié)果圖譜進(jìn)行分析。利用綠鮑和皺紋盤鮑線粒體基因和核基因的種間特異性位點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果直觀，檢測(cè)成本低、檢測(cè)技術(shù)易于操作，可準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快捷的對(duì)雜交種的真?zhèn)芜M(jìn)行檢測(cè)，具有應(yīng)用和推廣價(jià)值。
【專利說(shuō)明】綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鮑的DNA分子標(biāo)記檢測(cè)，尤其是涉及綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鮑是海洋貝類的一種，被譽(yù)為海產(chǎn)八珍之首，素有“軟黃金”之稱，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)是世界第一養(yǎng)鮑大國(guó)，據(jù)2012年漁業(yè)管理部門統(tǒng)計(jì)，我國(guó)鮑的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)9萬(wàn)余噸，占全球鮑產(chǎn)量的80%以上，年產(chǎn)值超100億元，鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)現(xiàn)已成為我國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的支柱之一。
[0003]皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)主要分布在遼東半島和山東半島一帶,近年來(lái)，南移養(yǎng)殖成功，已成為我國(guó)南方主要的養(yǎng)殖鮑種。但由于皺紋盤鮑的耐高溫能力較差，夏季高溫期死亡率高,給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。本 申請(qǐng)人:2009年從美國(guó)弓丨進(jìn)一批綠鮑(Haliotis f μ I gen),該鮑種具有個(gè)體大、耐高溫、繁殖量大、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)。根據(jù)綠鮑與皺紋盤鮑在耐高溫等形狀上的互補(bǔ)性，通過(guò)綠鮑與皺紋盤鮑進(jìn)行雜交，培育出生長(zhǎng)快、耐高溫、抗逆性強(qiáng)的品種，對(duì)于我國(guó)改善鮑養(yǎng)殖品種結(jié)構(gòu)和推動(dòng)整個(gè)鮑養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展具有重要意義。 [0004]目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)鮑及種間雜交的鑒定方法主要有4種:(I)外形特征鑒別:通過(guò)鮑的外形特征進(jìn)行鑒定，如殼色、顏色、呼吸孔高度、螺頂高低水平、腹足顏色等進(jìn)行判斷。該方法的優(yōu)點(diǎn)是比較直觀可大量操作。其缺點(diǎn)是要求個(gè)體規(guī)格較大，在種苗階段難于進(jìn)行。
(2)同工酶鑒定:主要是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠或淀粉凝膠電泳技術(shù)，進(jìn)一步分析作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)和同工酶來(lái)鑒定鮑種及不同鮑之間的雜交種。該技術(shù)操作要求嚴(yán)格，程序復(fù)雜，識(shí)別不直觀，而且同工酶表達(dá)與組織及發(fā)育時(shí)期有關(guān)，可利用的酶種類較少，重復(fù)性不夠好。(3)RFLP鑒定:對(duì)樣品純度要求較高，樣品用量大，技術(shù)步驟繁瑣、成本較高，應(yīng)用受到了一定的限制。(4)SSR微衛(wèi)星鑒定:檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量多，多態(tài)性高，但結(jié)果不夠直觀，結(jié)果具有共顯性，并且不能鑒定出雜交種的母本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供能簡(jiǎn)單、快速鑒定綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法。
[0006]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0007](I)采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取綠鮑、皺紋盤鮑及其雜交子一代基因組DNA ；
[0008](2)以所提取的基因組DNA為模板進(jìn)行多重PCR和常規(guī)PCR的平行擴(kuò)增；
[0009]多重PCR擴(kuò)增采用兩對(duì)特異性引物:
[0010]引物1:afal42
[0011]F:CCGTTGAACATGCTCACAGTA[0012]R: TAATGGGCACATTCCGTAAAT
[0013]引物2:DF_1
[0014]F:ATCTCAATTAGTGCGACATCAC
[0015]R:CCAGAGCAAACTGATCGACTG
[0016]常規(guī)PCR擴(kuò)增中采用的特異性引物:
[0017]引物:DF-2
[0018]F:TTCTCTGTTAATTTGTGTGG
[0019]R:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT ；
[0020]在步驟⑵中，所述擴(kuò)增的反應(yīng)體積可為25μ1，其中各組分用量可為:Buffer (IOmM) 2.5 μ I，dNTP (2.5mM) 0.5 μ I，Mg2+ (25mM) 1.5 μ I，rTaq (5U/ μ I) 0.2 μ I，弓 I物0.2mM，基因組DNA20-100ng，用雙蒸水補(bǔ)齊到25 μ I ;所述引物I與引物2的體積比可為I: 10
[0021](3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?
[0022]多重PCR反應(yīng)程序:
[0023]94°C3min— {94°C30s— [65°C —55°C每個(gè)循環(huán)降低0.5°C] — 72°C20s} X20 — {94°C 30s — 55°C 30s — 72°C 15s} — 72°C IOmin — 4°C^ ；
[0024]常規(guī)PCR反應(yīng)程序:
[0025]94°C 3min — {94°C 30s — 54°C 30s — 30°C 30s} X 30 — 72°C IOmin — 4°C ⑴；
[0026](4)對(duì)兩個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠電泳；
[0027]在步驟(4)中，所述凝膠電泳可采用瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)量體積百分比濃度可為
1.2%, 100V電壓，電泳時(shí)間可為20~40min ；
[0028](5)將電泳圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)。
[0029](6)對(duì)電泳結(jié)果圖譜進(jìn)行分析，其中:
[0030]多重PCR中，由引物I擴(kuò)增出的目的條帶為大小在250bp左右皺紋盤鮑特異性的條帶(條帶1-1)，由引物2擴(kuò)增出的目的條帶為大小在500~750bp之間的綠鮑特異性條帶(條帶1-2);常規(guī)PCR中，擴(kuò)增出的產(chǎn)物是條帶為大小在250bp左右的特異性條帶(條帶 2-1)。
[0031]將電泳結(jié)果于可見(jiàn)燈箱下觀察拍照。
[0032]電泳圖譜進(jìn)行比對(duì)后，只具有條帶1-1的DNA樣品，即為皺紋盤鮑樣品；只具有條帶1-2的DNA樣品，即為綠鮑樣品。同時(shí)具有條帶1-1及條帶1-2的樣品，即同時(shí)具有親本皺紋盤鮑和親本綠鮑的特異性條帶，說(shuō)明該個(gè)體系二者的雜交種；具有條帶2-1的DNA樣品，即含有綠鮑線粒體基因特異性片段的DNA樣品，能判斷是綠鮑樣品或以綠鮑為母本的雜交子代。不具有任何條帶的DNA樣品，即不含有綠鮑線粒體基因特異性片段的DNA樣品，能判斷是皺紋盤鮑樣品或以皺紋盤鮑為母本的雜交子代。
[0033]同時(shí)，具有條帶1-1，條帶1-2，條帶2-1的DNA樣品，說(shuō)明是以綠鮑為母本，皺紋盤鮑為父本的雜交后代，只具有條帶1-1及條帶1-2的DNA樣品，說(shuō)明是以皺紋盤鮑為母本，綠鮑為父本的雜交后代。
[0034]本發(fā)明在引種成功的基礎(chǔ)上，對(duì)綠鮑與皺紋盤鮑進(jìn)行雜交育種，獲得了綠鮑與皺紋盤鮑的雜交子代。經(jīng)驗(yàn)證，雜交種在長(zhǎng)勢(shì)、存活率及抗逆性上具有較高的雜種優(yōu)勢(shì)。然而，由于雜交種的外形與其父母本綠鮑和皺紋盤鮑過(guò)于相似，無(wú)法通過(guò)外形進(jìn)行有效的鑒別。為準(zhǔn)確判斷雜交種的真?zhèn)?、保護(hù)鮑養(yǎng)殖人員的利益、提供鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的積極性，本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確、快捷的雜交種鑒定方法。
[0035]本發(fā)明采用多重PCR和常規(guī)PCR相結(jié)合的二步PCR法，利用綠鮑和皺紋盤鮑線粒體基因和核基因的種間特異性位點(diǎn)，具有檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果直觀，檢測(cè)成本低、檢測(cè)技術(shù)易于操作等優(yōu)點(diǎn)，可準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快捷的對(duì)雜交種的真?zhèn)芜M(jìn)行檢測(cè)，具有應(yīng)用和推廣價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1為電泳圖譜對(duì)比圖。
[0037]圖2為電泳圖譜對(duì)比圖。
[0038]在圖1和2中，M是DNA marker (DL2000) ; I~4是皺紋盤鮑，5~8是綠鮑，9~12是綠鮑與皺紋盤鮑反交子一代(皺紋盤鮑早X綠鮑? ), 13~16是綠鮑與皺紋盤鮑正交子一代(綠鮑早X皺紋盤鮑? );從上至下，條帶大小分別為2000bp，750bp，250bp。
【具體實(shí)施方式】
[0039]實(shí)施例1
[0040]參見(jiàn)圖1，利用綠鮑早X皺紋盤鮑?進(jìn)行雜交，獲得雜交苗種，采用采用天根海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(目錄號(hào):DP324)提取樣品的基因組DNA。以DNA模板平行進(jìn)行常規(guī)PCR和多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)最適體積為25 μ 1，其中各組分終濃度分別為:BufferlOmM, dNTP0.2mM, Mg2+1.5mM, TaqlU，引物對(duì) 0.2mM(如引物多對(duì)，0.2mM 為標(biāo)準(zhǔn)量)，基因組DNA50ng，用雙蒸水補(bǔ)齊到25 μ I ;
[0041]引物1:afal42
[0042]F:CCGTTGAACATGCTCACAGTA
[0043]R: TAATGGGCACATTCCGTAAAT
[0044]引物2:DF_1
[0045]F:ATCTCAATTAGTGCGACATCAC
[0046]R:CCAGAGCAAACTGATCGACTG
[0047]注:其中引物I與引物2的體積比為1:1
[0048]常規(guī)PCR擴(kuò)增中采用的特異性引物:
[0049]引物:DF-2
[0050]F:TTCTCTGTTAATTTGTGTGG
[0051]R:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT
[0052](3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?
[0053]多重PCR反應(yīng)程序:
[0054]94°C3min— {94°C30s— [65°C —55°C每個(gè)循環(huán)降低0.5°C] — 72°C20s} X20 — {94°C 30s — 55°C 30s — 72°C 20s} — 72°C IOmin — 4°C^?。
[0055]常規(guī)PCR反應(yīng)程序:
[0056]94°C 3min — {94°C 30s — 54°C 30s — 72°C 30s} X 30 — 72°C IOmin — 4°C ⑴。
[0057]PCR反應(yīng)結(jié)束后，取4.5 μ I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量體積百分比濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，IOOV電壓，電泳20~40min。電泳結(jié)束后在可見(jiàn)燈箱下進(jìn)行觀察，同時(shí)對(duì)電泳圖譜進(jìn)行對(duì)比分析。
[0058]電泳圖譜進(jìn)行比對(duì)后，只具有條帶1-1的DNA樣品，說(shuō)明該個(gè)體為皺紋盤鮑的DNA樣品；只具有條帶1-2的DNA樣品，說(shuō)明該個(gè)體為綠鮑的DNA樣品。同時(shí)具有條帶1_1及條帶1-2的樣品，即同時(shí)具有親本皺紋盤鮑和親本綠鮑的特異性條帶，說(shuō)明該個(gè)體系雜交種，缺少其中任意一條即為假雜種；具有條帶1-1，條帶1-2，條帶2-1的DNA樣品，說(shuō)明是以綠鮑為母本，皺紋盤鮑為父本的雜交后代。三條特征帶缺一，均不能證明該雜交種為綠鮑為母本皺紋盤鮑為父本的雜種個(gè)體。
[0059]實(shí)施例2
[0060]參見(jiàn)圖1與2，與實(shí)施例1相似，所不同之處在于利用皺紋盤鮑早X綠鮑?進(jìn)行雜交，獲得雜交苗種。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖譜進(jìn)行比對(duì)，只具有條帶1-1的DNA樣品，說(shuō)明該個(gè)體為皺紋盤鮑的DNA樣品；只具有條帶1-2的DNA樣品，說(shuō)明該個(gè)體為綠鮑的DNA樣品。同時(shí)具有條帶1-1及條帶1-2的樣品，即同時(shí)具有親本皺紋盤鮑和親本綠鮑的特異性條帶，說(shuō)明該個(gè)體系雜交種，缺少其中任意一條即為假雜種；具有條帶1-1，條帶1-2，不具有條帶2-1的DNA樣品，說(shuō)明是以皺紋盤鮑為母本，綠鮑為父本的雜交后代。兩條帶條帶缺一或多一，均不能證明該雜交種為皺紋盤鮑為母本綠鮑為父本的雜種個(gè)體。
[0061]本發(fā)明利用線粒體基因特異性片段和核基因特異性片段共同對(duì)二種鮑的雜交種及其親本進(jìn)行分子鑒定，具有遺傳穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、鑒定快速、結(jié)果直觀、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。采用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取綠鮑、皺紋盤鮑及其正反雜交種的基因組DNA，進(jìn)行多重PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行觀察，比對(duì)親本與正、反雜交子代特異性條帶的差異，進(jìn)而鑒別出綠鮑、皺紋盤鮑及其正反雜交種。
【權(quán)利要求】
1.綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法，其特征在于其具體步驟如下: (1)采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取綠鮑、皺紋盤鮑及其雜交子一代基因組DNA ； (2)以所提取的基因組DNA為模板進(jìn)行多重PCR和常規(guī)PCR的平行擴(kuò)增； 多重PCR擴(kuò)增采用兩對(duì)特異性引物:
引物 I:afal42
F: CCGTTGAACATGCTCACAGTA
R:TAATGGGCACATTCCGTAAAT
引物2 =DF-1
F:ATCTCAATTAGTGCGACATCAC
R:CCAGAGCAAACTGATCGACTG
常規(guī)PCR擴(kuò)增中采用的特異性引物: 引物:DF-2
F: TTCTCTGTTAATTTGTGTGG
R:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT ； (3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)? 多重PCR反應(yīng)程序: 94°C3min— {94°C30s— [65°C —55?每個(gè)循環(huán)降低0.5°C ] ^ 72°C 20s} X20^ {94°C30s — 55°C 30s — 72°C 15s} — 72°C IOmin — 4°C^ ； 常規(guī)PCR反應(yīng)程序:
94°C 3min — {94°C 30s — 54°C 30s — 30°C 30s} X 30 — 72°C IOmin — 4°C^ ； (4)對(duì)兩個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠電泳； (5)將電泳圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)； (6)對(duì)電泳結(jié)果圖譜進(jìn)行分析，其中: 多重PCR中，由引物I擴(kuò)增出的目的條帶為大小在250bp左右皺紋盤鮑特異性的條帶，記為條帶1-1，由引物2擴(kuò)增出的目的條帶為大小在500~750bp之間的綠鮑特異性條帶，記為條帶1-2 ;常規(guī)PCR中，擴(kuò)增出的產(chǎn)物是條帶為大小在250bp左右的特異性條帶，記為條帶2-1 ； 將電泳結(jié)果于可見(jiàn)燈箱下觀察拍照； 電泳圖譜進(jìn)行比對(duì)后，只具有條帶1-1的DNA樣品，即為皺紋盤鮑樣品；只具有條帶1-2的DNA樣品，即為綠鮑樣品；同時(shí)具有條帶1-1及條帶1-2的樣品，即同時(shí)具有親本皺紋盤鮑和親本綠鮑的特異性條帶，說(shuō)明該個(gè)體系二者的雜交種；具有條帶2-1的DNA樣品，即含有綠鮑 線粒體基因特異性片段的DNA樣品，能判斷是綠鮑樣品或以綠鮑為母本的雜交子代；不具有任何條帶的DNA樣品，即不含有綠鮑線粒體基因特異性片段的DNA樣品，能判斷是皺紋盤鮑樣品或以皺紋盤鮑為母本的雜交子代； 同時(shí)，具有條帶1-1，條帶1-2，條帶2-1的DNA樣品，說(shuō)明是以綠鮑為母本，皺紋盤鮑為父本的雜交后代，只具有條帶1-1及條帶1-2的DNA樣品，說(shuō)明是以皺紋盤鮑為母本，綠鮑為父本的雜交后代。
2.如權(quán)利要求1所述綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法，其特征在于在步驟(2)中，所述擴(kuò)增的反應(yīng)體積可為25μ 1，其中各組分用量可為:Buffer2.5μ 1，dNTP0.5 μ 1，Mg2+1.5μ 1，rTaq0.2 μ 1，引物 0.2mM，基因組 DNA20_100ng，用雙蒸水補(bǔ)齊到25 μ I。
3.如權(quán)利要求1所述綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法，其特征在于在步驟(2)中，所述引物I與引物2的體積比為1:1。
4.如權(quán)利要求1所述綠鮑與皺紋盤鮑雜交種的二步PCR分子鑒定方法，其特征在于在步驟⑷中，所述凝膠電泳采用 瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)量體積百分比濃度為1.2%, IOOV電壓，電泳時(shí)間為20~40min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104004855SQ201410279120
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】游偉偉, 郭勍, 柯才煥, 任鵬, 駱軒, 黃妙琴 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)