人神經(jīng)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提出一種將人神經(jīng)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括：人神經(jīng)干細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)；多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的誘導(dǎo)；多巴胺能神經(jīng)元的定向誘導(dǎo)；人神經(jīng)干細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇。通過(guò)本發(fā)明的步驟，可以在體外獲得豐富的多巴胺能神經(jīng)元，與目前眾多多巴胺能神經(jīng)元生產(chǎn)方式相比，具有成本低廉、安全性高、生產(chǎn)效率高、可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)。這一體外多巴胺能神經(jīng)元生產(chǎn)方式，為多巴胺能神經(jīng)元臨床移植治療帕金森氏癥的應(yīng)用提供新的思路。
【專(zhuān)利說(shuō)明】人神經(jīng)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種利用無(wú)血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞并定向誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，造成帕金森癥的主要原因是中腦黑質(zhì)及紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元的退行性減少導(dǎo)致的多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的減少?，F(xiàn)行的治療方法主要是外源性的補(bǔ)充多巴胺前體物質(zhì)(如L-dopa)以及應(yīng)用某些多巴胺受體激動(dòng)劑或類(lèi)似的一些藥物。此類(lèi)方法的治療結(jié)果并不穩(wěn)定，容易導(dǎo)致嚴(yán)重的后遺癥，并不能從根本上解決問(wèn)題。治療帕金森癥最理想的方式應(yīng)該是刺激中腦黑質(zhì)及紋狀體內(nèi)源性的多巴胺能神經(jīng)元生成或者是外源性的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞替代整合至病灶并發(fā)揮功能，終止其神經(jīng)退行性病變甚至修復(fù)其受損部位，恢復(fù)其功能。
[0003]鑒于成人腦部神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目有限，并且病灶部位組織受損，刺激其生成新的神經(jīng)元難度巨大；而外源性的細(xì)胞可以通過(guò)體外擴(kuò)增的方式進(jìn)行大量增殖、分化，利用精確的定位手術(shù)進(jìn)行移植，并且由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的血腦屏障的存在，神經(jīng)干細(xì)胞與多巴胺能神經(jīng)元的移植幾乎不會(huì)引起任何的免疫排斥反應(yīng)。因此，細(xì)胞替代治療為帕金森癥患者的治療提供了一種新的途徑，并極有希望在接下來(lái)的幾十年內(nèi)替代現(xiàn)有的藥物治療成為帕金森治療最有效的治療方式。
[0004]通過(guò)不斷的 技術(shù)改進(jìn)，現(xiàn)階段人們已經(jīng)能夠便捷地獲得數(shù)量豐富的用于臨床試驗(yàn)的神經(jīng)干細(xì)胞，但是卻缺乏有效的方法將神經(jīng)干細(xì)胞高效地誘導(dǎo)成多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞用于臨床細(xì)胞移植治療帕金森癥。N6st0r F.Diaz等用鼠胚胎干細(xì)胞生產(chǎn)多巴胺能神經(jīng)元，免疫組化染色分析顯示，有94%胚胎干細(xì)胞分化成多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞中有26%為多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。Michela Deleidi等用鼠神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞，免疫組化分析顯示，未處理的神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的分化率為40.5±0.5%，而用VPA處理神經(jīng)干細(xì)胞后，其分化率高達(dá)62.5±4%。目前國(guó)外還沒(méi)有直接將人神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。國(guó)內(nèi)謝佐平、羅小丹等用鼠神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞，其分化率分別為40^^50.97?^吳衛(wèi)江等、王莎莉等用人神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞，其分化率分別為14.73 %、15.2 %。Xuan Wang等使用forsklin和FGF8來(lái)誘導(dǎo)人胎腦神經(jīng)前體細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元,結(jié)果顯示分化率顯著增高，但由于培養(yǎng)基中使用了胎牛血清(BSA)，而無(wú)法用于臨床。使用本發(fā)明的方法，人神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的分化率高達(dá)70%，解決了帕金森癥臨床治療上多巴胺能神經(jīng)元來(lái)源的問(wèn)題，為其治療提供了新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種利用無(wú)血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞并使其定向誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法同時(shí)解決了目前多巴胺能神經(jīng)元誘導(dǎo)效率偏低、誘導(dǎo)過(guò)程使用血清影響臨床使用等問(wèn)題。
[0006]本發(fā)明利用無(wú)血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞并使其定向誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元的方法通過(guò)以下方式進(jìn)行實(shí)施:
[0007]本發(fā)明的一種將人神經(jīng)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法，其包括如下步驟:
[0008]步驟1:人神經(jīng)干細(xì)胞的貼壁培養(yǎng):用無(wú)血清培養(yǎng)基將人神經(jīng)干細(xì)胞按照5 X 14/mL的濃度制成細(xì)胞懸液,接種至層粘連蛋白(Laminin, LN,購(gòu)于Lifetechnologies公司)包被的培養(yǎng)器皿中，35°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24-48小時(shí)；
[0009]步驟2:多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的誘導(dǎo):換用多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞誘導(dǎo)液，此誘導(dǎo)液由無(wú)血清培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子SHH、FGF8b、CHIR99021組成，35°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7-10天,每3天換液；
[0010]步驟3:多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的定向誘導(dǎo):換用多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞定向誘導(dǎo)液，此誘導(dǎo)液由神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基Neurobasal Medium添加B27、BDNF,⑶NF、TGFP 3、ascorbicacid、cAMP、forskolin組成；35°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14-20天，每3天換液；收獲細(xì)胞后即得到多巴胺能神經(jīng)元。
[0011]上述步驟1、2中細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的配方可以為DMEM/F12、B27 (I: 50，即產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)建議比例)、N2(1: 50，即產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)建議比例)、bFGF(basic Fibroblast GrowthFactor,喊性成纖維因子，20ng/mL,購(gòu)于 Lifetechnologies)與 EGF (Epidermal GrowthFactor,表皮生長(zhǎng)因子，20ng/mL,購(gòu)于 Lifetechnologies)。 [0012]本發(fā)明的技術(shù)方案中所使用的DMEM/F12培養(yǎng)液、Neurobasal Medium、B27添加劑和N2添加劑都是培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的常用公知的培養(yǎng)基和添加劑，均可購(gòu)自Lifetechnologies公司，在使用中按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)所建議的濃度比例添加配制即可，它們也可以從其它商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)得到。
[0013]其中DMEM/F12培養(yǎng)液包含無(wú)水氯化鈣116.6mg/L、L-亮氨酸59.05mg/L、亞油酸
0.042mg/L、五水硫酸銅0.0013mg/L、L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽91.25mg/L、硫辛酸0.105mg/L、九水硝酸鐵0.05mg/L、L_蛋氨酸17.24mg/L、酹紅8.lmg/L、七水硫酸亞鐵0.417mg/L、L_苯丙氨酸 35.48mg/L、l，4- 丁二胺二鹽酸鹽 0.08lmg/L、氯化鉀 311.8mg/L、L-絲氨酸 26.25mg/L、丙酮酸鈉55mg/L、氯化鎂28.64mg/L、L_蘇氨酸53.45mg/L、維生素H0.0035mg/L、無(wú)水硫酸鎂 48.84mg/L、L-丙氨酸 4.45mg/L、D-泛酸鈣 2.24mg/L、氯化鈉 6999.5mg/L、L-天門(mén)冬酰胺7.5mg/L、氯化膽堿8.98mg/L、無(wú)水磷酸二氫鈉54.35mg/L、L-天門(mén)冬氨酸6.65mg/L、葉酸2.65mg/L、磷酸氫二鈉71.02mg/L> L-半胱氨酸鹽酸鹽17.56mg/L、i_肌醇12.6mg/L、七水硫酸鋅0.432mg/L、L-谷氨酸7.35mg/L、煙酰胺2.02mg/L、L-精氨酸鹽酸鹽147.5mg/L、L-脯氨酸17.25mg/L、鹽酸吡哆醛2mg/L、L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L、L-色氨酸9.02mg/L、鹽酸批P多醇0.031mg/L、L-谷氨酰胺365mg/L、L-酪氨酸38.4mg/L、核黃素0.219mg/L、甘氨酸18.75mg/L、L-纟顏氨酸52.85mg/L、鹽酸硫胺2.17mg/L、L-組氨酸鹽酸鹽31.48mg/L、D-葡萄糖3151mg/L、胸苷0.365mg/L、L-異亮氨酸54.47mg/L、次黃嘌呤2mg/L、維生素B120.68mg/L。
[0014]Neurobasal Medium 的配方為甘氨酸 30.0mg/L、L-丙氨酸 2.0mg/L、L-精氨酸鹽酸鹽84.0mg/L、一水L-天冬酰胺0.83mg/L、L-半胱氨酸31.5mg/L、一水L-組氨酸鹽酸鹽42.0mg/L、L-異亮氨酸 105.0mg/L、L_ 亮氨酸 105.0mg/L、L_ 賴(lài)氨酸鹽酸鹽 146.0mg/L> L-蛋氨酸30.0mg/L> L-苯丙氨酸66.0mg/L> L-脯氨酸7.76mg/L、L_絲氨酸42.0mg/L> L-蘇氨酸95.0mg/L、L-色氨酸 16.0mg/L、L-酪氨酸 ?2.0mg/L、L-纟顏氨酸 94.0mg/L、氯化膽堿 4.0mg/L、D-泛酸鈣4.0mg/L、葉酸4.0mg/L、煙酰胺4.0mg/L、鹽酸批卩多醇4.0mg/L、核黃素0.4mg/L、鹽酸硫胺4.0mg/L、維生素B120.0068mg/L、i_肌醇7.2mg/L、無(wú)水氯化鈣200.0mg/L、硝酸鐵0.lmg/L、無(wú)水氯化鎂77.3mg/L、氯化鉀400.0mg/L、碳酸氫鈉2.2g/L、氯化鈉4.0g/L、磷酸二氫鈉 125.0mg/L、硫酸鋅 0.194mg/L、D_ 葡萄糖 4.5g/L、HEPES2.6g/L、丙酮酸鈉 25.0mg/L0
[0015]前述步驟2中多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞誘導(dǎo)液中，SHH(sonic hedgehog,音猬因子，購(gòu)于R&D system公司)的終濃度為100_300ng/mL、優(yōu)選120_280ng/mL，最優(yōu)選 150-250ng/mL ；FGF8b (fibroblast growth factor8b,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 8b,購(gòu)于Lifetechnologies 公司)的終濃度為 50-200ng/mL、優(yōu)選 60-180ng/mL,最優(yōu)選 80_150ng/mL ； ；CHIR99021 (C22H18Cl2N8，一種糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)抑制劑，購(gòu)于 Millipore 公司)的濃度為 0.1-1 μ Μ、優(yōu)選 0.2-0.9 μ Μ，最優(yōu)選 0.3-0.8 μ M0
[0016]前述步驟3中多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞定向誘導(dǎo)液中,BDNF (brain derived neurophicfactor,腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，購(gòu)于Lifetechnologies公司)與GDNF (Glial cellline-derived neurotrophic factor,膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，購(gòu)于 Lifetechnologies公司)的終濃度均為 20ng/mL ;TGF β 3 (transforming growth factor-β 3,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 3,購(gòu)于 Lifetechnologies)的濃度為 l_20ng/mL、優(yōu)選 2_18ng/mL,最優(yōu)選 5_15ng/mL ；ascorbic acid (抗壞血酸,購(gòu)于Sigma)的終濃度為20-200 μ Μ、優(yōu)選40-180 μ Μ,最優(yōu)選50-150 μ M ；cAM P (Cyclic adenosine monophosphate,環(huán)腺苷酸，購(gòu)于 Sigma 公司)的終濃度為 0.05-0.5mM、優(yōu)選 0.08-0.4mM，最優(yōu)選 0.1-0.3mM ;forskolin (C22H34O7,佛司可林，購(gòu)于sigma公司)的終濃度為10-50nM、優(yōu)選15_45nM，最優(yōu)選20_40nM。
[0017]按照本發(fā)明提供的方法，可以在體外對(duì)人神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增并將其定向誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元。與其他多巴胺能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化方法進(jìn)行比較:(I)采用本發(fā)明的方法，人神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的分化率高達(dá)70% (71.67±2.31% )，可以為帕金森氏癥的細(xì)胞療法提供豐富的多巴胺能神經(jīng)元；(2)本發(fā)明中所采用的培養(yǎng)基為DMEM/F12和Neuralbasal，均為無(wú)血清培養(yǎng)基且無(wú)需任何滋養(yǎng)層細(xì)胞，可以避免動(dòng)物源性及其他細(xì)胞系的交叉污染，提高臨床應(yīng)用時(shí)的安全性；(3)與從胚胎干細(xì)胞逐步向神經(jīng)細(xì)胞方向誘導(dǎo)的技術(shù)方案相比，本發(fā)明使用直接從個(gè)體組織中提取的神經(jīng)干細(xì)胞，相對(duì)更容易獲取，致瘤性低，臨床上可使用從異體神經(jīng)干細(xì)胞制備的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞移植，而不可用從異體胚胎干細(xì)胞制備的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞移植；(4)本發(fā)明采用直接從供體組織中提取的人神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞，省去了從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成人神經(jīng)干細(xì)胞的過(guò)程，簡(jiǎn)化了多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞生產(chǎn)流程，減少了生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞污染的概率，提高了生產(chǎn)效率；(5)本發(fā)明中的細(xì)胞在步驟I與步驟2進(jìn)行完畢后，細(xì)胞均可以消化收獲并凍存，待需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇并進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)與分化，提升了實(shí)驗(yàn)的可操作性，本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞復(fù)蘇率可達(dá)92 %。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0018]附圖l:(l-a)為人神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)第I天；(1-b)為誘導(dǎo)7天后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞；(Ι-c)為分化第21天的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。
[0019]附圖2:(2_a)為T(mén)H抗體染色的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞；(2_b)為β-tubulin抗體染色的神經(jīng)元細(xì)胞；(2-c)為(2-a)與(2-b)兩圖的重疊，顯示分化獲得的多巴胺能神經(jīng)元占全部神經(jīng)元的比例。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1:人神經(jīng)干細(xì)胞的貼壁培養(yǎng):
[0021]用DPBS(Dulbecco’ s Phosphate Buffered Saline,杜氏憐酸緩沖液)將層粘連蛋白(Laminin, LN,購(gòu)于Lifetechnologies公司)稀釋為10 μ g/mL ;取細(xì)胞培養(yǎng)用六孔板,用Laminin溶液進(jìn)行包被，37°C作用2小時(shí)，然后將六孔板用DPBS洗滌一次，室溫保存?zhèn)溆茫蝗⌒迈r傳代至P5-P8代的人神經(jīng)干細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用無(wú)血清培養(yǎng)基按照5 X 1VmL制成細(xì)胞懸液，均勻接種至上述準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板中，35°C，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24小時(shí)。
[0022]上述無(wú)血清培養(yǎng)基包含DMEM/F12、B27 (I: 50)、N2 (I: 50)、bFGF (basicFibroblast Growth Factor,喊性成纖維因子，20ng/mL,購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)與EGF ((Epidermal Growth Factor,表皮生長(zhǎng)因子，20ng/mL,購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)。上述DMEM/F12培養(yǎng)液、B27添加劑和N2添加劑是培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的常用公知添加劑，購(gòu)自Lifetechnologies公司，它們也可以從其它商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)得到。
[0023]實(shí)施例2:多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的誘導(dǎo): [0024]換用多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞誘導(dǎo)液，并去除未貼壁細(xì)胞和死細(xì)胞；35°C，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7天，每3天進(jìn)行換液；待細(xì)胞生長(zhǎng)至60-70%時(shí)即可以進(jìn)行多巴胺能神經(jīng)元的定向誘導(dǎo)。
[0025]上述多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞誘導(dǎo)液配方如下:
[0026]
DMEM/F12 (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)，
B27 (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)，終濃度為 1:50(v/v)
N2 (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)，終濃度為 1:50 (v/v)
bFGF (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)， 終濃度為 20ng/mL
EGF (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司),終濃度為 20ng/mL
SHH (購(gòu)于R&D system公司)，終濃度為200ng/mL
FGF8b (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)， 終濃度為 100ng/mL
CHIR99021 (購(gòu)于 Millipore 公司)，終濃度為 0.5 μ M。
[0027]實(shí)施例3:多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇:
[0028]細(xì)胞凍存步驟:將培養(yǎng)板中的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞用不含Ca、Mg的DPBS洗滌一次，然后加入0.05%的胰酶細(xì)胞消化液(trypsin-EDTA)并置于37°C培養(yǎng)箱中消化2分鐘，消化完畢加入胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor)進(jìn)行終止消化,然后輕柔的吹打?qū)⒓?xì)胞制成細(xì)胞懸液收集至50ml離心管中，400g離心5min，加入20ml DMEM/F12洗滌一次，400g離心5min，然后用凍存液重懸，使其終濃度為lX107ml。用2ml凍存管進(jìn)行分裝,每管lml，放置于程序凍存盒中，置于-80°C冰箱過(guò)夜，第二天取出置于液氮罐中進(jìn)行儲(chǔ)存。
[0029]細(xì)胞復(fù)蘇步驟:取5管液氮中凍存的細(xì)胞，放入裝有液氮的保溫瓶中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)間，然后用止血鉗夾住凍存管，迅速浸入37°C水浴鍋中，不時(shí)搖動(dòng)2分鐘至管中剩余些許冰晶為止，將凍存管拿入生物安全柜中，用酒精棉球擦拭管口消毒，吸出凍存管中的細(xì)胞懸液加入預(yù)熱的復(fù)蘇液中，再用移液槍取Iml復(fù)蘇液洗滌凍存管，重復(fù)2次，400g離心5min，吸棄上清，加入20ml DMEM/F12洗滌一次，400g離心5min，Iml DMEM/F12重懸細(xì)胞，取1ul進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)3次得到其細(xì)胞數(shù)均值為4.6X 106。然后用多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞定向誘導(dǎo)液進(jìn)行重懸，終濃度為I X 15Ail，并接種至Laminin包被好的培養(yǎng)容器中進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0030]實(shí)施例4:多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的定向誘導(dǎo):
[0031]換用多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞定向誘導(dǎo)液，并去除未貼壁細(xì)胞和死細(xì)胞；35°C，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14天，每3天進(jìn)行換液；即可獲得多巴胺能神經(jīng)元。
[0032]上述多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞定向誘導(dǎo)液包含如下成分:
[0033]
neurobasal Medium (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)，
B27 (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司),終濃度為 I..50 (v/v)
BDNF (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)，終濃度為 20ng/mL
GDNF (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)，終濃度為 20ng/mL
TGF β 3 (購(gòu)于 Lifetechnologies 公司)， 終濃度為 10ng/mL
ascorbic acid (購(gòu)于 Sigma 公司)，終濃度為 100 μ M
cAMP (購(gòu)于Sigma公司)，終濃度為0.2mM
forskolin (購(gòu)于Sigma公司)，終濃度為30nM。
[0034]實(shí)施例:5:多巴胺能神經(jīng)元的染色鑒定:
[0035]將收獲的細(xì)胞用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，采用β微管蛋白III (β-Tubulin III，購(gòu)于sigma公司，終濃度為1: 400)以及酪氨酸輕化酶抗體(TH抗體,購(gòu)于abeam公司，終濃度為1: 400)進(jìn)行雙染，分別標(biāo)記其對(duì)應(yīng)的神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞，然后分別使用二抗488、546(購(gòu)于Lifetechnologies公司，終濃度為1: 1000)進(jìn)行染色，在倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇至少6個(gè)視野進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)分析，計(jì)算人神經(jīng)干細(xì)胞分化后多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞所占的比例，該實(shí)驗(yàn)中此比例為71.67±2.31%，該實(shí)驗(yàn)中視野采用的倍數(shù)為20倍。
【權(quán)利要求】
1.一種將人神經(jīng)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法，其包括如下步驟: 步驟1:人神經(jīng)干細(xì)胞的貼壁培養(yǎng):用無(wú)血清培養(yǎng)基將人神經(jīng)干細(xì)胞按照5 X 1VmL的濃度制成細(xì)胞懸液，接種至層粘連蛋白(Laminin)包被的培養(yǎng)器皿中，35°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24-48小時(shí)； 步驟2:多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的誘導(dǎo):換用多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞誘導(dǎo)液，此誘導(dǎo)液由無(wú)血清培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子音猥因子(SHH)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8b (FGFSb)、糖原合成酶激酶_3(GSK-3)抑制劑CHIR99021組成，35°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7_10天，每3天換液； 步驟3:多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的定向誘導(dǎo):換用多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞定向誘導(dǎo)液，此誘導(dǎo)液由神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基(Neurobasal Medium)添加B27、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 3 (TGF β 3)、抗壞血酸(ascorbic acid)、環(huán)腺苷酸(cAMP)、佛司可林(forskolin)組成；35°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14-20天，每3天換液；收獲細(xì)胞后即得到多巴胺能神經(jīng)元。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟I中細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基為DMEM/F12、B27(1: 50)、N2(1: 50)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF, 20ng/mL)與表皮生長(zhǎng)因子(EGF，20ng/mL)。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞誘導(dǎo)液配方如下:
DMEM/F12,
B27,終濃度為 l:50(v/v)
N2,終濃度為1:50 (v/v)
bFGF,終濃度為20ng/mL
EGF,終濃度為20ng/mL
SHH,終濃度為 100-300ng/mL
FGF8b,終濃度為 50-200ng/mL
CHIR99021， 終濃度為 0.1-1 μ Μ。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3中多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞定向誘導(dǎo)液配方如下:

Neurobasal Medium,B27,終濃度為 1:50(v/v)BDNF,終濃度為20ng/mL
5.如權(quán)利要求1所述的步驟，其特征在于，還可在步驟I和步驟2進(jìn)行完畢后添加一個(gè)細(xì)胞凍存步驟，待需要的時(shí)候再進(jìn)行復(fù)蘇并進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)和分化。
6.一種多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞誘導(dǎo)液，其配方如下:
7.—種多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞定向誘導(dǎo)液，其配方如下:
【文檔編號(hào)】C12N5/0793GK104031882SQ201410279859
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】趙雄飛, 金宜強(qiáng), 鄭佳威, 楊立敏, 周均云 申請(qǐng)人:上海安集協(xié)康生物技術(shù)有限公司