細(xì)胞體外收集方法及其應(yīng)用、體外細(xì)胞材料及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞收集方法、細(xì)胞材料。針對(duì)現(xiàn)有Transwell遷移研究對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示的科學(xué)內(nèi)容利用有限的缺陷，本發(fā)明首先提供了一種細(xì)胞體外收集方法。本方法在Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束并去除Transwell上室、下室內(nèi)培養(yǎng)液后，采用胰酶消化并結(jié)合機(jī)械振蕩的方法分別對(duì)Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)后上室、下室中的細(xì)胞進(jìn)行消化、收集；胰酶細(xì)胞消化操作中，洗滌液為pH?7.35～7.45磷酸鹽緩沖液，胰酶細(xì)胞消化液含0.25％胰酶和0.01％EDTA。本發(fā)明同時(shí)提供一種包括由相同趨化因子誘導(dǎo)下分離產(chǎn)生的高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料。本發(fā)明還提供上述收集方法與細(xì)胞材料在細(xì)胞生物學(xué)行為分析試驗(yàn)中的應(yīng)用。本發(fā)明能夠使Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)拓展到細(xì)胞遷移的細(xì)胞生物學(xué)行為與分子生物學(xué)研究。
【專利說(shuō)明】細(xì)胞體外收集方法及其應(yīng)用、體外細(xì)胞材料及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞收集方法、細(xì)胞材料，特別是涉及一種細(xì)胞體外收集方法，以及體外細(xì)胞材料。屬于生物、醫(yī)學(xué)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞遷移是細(xì)胞在外源性信號(hào)刺激下產(chǎn)生的趨化移動(dòng)，通常是細(xì)胞感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后從低濃度王高濃度區(qū)域移動(dòng)。在生理狀態(tài)下，細(xì)胞遷移在細(xì)細(xì)胞覓食、傷口愈合、胚胎發(fā)生、組織修復(fù)、免疫反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用；在病理狀態(tài)下，細(xì)胞遷移也推動(dòng)了癌癥轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化和關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生和發(fā)展。因而，細(xì)胞遷移是當(dāng)前生命科學(xué)的一個(gè)重要研究方向。
[0003]Transwell遷移技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的研究體外細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)所需Transwell遷移體系采用Transwell小室(Transwell insert)與普通多孔細(xì)胞培養(yǎng)板共同搭建完成。Transwell小室外形為一個(gè)可放置在普通細(xì)胞培養(yǎng)板孔板里的杯狀裝置，底部帶通透性膜，膜上帶有孔徑大小0.1 - 12.0μπι的微孔。研究中根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選用不同的微孔直徑。細(xì)胞遷移研究通常選用帶8.0 μ m或12.0 μ m微孔的Transwell體系。實(shí)驗(yàn)中將Transwell小室放入普通細(xì)胞培養(yǎng)板中，Transwell小室內(nèi)稱上室或內(nèi)室，細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)稱下室或者外室。實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在下室添加各種趨化因子，誘導(dǎo)細(xì)胞從上室往下室遷移。根據(jù)生產(chǎn)廠商不同，Transwell小室又稱Boyden Chamber或者Thincert小室。由于領(lǐng)域內(nèi)一般采用美國(guó)Corning公司生產(chǎn)的Transwell小室，因而，目前這類體外細(xì)胞遷移研究方法廣泛采用“Transwell法”作為其常規(guī)名稱。Transwell遷移技術(shù)可靠性強(qiáng)、重復(fù)性好，是目前最廣泛的細(xì)胞遷移研究方法。但是目前Transwell遷移研究中對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用的分析方法均比較簡(jiǎn)單，通常是單純分析計(jì)算細(xì)胞遷移率，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示的科學(xué)內(nèi)容利用有限。
[0004]細(xì)胞體內(nèi)研究中已經(jīng)揭示細(xì)胞遷移活性高和低的細(xì)胞的各種細(xì)胞生物學(xué)行為，包括細(xì)胞黏附、增殖、分化、凋亡等均勻顯著不同，國(guó)內(nèi)外學(xué)者們對(duì)此已經(jīng)進(jìn)行了深入研究。然而受體內(nèi)研究的限制，研究者很難獲取具有不同遷移活性的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究。從Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理分析，Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)軐⒓?xì)胞材料區(qū)分為遷移能力強(qiáng)和遷移能力弱的兩群細(xì)胞，已為完成上述細(xì)胞體外行為研究創(chuàng)造了前提條件。但是，細(xì)胞在Transwell小室中的遷移是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程:細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)和離子在感知上下小室的濃度梯度后重新排列，并變性伸出極狀足，形成粘著斑，牽拉細(xì)胞向前，從而穿過(guò)狹小的Transwell微孔,逐漸從Transwell膜的上室遷移到下室。由于真核細(xì)胞的直徑一般在10 μ m~100 μ m之間，遠(yuǎn)大于Transwell遷移實(shí)驗(yàn)8.0 μ m~12.0 μ m的微孔直徑。因而在Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞除了粘附在Transwell膜的上下兩個(gè)底面上,還會(huì)有大量的細(xì)胞會(huì)“陷”在Transwell膜上的微孔內(nèi)，難以有效收集用于后繼研究。尤其Transwell小室面積較小，采用常規(guī)的化學(xué)消化方式無(wú)法進(jìn)行批量化操作，細(xì)胞收集量較低，不足以用于后續(xù)細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究。另外，在常規(guī)的細(xì)胞消化方法中細(xì)胞是從其培養(yǎng)平面上脫落，細(xì)胞消化時(shí)只需要破壞細(xì)胞之間的連接即可；而在Transwell遷移體系中，細(xì)胞要穿過(guò)孔徑小于其直徑的狹小的微孔，消化收集細(xì)胞時(shí)需要細(xì)胞從其嵌附的微孔中快速脫離，此過(guò)程很易損傷細(xì)胞，甚至導(dǎo)致細(xì)胞裂解、碎片化。因此，整體上，盡管體外細(xì)胞研究技術(shù)具有干預(yù)因素單純、實(shí)驗(yàn)條件易控、經(jīng)濟(jì)快速、重復(fù)性好，且能夠進(jìn)行深入的機(jī)制研究等優(yōu)點(diǎn)，但受現(xiàn)有技術(shù)條件的制約，使得體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)通常只能簡(jiǎn)單地通過(guò)分析細(xì)胞遷移率來(lái)了解細(xì)胞的遷移能力，而研究者所希望的將遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果細(xì)胞進(jìn)一步利用，例如獲取高遷移活性的細(xì)胞進(jìn)一步研究，在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)條件下比較遷移細(xì)胞與非遷移細(xì)胞的生物學(xué)行為的研究始終難以開(kāi)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細(xì)胞體外收集方法，該方法針對(duì)性與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的細(xì)胞進(jìn)行有效收集；收集到的細(xì)胞是在相同趨化因子誘導(dǎo)下具有不同遷移活性的細(xì)胞，可應(yīng)用于細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)條件下遷移細(xì)胞與非遷移細(xì)胞的比較研究；該細(xì)胞體外收集方法可應(yīng)用于細(xì)胞克隆、增殖，凋亡、基因和蛋白表達(dá)、形態(tài)學(xué)檢測(cè)等試驗(yàn)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種細(xì)胞體外收集方法，其技術(shù)方案如下: [0007]一種細(xì)胞體外收集方法，其特征在于:應(yīng)用于Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束并去除Transwell上室、下室內(nèi)培養(yǎng)液后，采用胰酶消化并結(jié)合機(jī)械振蕩的方法分別對(duì)Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)后上室、下室中的細(xì)胞進(jìn)行消化、收集；胰酶細(xì)胞消化操作中，洗滌液為PH 7.35~7.45磷酸鹽緩沖液，胰酶細(xì)胞消化液含0.25%胰酶和 0.01% EDTA。
[0008]本發(fā)明細(xì)胞體外收集方法技術(shù)基本技術(shù)原理是將Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)與體外細(xì)胞培養(yǎng)方法相結(jié)合。Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束并去除TranswelI上室、下室內(nèi)培養(yǎng)液后，殘留并附著在Transwell通透性膜上層表面的細(xì)胞是非遷移細(xì)胞(遷移能力低)，而附著于Transwell通透性膜下層表面以及嵌附在Transwell通透性膜微孔內(nèi)的細(xì)胞是遷移細(xì)胞(遷移能力高)，通過(guò)胰酶消化并結(jié)合機(jī)械振蕩的方法可將附著于通透性膜表面以及鑲嵌于微孔內(nèi)的細(xì)胞消化并收集，從而獲得Transwell體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)遷移行為的細(xì)胞與有遷移行為的細(xì)胞而進(jìn)行下一步研究。
[0009]在優(yōu)選方式下，上述細(xì)胞體外收集方法可依照如下步驟實(shí)施:
[0010]步驟S1、初次洗滌
[0011]Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束并去除Transwell上室、下室內(nèi)培養(yǎng)液后，在上室、下室中分別加入磷酸鹽緩沖液洗滌培養(yǎng)室，收集上室與下室中洗滌液分別存入二離心管中，分別標(biāo)記為離心管A、離心管B ;
[0012]步驟S2、消化收集
[0013]向Transwell上室、下室中分別加入胰酶細(xì)胞消化液，待細(xì)胞分散懸浮，分別收集上室、下室中消化液對(duì)應(yīng)加入離心管A、離心管B中，分別向離心管A、離心管B中加入牛血清終止細(xì)胞消化；
[0014]步驟S3、再次洗滌收集
[0015]分別向Transwell上室、下室中加入磷酸鹽緩沖液，水平振蕩，分別收集上室、下室中洗滌液對(duì)應(yīng)加入離心管A、離心管B中；
[0016]步驟S4、離心收集細(xì)胞
[0017]將離心管A、離心管B離心，去除上清液，分別向離心管A、離心管B中加入磷酸鹽緩沖液，重懸并收集離心管底部細(xì)胞團(tuán)塊，得收集細(xì)胞。
[0018]上述細(xì)胞體外收集方法，在必要時(shí)需重復(fù)步驟S3、再次洗滌操作一次，即在消化收集操作之后進(jìn)行兩次洗滌收集。
[0019]上述細(xì)胞體外收集方法共進(jìn)行2~3次貼壁細(xì)胞的收集，只有第1次，即步驟S2中，在胰酶消化液中進(jìn)行，其余均采用磷酸鹽緩沖液洗滌結(jié)合水平搖床機(jī)械振蕩的方法進(jìn)行收集，這樣的操作既能減少細(xì)胞暴露在胰酶中的時(shí)間，又能提高細(xì)胞的收集效率。
[0020]上述方法借助前后主要操作步驟間的配合能夠最大程度提高收集效率。具體是:
[0021]在步驟SI中，向Transwell上室、下室中加入磷酸鹽緩沖液洗滌，收集少量漂浮的非貼壁細(xì)胞。
[0022]在步驟S2中，向Transwell上室、下室中分別加入胰酶細(xì)胞消化液可以消化貼附在Transwell膜上下兩側(cè)的細(xì)胞，向收集有磷酸鹽緩沖液和胰酶液的離心管中加入牛血清終止消化反應(yīng)，而非直接在Transwell上室、下室中加入含牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，可以避免在上室與下室中產(chǎn)生氣泡，既減少對(duì)細(xì)胞的損傷，又提高細(xì)胞收集率。在常規(guī)的胰酶消化細(xì)胞的過(guò)程中，是將含牛血清的培養(yǎng)基加入胰酶中終止細(xì)胞消化反應(yīng)，而在本方法中若照此操作，由于血清成分的存在，在吹打收集細(xì)胞過(guò)程中很容易產(chǎn)生氣泡，直接產(chǎn)生3方面危害:第一，氣泡在破裂時(shí)機(jī)械應(yīng)力很容易損傷細(xì)胞；第二，氣泡一旦產(chǎn)生會(huì)影響液體的收集，導(dǎo)致細(xì)胞收集不徹底；第三，氣泡一旦產(chǎn)生影響視野的清晰度，不易在在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化程度。而在本發(fā)明方法步驟S2中，由于不需要吹打細(xì)胞，可以徹底避免氣泡產(chǎn)生。同時(shí)，由于直接加入牛血清中和消化反應(yīng)，而不是加入含少量牛血清的培養(yǎng)基，也可以減少整個(gè)收集液的體積，從而減少后續(xù)離心收集的時(shí)間。
[0023]在步驟S3中，通過(guò)向Transwell上室、下室中再次加入磷酸鹽緩沖液洗滌并結(jié)合機(jī)械水平振蕩，便于殘留的細(xì)胞脫離，能夠再次收集殘留于Transwell膜兩側(cè)的細(xì)胞以及嵌于Transwell膜微孔內(nèi)的細(xì)胞。洗漆中采用水平機(jī)械振蕩使細(xì)胞從Transwell通透性膜上、上表面脫離而非常規(guī)的吸管吹打細(xì)胞致其脫離，可以有效減少對(duì)細(xì)胞的損傷、提高收集率，并可簡(jiǎn)化操作，提高操作效率。
[0024]在步驟S4中，經(jīng)離心、重懸操作，分別收集得到目標(biāo)細(xì)胞。
[0025]在優(yōu)選條件下，上述細(xì)胞體外收集方法可以分別做如下優(yōu)化:
[0026]優(yōu)化一:方法中使用洗滌液為pH 7.4的磷酸緩沖溶液。
[0027]優(yōu)化二:步驟S2中，在胰酶細(xì)胞消化液含0.25%胰酶和0.01 % EDTA條件下，胰酶細(xì)胞消化液加入量以分別覆蓋Transwell上室與下室底部為宜。胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的類型和細(xì)胞的性質(zhì)關(guān)系密切，不同的組織或細(xì)胞系對(duì)胰蛋白酶的作用反應(yīng)不一樣，胰蛋白酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)。經(jīng)前期試驗(yàn)確定，本發(fā)明方法中，在與Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的條件下，Transwell上室、下室中胰酶細(xì)胞消化液的量是重要的細(xì)胞分散控制條件。針對(duì)常用Transwell培養(yǎng)室，建議的胰酶細(xì)胞消化液加入量為:24孔Transwell培養(yǎng)室(Transwell小室直徑6.5mm)上室加0.1ml、下室加
0.6ml ； 12 孔 Transwell 培養(yǎng)室(Transwell 小室直徑 12mm)上室加 0.5ml、下室加 1.5ml ；6孔Transwell培養(yǎng)室(Transwell小室直徑24mm)上室加1.5ml、下室加2.6ml。
[0028]優(yōu)化三:步驟S2中，使用100%牛血清終止消化反應(yīng)，其目的是減少離心管中液體總體積，減少后續(xù)離心時(shí)間提高細(xì)胞收集量。由于步驟S2中采用向收集有磷酸鹽緩沖液和胰酶液的離心管中加入牛血清終止消化反應(yīng)，離心管中事先收集的磷酸鹽緩沖液已對(duì)胰酶液起到分散作用，因此使用100%牛血清可以順利終止消化反應(yīng)，并在此基礎(chǔ)上控制離心管中液體總體積，提高收集效率。
[0029]優(yōu)化四:步驟S3中，水平振蕩采用水平搖床振蕩，條件為100r/min~150r/min、振蕩5min。在細(xì)胞消化操作中，采用吸管吹打細(xì)胞是使貼壁細(xì)胞脫落分散的常規(guī)方式，但本發(fā)明經(jīng)前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于Transwell小室底部通透性膜結(jié)構(gòu)的特殊性，采用吸管吹打很難使嵌附在通透性膜微孔內(nèi)的細(xì)胞完全脫落下來(lái)，并且容易產(chǎn)生氣泡，對(duì)細(xì)胞損壞大，細(xì)胞收集效率不高。而采用水平搖床實(shí)現(xiàn)的輕微機(jī)械振蕩并有效控制振蕩幅度，避免吹打細(xì)胞時(shí)細(xì)胞受力不均，同時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，利于附著在微孔材料內(nèi)與通透性膜表面的細(xì)胞均勻脫落。既能較少細(xì)胞損傷，又顯著提高了收集率。
[0030]優(yōu)化五:步驟S4中，將Transwell上室、下室離心管離心，離心條件為:轉(zhuǎn)速200RCF(xg)~250RCF(xg)、時(shí)間 lOmin。 [0031]優(yōu)化六:步驟S4中，向離心管中加入pH 7.35~7.45磷酸鹽緩沖液0.5ml~1ml。
[0032]本發(fā)明細(xì)胞體外收集方法可應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)行為分析試驗(yàn)，包括但不限于細(xì)胞克隆、細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞基因和蛋白的表達(dá)試驗(yàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)等。
[0033]采用本發(fā)明體外細(xì)胞收集方法收集到的細(xì)胞是在相同趨化因子誘導(dǎo)下表現(xiàn)出高、低兩種遷移活性的細(xì)胞，可作用理想的細(xì)胞材料應(yīng)用于細(xì)胞遷移的細(xì)胞生物學(xué)行為與分子生物學(xué)研究，包括細(xì)胞克隆、增殖，凋亡、基因和蛋白的表達(dá)，以及形態(tài)學(xué)檢測(cè)等。基于此，本發(fā)明提供一種體外細(xì)胞材料，其技術(shù)方案如下:
[0034]一種體外細(xì)胞材料，其特征在于:包括由相同趨化因子誘導(dǎo)下分離產(chǎn)生的高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料；所述體外細(xì)胞材料的制備首先采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)使原始細(xì)胞材料在趨化因子誘導(dǎo)下遷移培養(yǎng)，當(dāng)Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束后采用上述體外細(xì)胞收集方法收集細(xì)胞，自Transwell上室中收集得到的細(xì)胞材料是所述低遷移性活細(xì)胞材料，自Transwell下室中收集得到的細(xì)胞材料是所述高遷移性活細(xì)胞材料。
[0035]上述體外細(xì)胞材料可應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)行為分析試驗(yàn)，包括但不限于細(xì)胞克隆、細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)等。
[0036]本發(fā)明體細(xì)胞收集方法可與多種細(xì)胞生物學(xué)行為實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合，包括細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、基因和蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)，以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)等。其技術(shù)方案如下:
[0037]—種細(xì)胞生物學(xué)行為分析方法，是一種細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于:首先采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)使原始細(xì)胞材料在趨化因子誘導(dǎo)下遷移培養(yǎng)，當(dāng)Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束后采用上述體外細(xì)胞收集方法收集細(xì)胞，分別得到高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料；其次分別將所述高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料接種至細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)；當(dāng)體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束分別檢測(cè)高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料形態(tài)；所述細(xì)胞體外培養(yǎng)中選用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件根據(jù)原始細(xì)胞材料特性確定。[0038]一種細(xì)胞生物學(xué)行為分析方法，是一種細(xì)胞骨架形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于:首先采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)使原始細(xì)胞材料在趨化因子誘導(dǎo)下遷移培養(yǎng)，當(dāng)Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束后采用上述體外細(xì)胞收集方法收集細(xì)胞，分別得到高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料；其次分別對(duì)所述高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料的細(xì)胞骨架染色；染色結(jié)束后觀察檢測(cè)細(xì)胞骨架形態(tài)；所述細(xì)胞骨架染色方法根據(jù)原始細(xì)胞材料特性確定。
[0039]一種細(xì)胞生物學(xué)行為分析方法，是一種細(xì)胞自我更新能力檢測(cè)方法，其特征在于:首先采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)使原始細(xì)胞材料在趨化因子誘導(dǎo)下遷移培養(yǎng)，當(dāng)Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束后采用上述體外細(xì)胞收集方法收集細(xì)胞，分別得到高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料；其次分別對(duì)高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料進(jìn)行細(xì)胞克隆培養(yǎng)；克隆培養(yǎng)結(jié)束后染色檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力；所述細(xì)胞克隆培養(yǎng)條件根據(jù)原始細(xì)胞材料特性確定。
[0040]一種細(xì)胞生物學(xué)行為分析方法，是一種細(xì)胞增殖能力檢測(cè)方法，其特征在于:首先采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)使原始細(xì)胞材料在趨化因子誘導(dǎo)下遷移培養(yǎng)，當(dāng)Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束后采用上述體外細(xì)胞收集方法收集細(xì)胞，分別得到高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料；其次分別檢測(cè)高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料的細(xì)胞增殖能力，檢測(cè)方法根據(jù)原始細(xì)胞材料特性確定。
[0041]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:(I)本發(fā)明體外細(xì)胞收集方法將Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)與體外細(xì)胞培養(yǎng)方法相結(jié)合,對(duì)Transwell體外遷移以后的細(xì)胞進(jìn)行消化與收集，分別收集得到高遷移活性與低遷移活性的細(xì)胞，使Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)從簡(jiǎn)單的分析細(xì)胞的遷移能力和遷移效率拓展到細(xì)胞遷移的細(xì)胞生物學(xué)行為與分子生物學(xué)研究；(2)本發(fā)明外細(xì)胞收集方法在各操作步驟中，通過(guò)設(shè)計(jì)不同細(xì)胞收集方法(在胰酶消化液中收集或在磷酸鹽緩沖液中收集)、控制胰酶細(xì)胞消化液濃度與消化時(shí)間、選擇加入牛血清終止細(xì)胞消化反應(yīng)的步驟與環(huán)境、結(jié)合機(jī)械振蕩輔助細(xì)胞從培養(yǎng)室中脫落分散的方法等六方面主要條件的優(yōu)化，整體上保證了在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的精細(xì)條件下能夠?qū)w移結(jié)果的微量細(xì)胞進(jìn)行有效收集，保證收集到足量的細(xì)胞用于后繼研究；(3)本發(fā)明提供了由相同趨化因子誘導(dǎo)下分離產(chǎn)生的高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料，該材料是理想的細(xì)胞遷移材料，能夠應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)行為與分子生物學(xué)研究；(4)本發(fā)明提供了與體細(xì)胞收集方法相結(jié)合的多種細(xì)胞生物學(xué)行為實(shí)驗(yàn)方法；(5)本發(fā)明方法為體外細(xì)胞遷移機(jī)制與行為研究提供新的技術(shù)手段，且該技術(shù)手段建立在成熟的Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)之上，應(yīng)用范圍廣。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1-1:實(shí)施例1細(xì)胞接種-收集量曲線。結(jié)果顯示細(xì)胞的收集量與接種量成正相關(guān)。
[0043]圖l-2a、圖l_2b顯示細(xì)胞收集效率。圖l_2a顯示實(shí)施例1中細(xì)胞經(jīng)過(guò)Transwell培養(yǎng)16h后，遷移至下室的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)晶紫染色圖片，可見(jiàn)遷移細(xì)胞良好鋪展在小室的膜底面；圖l_2b顯示實(shí)施例1中采取本發(fā)明所用的細(xì)胞消化方法收集上室非遷移細(xì)胞和下室遷移細(xì)胞，Transwell膜表面結(jié)晶紫染色圖片。可見(jiàn)Transwell膜上幾乎沒(méi)有細(xì)胞余留，說(shuō)明本發(fā)明的細(xì)胞收集效率較高。
[0044]圖2a、圖2b顯示實(shí)施例2中細(xì)胞材料分別培養(yǎng)24h后的倒置顯微鏡照片。圖2a表示上室非遷移細(xì)胞，圖2b表示下室遷移細(xì)胞。從圖片中可見(jiàn)，與上室非遷移細(xì)胞不同，遷移的細(xì)胞中有大量細(xì)胞碎片，可見(jiàn)細(xì)胞在遷移過(guò)程中有一定程度的機(jī)械損傷。
[0045]圖3a、圖3b顯示實(shí)施例3中細(xì)胞材料骨架染色結(jié)果。圖3a表示上室非遷移細(xì)胞，圖3b表示下室遷移細(xì)胞。可見(jiàn)細(xì)胞在遷移過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，使得上室非遷移細(xì)胞和下室遷移細(xì)胞呈現(xiàn)明顯不同的細(xì)胞骨架形態(tài)特征。
[0046]圖4a、圖4b顯示實(shí)施例4中細(xì)胞材料進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖4a表示上室非遷移細(xì)胞，圖4b表示下室遷移細(xì)胞。結(jié)果顯示，上室非遷移細(xì)胞形成的細(xì)胞克隆較小而稀疏，下室遷移細(xì)胞形成的克隆較大而致密，說(shuō)明不同遷移活性的細(xì)胞的自我更新能力不
O
[0047]圖5顯示CKK-8法檢測(cè)實(shí)施例5中細(xì)胞材料的增殖曲線。從圖中可以看出，不同遷移活性的細(xì)胞的增殖能力也明顯不同。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例作進(jìn)一步的描述。
[0049]實(shí)施例一
[0050]如圖1-1、圖1-2所示，用本發(fā)明方法對(duì)Transwell體外遷移培養(yǎng)結(jié)束的細(xì)胞進(jìn)行收集。
[0051]本實(shí)施例米用人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,以下簡(jiǎn)稱hMSCs)作為研究對(duì)象，采用人來(lái)源的重組TOGF-BB(血小板衍生生長(zhǎng)因子)作為趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。
[0052]1、實(shí)驗(yàn)材料及試劑
[0053]Transwell小室(即Transwell上室):Coring公司的適用于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的Transwell小室，小室面積4.67cm2，直徑24mm ;貨號(hào):#3428、#354576 ;膜材料為聚碳酸脂(Polycarbonate, PC)或者聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene Terephthalate, PET),孔隙大小8.0um。
[0054]細(xì)胞培養(yǎng)板(即Transwell下室):Corning公司的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，貨號(hào)CLS3516-50EA
[0055]DMEM低糖培養(yǎng)基:Gibco公司產(chǎn)品，貨號(hào)11885-076
[0056]磷酸鹽緩沖液:pH 7.35~7.45
[0057]預(yù)備趨化培養(yǎng)基:將血小板衍生生長(zhǎng)因子(I3DGF-BB)以20ng/ml加入DMEM溶液制得，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0058]血小板衍生生長(zhǎng)因子(I3DGF-BB):R&D公司產(chǎn)品，貨號(hào)220_ΒΒ_050
[0059]胰酶細(xì)胞消化液:含0.25%胰酶和0.01% EDTA的磷酸鹽緩沖液，Gibco公司產(chǎn)品，貨號(hào) R-001-100
[0060]牛血清:Gibco公司產(chǎn)品，貨號(hào)10082147
[0061]結(jié)晶紫:Sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)HT90132
[0062]離心機(jī):Eppendorf公司產(chǎn)品，型號(hào)5810[0063]離心管:材料為聚碳酸酯，50ml, Corning公司產(chǎn)品
[0064]血球計(jì)數(shù)器:sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)Z359629-1EA
[0065]移液槍:Eppendorf公司產(chǎn)品，規(guī)格Iml
[0066]Leica倒置顯微鏡(型號(hào)DMI3000B)
[0067]2、實(shí)驗(yàn)操作
[0068]2.1Transwell體外遷移培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn))
[0069]I)細(xì)胞預(yù)處理
[0070]進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)前換DMEM低糖培養(yǎng)基讓細(xì)胞饑餓24h。
[0071]2)制作細(xì)胞懸液，預(yù)備細(xì)胞遷移
[0072]饑餓培養(yǎng)的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用PBS洗I遍，加入胰酶細(xì)胞消化液Iml~2ml，加入的量以覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)板底部為宜，待細(xì)胞變圓后加入含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，采用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，離心收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)速200RCF(xg)~250RCF(xg),離心時(shí)間5min,用DMEM低糖培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整細(xì)胞密度至2.5 X 105/ml得細(xì)胞懸液，待用。 [0073]3)接種細(xì)胞及培養(yǎng)
[0074]將Transwell小室加入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，構(gòu)成Transwell培養(yǎng)室的上室與下室；向Transwell下室中加入預(yù)備趨化培養(yǎng)基,加入量2ml/孔；
[0075]取細(xì)胞懸液Iml加入Transwell上室,接種時(shí)注意動(dòng)作緩慢,使細(xì)胞均勻接種，并避免產(chǎn)生氣泡；
[0076]將細(xì)胞在37°C 95%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h~24h。
[0077]2.2Transwell體外遷移培養(yǎng)細(xì)胞收集
[0078]步驟S1、初次洗滌收集
[0079]Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束并去除Transwell上室、下室內(nèi)培養(yǎng)液后，在上室、下室中分別加入磷酸鹽緩沖液洗滌培養(yǎng)室，加入量為上室、下室各Iml ；
[0080]收集上室與下室中洗滌液分別存入兩支50ml離心管中，標(biāo)記為離心管A、離心管B0
[0081]步驟S2、消化收集
[0082]向Transwell上室、下室中分別加入37°C預(yù)熱的胰酶細(xì)胞消化液，加入量為上室1.5ml/孔，下室2.6ml/孔^fTranswell培養(yǎng)室置于95 % 二氧化碳培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)2min~5min ;期間可取出Transwell培養(yǎng)室于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞呈圓形且分散懸浮后，分別收集上室、下室中消化液對(duì)應(yīng)加入離心管A、離心管B中；若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在倒置顯微鏡下未呈圓形且分散懸浮，可放入碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞呈圓形且分散懸浮。
[0083]分別向離心管A、B中加入100%牛血清終止細(xì)胞消化，加入量為胰酶細(xì)胞消化液的 10%~20%。
[0084]步驟S3、再次洗滌收集
[0085]分別向Transwell上室、下室中加入磷酸鹽緩沖液洗滌培養(yǎng)室，加入量同步驟SI ；
[0086]將Transwell培養(yǎng)室(裝有Transwell培養(yǎng)小室的Corning6孔細(xì)胞培養(yǎng)板)置于水平搖床，100r/min~150r/min、時(shí)間5min,
[0087]分別收集上室、下室中洗滌液對(duì)應(yīng)加入離心管A、離心管B中；
[0088]重復(fù)以上操作。[0089]步驟S4、離心收集細(xì)胞
[0090]將離心管A、離心管B離心，轉(zhuǎn)速200RCF(xg)~250RCF(xg)，時(shí)間IOmin ；
[0091]分別去除上清液，向離心管A、離心管B中加入磷酸鹽緩沖液0.5ml~Iml ;分別收集并重懸離心管A、B底部細(xì)胞團(tuán)塊，收集到目標(biāo)細(xì)胞。其中，離心管A中是以人來(lái)源的重組TOGF-BB為趨化因子誘導(dǎo)下分離產(chǎn)生的低遷移活性細(xì)胞，離心管B中是以人來(lái)源的重組TOGF-BB為趨化因子誘導(dǎo)下分離產(chǎn)生的高遷移活性細(xì)胞。
[0092]用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，計(jì)算上室、下室的細(xì)胞比率、細(xì)胞遷移率、以及細(xì)胞收集效率(圖1-1);通過(guò)結(jié)晶紫染色分析細(xì)胞收集效率(圖l-2a、圖l-2b)。
[0093]本實(shí)施例中，結(jié)晶紫染色濃度0.1 %,時(shí)間10分鐘；采用Leica倒置顯微鏡DMI3000 B進(jìn)行拍照。
[0094]實(shí)施例二
[0095]相同趨化因子誘導(dǎo)下分離產(chǎn)生的高遷移性活細(xì)胞與低遷移活性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
[0096]細(xì)胞培養(yǎng)基:含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基
[0097]DMEM低糖培養(yǎng)基:同實(shí)施例一
[0098]倒置顯微鏡:同實(shí)施例一
[0099]以實(shí)施例一收集所得離心管A、離心管B中細(xì)胞為材料，分別接種至細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37°C、95%二氧化碳培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24h后在倒置顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(圖 2a、圖 2b)。
[0100]實(shí)施例三
[0101]相同趨化因子誘導(dǎo)下分離產(chǎn)生的高遷移性活細(xì)胞與低遷移活性細(xì)胞的細(xì)胞骨架形態(tài)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
[0102]四甲基羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)妝(Phalloidin - Tetramethylrhodamine Bisothiocyanate:Sigma 公司產(chǎn)品，貨號(hào) P1951
[0103]倒置顯微鏡:同實(shí)施例一
[0104]以實(shí)施例一收集所得離心管A、離心管B中細(xì)胞為材料，分別采用四甲基羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞染色，倒置顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞骨架形態(tài)特征(圖3a、圖3b)。
[0105]本實(shí)施例中，鬼筆環(huán)肽染色方法參照Sigma產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。
[0106]實(shí)施例四
[0107]相同趨化因子誘導(dǎo)下分離產(chǎn)生的高遷移性活細(xì)胞與低遷移活性細(xì)胞的自我更新能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
[0108]細(xì)胞培養(yǎng)板、倒置顯微鏡、結(jié)晶紫均同實(shí)施例一
[0109]以實(shí)施例一收集所得離心管A、離心管B中細(xì)胞為材料，分別接種至細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度100個(gè)/孔，培養(yǎng)時(shí)間8d~IOd ;見(jiàn)到明顯可見(jiàn)的細(xì)胞克隆后結(jié)束培養(yǎng)，采用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行染色采用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察(圖4a、圖4b)。
[0110]本實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)條件和結(jié)晶紫染色方法同實(shí)施例一。
[0111]實(shí)施例五
[0112]相同趨化因子誘導(dǎo)下分離產(chǎn)生的高遷移性活細(xì)胞與低遷移活性細(xì)胞的增殖能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。[0113]CCK-8 試劑:Sigma 公司產(chǎn)品，貨號(hào) 96992-500TESTS
[0114]以實(shí)施例一收集所得離心管A、離心管B中細(xì)胞為材料，分別采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力(圖5)。
[0115]本實(shí)施例中，采用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞接種量為2000個(gè)/孔，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為1、
3、5、7、9天。檢測(cè)時(shí)CCK-8加入量為IOul/孔，檢測(cè)吸光度為450nm。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞體外收集方法，其特征在于:應(yīng)用于Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束并去除Transwell上室、下室內(nèi)培養(yǎng)液后，采用胰酶消化并結(jié)合機(jī)械振蕩的方法分別對(duì)Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)后上室、下室中的細(xì)胞進(jìn)行消化、收集；胰酶細(xì)胞消化操作中，洗滌液為PH 7.35~7.45磷酸鹽緩沖液，胰酶細(xì)胞消化液含0.25%胰酶和0.01% EDTAo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:依如下步驟實(shí)施: 步驟S1、初次洗滌 Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束并去除Transwell上室、下室內(nèi)培養(yǎng)液后，在上室、下室中分別加入磷酸鹽緩沖液洗滌培養(yǎng)室，收集上室與下室中洗滌液分別存入二離心管中，分別標(biāo)記為離心管A、離心管B ; 步驟S2、消化收集 向Transwell上室、下室中分別加入胰酶細(xì)胞消化液，待細(xì)胞分散懸浮，分別收集上室、下室中消化液對(duì)應(yīng)加入離心管A、離心管B中，分別向離心管A、離心管B中加入牛血清終止細(xì)胞消化； 步驟S3、再次洗滌收集 分別向Transwell上室、下室中加入磷酸鹽緩沖液,將Transwell培養(yǎng)室水平振蕩，分別收集上室、下室中洗滌液對(duì)應(yīng)加入離心管A、離心管B中； 步驟S4、離心收集細(xì)胞 將離心管A、離心管B離心，去除上清液，分別向離心管A、離心管B中加入磷酸鹽緩沖液，重懸并收集離心管底部細(xì)胞團(tuán)塊，得收集細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述步驟S2中，胰酶細(xì)胞消化液加入量為分別覆蓋Transwell上室與下室底部。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述步驟S2中，胰酶細(xì)胞消化液加入量是如下之一: 24孔Transwell培養(yǎng)室，上室加0.1ml、下室加0.6ml ； 12孔小室Transwell培養(yǎng)室，上室加0.5ml、下室加1.5ml ； 6孔小室Transwell培養(yǎng)室，上室加1.5ml、下室加2.6ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述步驟S2中，分別向離心管中加入100%牛血清終止細(xì)胞消化反應(yīng)，加入量是胰酶細(xì)胞消化液加入量的10%~20%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述步驟S3中，所述水平振蕩是水平搖床振蕩，100r/min ~150r/min、時(shí)間 5min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6任一所述的細(xì)胞體外收集方法，其特征在于:應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)行為分析試驗(yàn)。
8.一種利用權(quán)利要求1~6任一所述的細(xì)胞體外收集方法實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞生物學(xué)行為分析方法，是一種細(xì)胞檢測(cè)方法，其特征在于:依如下步驟實(shí)施: 步驟S1、首先采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)使原始細(xì)胞材料在趨化因子誘導(dǎo)下遷移培養(yǎng)，當(dāng)Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束后采用上述體外細(xì)胞收集方法收集細(xì)胞，分別得到高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料； 步驟S2、實(shí)施如下檢測(cè)方法之一之一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè):分別將所述高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料接種至細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)；當(dāng)體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束分別檢測(cè)高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料形態(tài)；所述細(xì)胞體外培養(yǎng)中選用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件根據(jù)原始細(xì)胞材料特性確定； 之二、細(xì)胞骨架形態(tài)學(xué)檢測(cè):分別對(duì)所述高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料的細(xì)胞骨架染色；染色結(jié)束后觀察檢測(cè)細(xì)胞骨架形態(tài)；所述細(xì)胞骨架染色方法根據(jù)原始細(xì)胞材料特性確定； 之三、細(xì)胞自我更新能力檢測(cè):分別對(duì)高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料進(jìn)行細(xì)胞克隆培養(yǎng)；克隆培養(yǎng)結(jié)束后染色檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力；所述細(xì)胞克隆培養(yǎng)條件根據(jù)原始細(xì)胞材料特性確定； 之四、細(xì)胞增殖能力檢測(cè):分別檢測(cè)高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料的細(xì)胞增殖能力，檢測(cè)方法根據(jù)原始細(xì)胞材料特性確定。
9.一種體外細(xì)胞材料，其特征在于:包括由相同趨化因子誘導(dǎo)下分離產(chǎn)生的高遷移性活細(xì)胞材料與低遷移活性細(xì)胞材料；所述體外細(xì)胞材料的制備首先采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)使原始細(xì)胞材料在趨化因子誘導(dǎo)下遷移培養(yǎng)，當(dāng)Transwell細(xì)胞遷移培養(yǎng)結(jié)束后采用上述體外細(xì)胞收集方法收集細(xì)胞，自Transwell上室中收集得到的細(xì)胞材料是所述低遷移性活細(xì)胞材料，自Transwell下室中收集得到的細(xì)胞材料是所述高遷移性活細(xì)胞材料。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的體外細(xì)胞材料在細(xì)胞生物學(xué)行為分析試驗(yàn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK104017768SQ201410280422
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】李娟 , 郝晉, 趙志河, 王婭婷, 方善寶 申請(qǐng)人:四川大學(xué)