一種制備巨桿菌素Bacimethrin的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用海洋細(xì)菌發(fā)酵制備巨桿菌素Bacimethrin的方法。巨桿菌素(Bacimethrin,4-Amino-2-methoxy-5-pyrimidylmethanol)分子量為155.16，分子式為C6H9N3O2。通過天然產(chǎn)物分離方法從海洋解淀粉芽孢桿菌B5(Bacillus?amyloliquefaciens?strain?chenj-5)發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到。
【專利說明】—種制備巨桿菌素Bacimethr in的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種小分子化合物制備方法，特別是一種來源于海洋微生物的巨桿菌
素生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在動(dòng)植物養(yǎng)殖業(yè)，長(zhǎng)期高劑量使用化學(xué)藥物和抗生素的驅(qū)動(dòng)下，產(chǎn)生了耐藥性的病害菌，使得動(dòng)植物病害的防治越來越難，同時(shí)對(duì)人類食物安全及人類健康形成了極大的威脅，人們不得不尋找新的防治方法。生物防治技術(shù)及新型綠色抗生素的開發(fā)應(yīng)用成為了新寵。從陸生的微生物分離化合物在一個(gè)世紀(jì)前就開始了，想從中尋找新型物質(zhì)的難度太大，而海洋微生物的發(fā)現(xiàn)及開發(fā)還剛剛開始。
[0003]本文就從海洋解淀粉芽孢桿菌B5發(fā)酵產(chǎn)物中首次分離獲得巨桿菌素，并研究發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抑菌特性。目前關(guān)于巨桿菌素的生產(chǎn)分離和生物活性分析還未見相關(guān)專利及文獻(xiàn)研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種巨桿菌素分離純化方法
[0005]A海洋微生物B5發(fā)酵產(chǎn)物預(yù)處理:海洋微生物B5發(fā)酵產(chǎn)物煮沸10分鐘，靜置過夜或離心分離，去除熱凝固物及固體顆粒獲得上清液。將上清液依次通過10000分子量、1000分子量超濾膜和300分子量的納濾膜，獲得小于300分子量的膜下過濾液。將此過濾液真空濃縮至原體積的1/5。
[0006]B將上述濃縮液移至分液漏斗或萃取罐中，按體積比為1:1加入乙酸乙酯充分混勻萃取10分鐘，靜置10分鐘分離，分離乙酸乙酯相。再在殘余相中加入等體積新乙酸乙酯按上述方法萃取，共萃取3次。合并3次萃取液，減壓濃縮，回收乙酸乙酯，獲得乙酸乙酯萃取相浸膏。
[0007]C稱取適量上述乙酸乙酯萃取相浸膏用少量甲醇溶解拌入ODS填料中，自然揮干或減壓干燥后裝入(20mm*100mm)制備液相柱的預(yù)裝柱中。利用5個(gè)柱體積的5%甲醇水溶液按20ml/min流量潤(rùn)洗ODS制備柱(25mm*5OOmm)。連接上上述的預(yù)裝柱,按下述表1洗脫梯度進(jìn)行洗脫，按每管45ml接取洗脫液，278nm處檢測(cè)洗脫峰，收集15.35min處的洗脫峰，并依次標(biāo)號(hào)，真空旋轉(zhuǎn)濃縮各管洗脫液。用少量純甲醇溶解后利用高效液相色譜測(cè)定各接收管中巨桿菌素純度。
[0008]所述梯度洗脫如下:
[0009]表1中壓制備液相梯度洗脫表
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種制備巨桿菌素Bacimethrin的方法,其特征在于步驟如下: A海洋解淀粉芽孢桿菌B5的發(fā)酵產(chǎn)物的預(yù)處理:海洋解淀粉芽孢桿菌B5的發(fā)酵產(chǎn)物煮沸10分鐘，靜置過夜或離心分離，去除固體獲得上清液；將上清液依次通過截留分子量為lOOOODa、100Da和300Da的納濾膜，獲得小于300Da分子量的膜下過濾液；將此過濾液真空濃縮至原體積的1/5得到濃縮液； 其中所述的海洋解淀粉芽孢桿菌B5在國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2014年5月27日，保藏單位名稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNO:M2014229。 B將濃縮液移至分液漏斗或萃取罐中，按體積比為1:1加入乙酸乙酯充分混勻萃取10分鐘，靜置10分鐘水相和有機(jī)相分離，收集乙酸乙酯相；再在殘余水相中加入等體積的乙酸乙酯按上述方法萃取，合計(jì)萃取3次；合并3次的乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，回收乙酸乙酯，獲得乙酸乙酯萃取相的浸膏。 C稱取乙酸乙酯萃取相的浸膏，用甲醇溶解浸膏并拌入ODS填料中，自然揮干或減壓干燥后裝入20_*100_的制備液相柱的預(yù)裝柱中；利用3個(gè)柱體積的5%質(zhì)量濃度的甲醇水溶液，按16ml/min的流速潤(rùn)洗25mm*500mm的ODS制備柱；連接上上述的預(yù)裝柱，梯度洗脫，按每管45ml接取洗脫液，278nm處檢測(cè)洗脫峰，收集15.35min處附近的洗脫峰，并依次標(biāo)號(hào)；利用高效液相色譜測(cè)定各接收管濃縮物中巨桿菌素的純度； 所述梯度洗脫如下: 表1中壓制備液相梯度洗脫表
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備巨桿菌素Bacimethrin的方法，其特征為所述海洋解淀粉芽孢桿菌B5的發(fā)酵產(chǎn)物通過如下方法制備獲得: A菌種的活化:取海洋解淀粉芽孢桿菌B5，采用劃線法接種于海水TSB固體斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)18小時(shí)，得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的斜面培養(yǎng)物； 其中海水TSB固體斜面培養(yǎng)基的配置方法為:稱取胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，15g瓊脂粉利用陳海水加熱攪拌溶解后，加陳海水定容至1000ml，利用NaOH調(diào)整PH = 7.2—7.5，再在121°C條件下滅菌15min后獲得海水TSB固體斜面培養(yǎng)基。 B種子液的制備:將海洋解淀粉芽孢桿菌B5固體斜面培養(yǎng)物在無菌條件下，挑取2-3環(huán)菌體接種到裝有10mL無菌海水TSB液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中28°C、180r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)18小時(shí)，獲得海洋解淀粉芽孢桿菌B5種子液； 其中海水TSB液體培養(yǎng) 基的配置方法為:稱取胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，利用陳海水加熱攪拌溶解后，加陳海水定容至1000ml，利用NaOH調(diào)整PH = 7.2—7.5，再在121°C條件下滅菌15min后獲得海水液體培養(yǎng)基。 C發(fā)酵培養(yǎng):在通氣攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入巨桿菌素發(fā)酵培養(yǎng)基，在121°C下維持15min滅菌后，接入種子液攪拌發(fā)酵，獲得發(fā)酵產(chǎn)物。種子液預(yù)先利用無菌海水調(diào)整種子液的濃度至2.0*107cfu/ml，種子液的接種量按2% (v/v)接入；攪拌發(fā)酵環(huán)境參數(shù)為:通氣量1.2vvm，溫度為28°C，攪拌速度為每分鐘150轉(zhuǎn)；發(fā)酵時(shí)間為36小時(shí)。 其中巨桿菌素發(fā)酵培養(yǎng)基的配置方法為:按照質(zhì)量體積百分比加入葡萄糖0.25%,NaC12%，豆餅粉1.7%, K2HP030.25%，利用水加熱攪拌溶解后，利用堿水調(diào)整PH = 7.2—7.5，再在121°C條件下滅菌20min后獲得液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備巨桿菌素Bacimethrin的方法，其特征為所述海洋解淀粉芽孢桿菌B5的分離方法如下: ⑴樣品的采集:在連云港海域用無菌采樣袋及無菌采樣工具采集海水、海泥、海帶、滸苔、裙帶菜、龍須菜、紫菜樣品，注明樣品名稱、采集日期以及采集地點(diǎn)； ⑵樣品的富集: 海水樣品采集來的海水混勻，取1mL加入到裝有10mL無菌海水TSB液體富集培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28°C、180r/min的條件下?lián)u床富集培養(yǎng)2d得到海水富集培養(yǎng)物； 海泥樣品采集來的海泥采用五點(diǎn)法采樣再混勻，取1g海泥放入事先滅好菌的裝有10ml海水TSB液體富集培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28°C、180r/min的條件下?lián)u床富集培養(yǎng)2d得到海泥富集培養(yǎng)物； 海帶樣品用無菌海水沖洗海帶樣品3次后，放入無菌組織搗碎機(jī)中破碎至糊狀，取1g海帶破碎物加入到裝有10mL無菌海水TSB液體富集培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28°C、180r/min的條件下?lián)u床富集培養(yǎng)2d得到海帶富集培養(yǎng)物； 滸苔、裙帶菜、龍須菜和紫菜樣品處理同海帶樣品處理，分別得到滸苔、裙帶菜、龍須菜和紫菜富集培養(yǎng)物； ⑶海洋細(xì)菌的分離及純化:分別取ImL上述富集培養(yǎng)物的清液放入盛有9mL無菌海水的試管中，進(jìn)行梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6稀釋度樣品0.1mL涂布到直徑9cm的海水TSB固體分離培養(yǎng)基平板上，28°C倒置培養(yǎng)2d，每個(gè)稀釋梯度重復(fù)3次，觀察并挑取形態(tài)、顏色不同的菌落，采用三區(qū)劃線方法進(jìn)行純化，得到若干海洋細(xì)菌純菌株； ⑷鰻弧菌拮抗菌的分離和篩選:將鰻弧菌在無菌條件下，挑取2-3環(huán)菌體接種到裝有10mL無菌海水TSB液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28°C、180r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)18小時(shí)，獲得鰻弧菌種子液；取0.1ml上述鰻弧菌種子液涂布到海水TSB固體平板上，在上述每只平板上均勻點(diǎn)種一株步驟⑶中獲得的海洋細(xì)菌，在28°C條件下進(jìn)行共培養(yǎng)36小時(shí)，觀察并測(cè)量抑菌圈大小，篩選出對(duì)鰻弧菌具有拮抗效果的海洋細(xì)菌即得到海洋解淀粉芽孢桿菌B5。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種制備巨桿菌素Bacimethrin的方法，其特征為所述海洋解淀粉芽孢桿菌B5的gyrB基因序列如序列表SEQ ID N0.1所示，NCBI登記號(hào)為JN859130.1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備巨桿菌素Bacimethrin的方法，其特征為所述海洋解淀粉芽孢桿菌B5的1 6SrDNA基因序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104030991SQ201410280482
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】夏艷秋, 朱強(qiáng), 詹永成, 陳靜, 張曉君, 史大華, 郭瑛, 許福泉, 閻斌倫 申請(qǐng)人:淮海工學(xué)院