一種固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶及其制備方法。所述固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，包括碳納米管基質(zhì)和洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，所述洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶通過親和吸附和/或共價結合的方式結合在碳納米管基質(zhì)的開放端口、表面和內(nèi)壁。所述制備方法包括以下步驟：(1)硫酸超聲處理碳納米管；(2)制備碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液；(3)將碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液在4℃至60℃下，振蕩反應，獲得所述固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶。本發(fā)明提供的固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶增加了酶蛋白在反應體系中的分散性，獲得了較高的轉(zhuǎn)酯催化酶活，大大縮短了達到反應平衡所需的時間。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶的固定化領域，更具體地，涉及一種固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂 肪酶。 一種固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶及其制備方法

【背景技術】
[0002] 洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶（BCL)是一種胞外脂肪酶，在水相和非水相均具有催化 活性。BCL對多種有機溶劑具有較高抗性，因此廣泛應用于非水相催化反應，尤其在制備生 物柴油及手性藥物的對映拆分領域有著較多應用。但由于酶蛋白本身具有較強的親水性， 游離的酶粉不易分散于溶劑中，能夠形成的相對有效的反應界面較小，故存在催化活性低、 反應時間長等缺點，在一定程度上限制了 BCL在工業(yè)上的應用。然而，將固定化酶技術應用 于BCL的制備，能夠提高BCL在非水相溶劑中的轉(zhuǎn)酯酶活，縮短反應時間。
[0003] 固定化酶技術在實際生產(chǎn)中應用已經(jīng)得到了一定的實現(xiàn)，目前已有的BCL固定化 方法根據(jù)固定化作用力主要分為化學法和物理法?；瘜W方法主要有無載體交聯(lián)法的使用， Hara P，Hanefeld U，Kanerva L T分別用溶膠包埋法和無載體交聯(lián)法對BCL進行了固定化， 兩種不同固定化方法的反應時間仍需要24h以上，化學方法介導制備的固定化酶通常具有 較好的穩(wěn)定性和良好的再利用率，因為制備過程中形成的化學鍵連接相對物理方法更加牢 靠穩(wěn)固，但對酶蛋白原本的結構也具有較大程度的破壞，導致其蛋白構象變化，從而無法得 到較高的酶活。鑒于這一特性，目前對于BCL固定化的報道的大部分都是關于物理方法的 研究工作。物理方法主要通過范德華力和氫鍵等吸附作用，包括物理吸附法、微膠囊法、溶 膠包埋等方法，物理吸附法主要優(yōu)點在于制備條件溫和、酶活性中心空間構象不被破壞等。 但目前的物理固定BCL的方法催化反應時間較長，轉(zhuǎn)酯得率不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術的以上缺陷或改進需求，本發(fā)明提供了一種固定化的洋蔥伯克霍爾 德脂肪酶及其制備方法，其目的在于通過選擇適當?shù)幕|(zhì)和方法將洋蔥伯克霍爾德脂肪酶 固定化，由此解決目前固定化的洋蔥伯克霍爾德脂肪酶催化梵音趕時間較長，轉(zhuǎn)酯得率不 不高技術問題。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種固定化的洋蔥伯克霍爾德 菌脂肪酶，其特征在于，包括碳納米管基質(zhì)和洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，所述洋蔥伯克霍爾 德菌脂肪酶通過親和吸附和/或共價結合的方式結合在碳納米管基質(zhì)的開放端口、表面和 內(nèi)壁。
[0006] 優(yōu)選地，所述固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，其碳納米管基質(zhì)為經(jīng)硫酸超聲 處理的碳納米管。
[0007] 按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的制備方 法，其特征在于，包括以下步驟：
[0008] (1)硫酸超聲處理碳納米管：將每克碳納米管與100ml至300ml的濃硫酸均勻混 合，200W至250W超聲處理2小時至5小時，洗滌并過濾后干燥，研磨得到硫酸超聲處理的碳 納米管；
[0009] (2)制備碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液：將步驟（1)中獲得的硫酸 超聲處理的碳納米管加入到洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液中，使得所述碳納米管與洋蔥伯 克霍爾德菌脂肪酶的質(zhì)量比例在1:0. 5至1:6之間，形成碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂 肪酶混合液；
[0010] (3)制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶：將步驟（2)中獲得的碳納米管與洋 蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液在4°C至60°C下，振蕩反應1小時至6小時，離心去掉上清液 獲得所述固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶。
[0011] 優(yōu)選地，所述制備方法，還包括步驟：
[0012] (4)制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶干粉：將步驟（3)中獲得的固定化的 洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，冷凍干燥，研磨成粉狀。
[0013] 優(yōu)選地，所述制備方法，其步驟（1)過濾時采用醋酸纖維作為濾膜。
[0014] 優(yōu)選地，所述制備方法，其步驟（2)所述洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液，其pH值在 5.0至8.0之間。
[0015] 總體而言，通過本發(fā)明所構思的以上技術方案與現(xiàn)有技術相比，由于借助于碳納 米管六元環(huán)結構對生物蛋白分子的親和作用，利用濃硫酸超聲處理碳納米管，使其封閉端 口打開，碳納米管本身被適當截短，增大其比表面積，使洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶能較好的 吸附到碳納米管上，增加了酶蛋白在反應體系中的分散性，獲得了較高的轉(zhuǎn)酯催化酶活，大 大縮短了達到反應平衡所需的時間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是實施例1酸處理后的碳納米管掃描電鏡表征圖；
[0017] 圖2是實施例5固定化洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的催化活力測定結果圖；
[0018] 圖3是實施例6時間對固定化效率及固定化酶活的影響實驗結果圖；
[0019] 圖4是實施例7pH對固定化效率及固定化酶活的影響實驗結果圖。

【具體實施方式】
[0020] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術特征只要 彼此之間未構成沖突就可以相互組合。
[0021] 為了探索提高BCL轉(zhuǎn)酯得率的同時縮短反應時間的有效固定化方法，我們對多種 載體做了篩選嘗試，發(fā)現(xiàn)一種新型納米材料，即碳納米管，能有效完成上述要求，為BCL在 對映手性物質(zhì)拆分的工業(yè)化應用上奠定了堅實技術基礎。
[0022] 碳納米管（CNTs)，又名巴基管，主要由呈六元環(huán)排列的碳原子構成數(shù)層到數(shù)十層 的同軸圓管。碳納米管具有直徑小、比表面積大的基本納米材料特征，有良好的導電性和熱 傳導性能，同時具有穩(wěn)定的化學性質(zhì)和熱穩(wěn)定性以及良好的生物兼容性。為解決洋蔥伯克 霍爾德菌脂肪酶固定化酶轉(zhuǎn)酯得率低、非水相溶劑內(nèi)催化反應平衡時間長等問題，我們首 次嘗試借助于碳納米管六元環(huán)結構對生物蛋白分子的親和作用，利用濃硫酸超聲處理碳納 米管，使其封閉端口打開，碳納米管本身被適當截短，增大其比表面積，使洋蔥伯克霍爾德 菌脂肪酶能較好的吸附到碳納米管上，增加了酶蛋白在反應體系中的分散性，獲得了較高 的轉(zhuǎn)酯催化酶活，大大縮短了達到反應平衡所需的時間。
[0023] 本發(fā)明提供的固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，包括碳納米管基質(zhì)和洋蔥伯克 霍爾德菌脂肪酶，所述洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶通過親和吸附和/或共價結合的方式結合 在碳納米管基質(zhì)的開放端口、表面和內(nèi)壁。所述碳納米管基質(zhì)優(yōu)選為經(jīng)硫酸超聲處理的碳 納米管，其電鏡掃描圖，如圖1所示。
[0024] 本發(fā)明提供的固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，其制備方法，包括以下步驟：
[0025] (1)硫酸超聲處理碳納米管：將每克碳納米管與100ml至300ml的濃硫酸均勻混 合，200W至250W超聲處理2小時至5小時，洗滌并過濾后干燥，研磨得到硫酸超聲處理的碳 納米管；優(yōu)選醋酸纖維作為濾膜。
[0026] (2)制備碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液：將步驟（1)中獲得的硫酸 超聲處理的碳納米管加入到洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液中，使得所述碳納米管與洋蔥伯 克霍爾德菌脂肪酶的質(zhì)量比例在1:0. 5至1:6之間，形成碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂 肪酶混合液；所述洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液，其優(yōu)選pH值在5. 0至8. 0之間，優(yōu)選pH 值為7.0。
[0027] (3)制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶：將步驟⑵中獲得的碳納米管與洋 蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液在4-60°C下，振蕩反應1-6小時，離心去掉上清液獲得所述 固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶。
[0028] (4)制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶干粉：將步驟⑶中獲得的固定化的 洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，冷凍干燥，研磨成粉狀。
[0029] 以下為實施例：
[0030] 實施例1
[0031] 一種固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，包括碳納米管基質(zhì)和洋蔥伯克霍爾德菌 脂肪酶，所述洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶通過親和吸附和/或共價結合的方式結合在碳納米 管基質(zhì)的開放端口、表面和內(nèi)壁。
[0032] 所述碳納米管基質(zhì)為經(jīng)硫酸超聲處理的碳納米管，制備步驟如下：
[0033] 取1. 5g碳納米管與150ml98 %的濃硫酸分別加入一 200ml燒杯中，攪拌使其混合 均勻，250W超聲處理4h。超聲完成，將混合液緩慢稀釋至中性，用醋酸纖維薄膜過濾，并用 清水洗滌3次以上，盡可能的減少硫酸根離子殘留。將濾得物置于60°C的烘箱中干燥，至完 全干燥（既稱量質(zhì)量不再變化），研磨成粉末狀，收集粉末即為功能化的碳納米管。酸處理 后的碳納米管掃描電鏡表征圖如圖1所示。
[0034] 實施例2
[0035] -種固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，其制備方法，包括以下步驟：
[0036] (1)硫酸超聲處理碳納米管：將每克碳納米管與100ml的濃硫酸均勻混合，200W超 聲處理5小時，洗滌并醋酸纖維濾膜過濾后干燥，研磨得到硫酸超聲處理的碳納米管。
[0037] (2)制備碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液：將步驟（1)中獲得的硫酸 超聲處理的碳納米管加入到洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液中，使得所述碳納米管與洋蔥伯 克霍爾德菌脂肪酶的質(zhì)量比例為1:0. 5,形成碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液； 所述洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液，其pH值為7. 0。
[0038] (3)制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶：將步驟⑵中獲得的碳納米管與洋 蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液在4°C下，振蕩反應6小時，離心去掉上清液獲得所述固定化 的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶。
[0039] (4)制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶干粉：將步驟⑶中獲得的固定化的 洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，冷凍干燥，研磨成粉狀。
[0040] 實施例3
[0041] 一種固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，其制備方法，包括以下步驟：
[0042] (1)硫酸超聲處理碳納米管：將每克碳納米管與300ml的濃硫酸均勻混合，250W超 聲處理2小時，洗滌并醋酸纖維濾膜過濾后干燥，研磨得到硫酸超聲處理的碳納米管。
[0043] (2)制備碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液：將步驟（1)中獲得的硫酸 超聲處理的碳納米管加入到洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液中，使得所述碳納米管與洋蔥伯 克霍爾德菌脂肪酶的質(zhì)量比例為1:6,形成碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液； 所述洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液，其pH值為5. 0。
[0044] (3)制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶：將步驟（2)中獲得的碳納米管與洋 蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液在60°C下，振蕩反應1小時，離心去掉上清液獲得所述固定 化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶。
[0045] (4)制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶干粉：將步驟（3)中獲得的固定化的 洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，冷凍干燥，研磨成粉狀。
[0046] 實施例4
[0047] -種固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，其制備方法，包括以下步驟：
[0048] (1)硫酸超聲處理碳納米管：將每克碳納米管與200ml的濃硫酸均勻混合，225W超 聲處理3. 5小時，洗滌并醋酸纖維濾膜過濾后干燥，研磨得到硫酸超聲處理的碳納米管。
[0049] (2)制備碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液：將步驟（1)中獲得的硫酸 超聲處理的碳納米管加入到洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液中，使得所述碳納米管與洋蔥伯 克霍爾德菌脂肪酶的質(zhì)量比例為1:4,形成碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液； 所述洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液，其優(yōu)選pH值為8. 0。
[0050] (3)制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶：將步驟⑵中獲得的碳納米管與洋 蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液在35°C下，振蕩反應4小時，離心去掉上清液獲得所述固定 化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶。
[0051] (4)制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶干粉：將步驟（3)中獲得的固定化的 洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，冷凍干燥，研磨成粉狀。
[0052] 實施例5
[0053] 固定化洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的催化活力測定
[0054] 以5ml正庚烷為溶劑，取1-苯乙醇lmmol及4mmol乙酸乙烯酯為反應底物，將反 應體系溶解于50ml磨口三角瓶中，以塞密封置于恒溫搖床中（50°C)混合均勻后，分別迅速 加入0. 05g的實施例2至4中制備的固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶并密閉容器，繼續(xù) 置于恒溫搖床中振蕩反應，精確反應lOmin后取出反應液離心，取上清液過濾，用于液相色 譜分析，分別計算轉(zhuǎn)酯酶活，結果如圖2。由圖可看出，以上三個實例均有90%以上的固定 化率且酶活達45, 000U/min/g protein以上，是游離酶催化酶活的48倍以上，表明以上實 例所涉及的實驗條件在本專利描述范圍內(nèi)均可行，且能保持較高的固定化率和催化酶活。
[0055] 實施例6時間對固定化效率及固定化酶活的影響：
[0056] A、功能化碳納米管載體的制備：
[0057] 取1. 5g碳納米管與150ml98 %的濃硫酸分別加入一 200ml燒杯中，攪拌使其混合 均勻，250W超聲處理4h。超聲完成，將混合液緩慢稀釋至中性，用醋酸纖維薄膜過濾，并用 清水洗滌3次以上，盡可能的減少硫酸根離子殘留。將濾得物置于60°C的烘箱中干燥，至完 全干燥（既稱量質(zhì)量不再變化），研磨成粉末狀，收集粉末即為功能化的碳納米管。
[0058] B、碳納米管固定化洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的制備
[0059] 將0· 2g功能化碳納米管載體加入到5mll20mg/ml pH = 7的脂肪酶溶液中，重復 制備6組試驗，37°C搖床分別振蕩反應lh、2h、3h、4h、5h、6h ;以12,000rmp，4°C離心lOmin， 收集沉淀物即為碳納米管固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，將其冷凍干燥，研磨成粉狀 即可用于催化反應。收集其離心上清液與脂肪酶溶液用考馬斯亮藍測定蛋白含量的方法， 分別測量其蛋白含量，分別計算固定化率。
[0060] 結果如圖3所示，由圖可以得出，在固定化時間l-4h之間，隨著固定化時間的增 力口，固定化酶活與固定化率存在緩慢的升高，而固定化時間達到4小時之后，固定化酶活與 固定化率基本維持在較高水平不變，表示4h之后，固定化已達到平衡穩(wěn)定狀態(tài)，故固定化 時間在4h以上為較優(yōu)選條件。
[0061] 實施例7pH對固定化效率及固定化酶活的影響
[0062] a、按照實施例1中經(jīng)硫酸超聲處理的碳納米管的制備方法，制備：
[0063] 具體步驟同實施例6步驟A。
[0064] b、碳納米管固定化洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的制備：
[0065] 將0. 2g功能化碳納米管載體分別加入到pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10的 5mll20mg/ml的脂肪酶溶液中，37?搖床振蕩反應4h ;以I^OOOrmpd-C離心10min，收集沉 淀物即為碳納米管固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，將其冷凍干燥，研磨成粉狀即可用 于催化反應。收集其離心上清液與脂肪酶溶液用考馬斯亮藍測定蛋白含量的方法，分別測 量其蛋白含量，分別計算固定化率。其他步驟件實施例6步驟B。
[0066] 結果如圖4所示，隨著pH值的增加，固定化效率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，固定化 美化與固定化率在pH值為7時有最大值，但緩沖液pH對固定化率的影響明顯小于其對固 定化酶活的影響，且固定化率均維持在90%以上，說明緩沖液pH并不是影響固定化效率的 主要因素，但它對于被固定化的酶蛋白性質(zhì)有一定影響。
[〇〇67] 本領域的技術人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以 限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含 在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1. 一種固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，其特征在于，包括碳納米管基質(zhì)和洋蔥伯 克霍爾德菌脂肪酶，所述洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶通過親和吸附和/或共價結合的方式結 合在碳納米管基質(zhì)的開放端口、表面和內(nèi)壁。
2. 如權利要求1所述的固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，其特征在于，所述碳納米 管基質(zhì)為經(jīng)硫酸超聲處理的碳納米管。
3. 如權利要求1或2所述的固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 硫酸超聲處理碳納米管：將每克碳納米管與l〇〇ml至300ml的濃硫酸均勻混合， 200W至250W超聲處理2小時至5小時，洗滌并過濾后干燥，研磨得到硫酸超聲處理的碳納 米管； (2) 制備碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶混合液：將步驟（1)中獲得的硫酸超聲 處理的碳納米管加入到洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶溶液中，使得所述碳納米管與洋蔥伯克霍 爾德菌脂肪酶的質(zhì)量比例在1:0. 5至1:6之間，形成碳納米管與洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶 混合液； (3) 制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶：將步驟（2)中獲得的碳納米管與洋蔥伯 克霍爾德菌脂肪酶混合液在4°C至60°C下，振蕩反應1小時至6小時，離心去掉上清液獲得 所述固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶。
4. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，還包括步驟： (4) 制備固定化的洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶干粉：將步驟（3)中獲得的固定化的洋蔥 伯克霍爾德菌脂肪酶，冷凍干燥，研磨成粉狀。
5. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)過濾時采用醋酸纖維作為濾 膜。
6. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)所述洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶 溶液，其pH值在5. 0至8. 0之間。
【文檔編號】C12N11/14GK104109662SQ201410282597
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權日:2014年6月23日
【發(fā)明者】閆云君, 柯彩霞, 李相 , 徐莉, 張后今 申請人:華中科技大學