彎曲乳桿菌及其在風(fēng)干腸中降低亞硝胺含量的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】彎曲乳桿菌及其在風(fēng)干腸中降低亞硝胺含量的應(yīng)用，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的目的是選用了一株具有降亞硝胺作用的彎曲乳桿菌2，將其應(yīng)用到風(fēng)干腸中，考察在發(fā)酵過(guò)程中亞硝胺的動(dòng)態(tài)變化。本發(fā)明所述的彎曲乳桿菌2為從發(fā)酵酸乳中提取并分離鑒定的菌種，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為：CGMCC?No.9172，保藏日期為2014年05月16日，菌種的分類命名為彎曲乳桿菌(Lactobacillus?curvatus)。本發(fā)明提供的彎曲乳桿菌2可以有效降低風(fēng)干腸中NDEA、NDPA、NDphA和NPIP四種亞硝胺的含量。
【專利說(shuō)明】彎曲乳桿菌及其在風(fēng)干腸中降低亞硝胺含量的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一株彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus),將其應(yīng)用到風(fēng)干腸中，具有降低亞硝胺含量的作用。

【背景技術(shù)】
[0002]亞硝胺是一類含氮的化學(xué)物質(zhì)，能夠致畸、致突變并誘發(fā)癌癥。人類攝入的很多食物中含有亞硝胺，還有一些食品加工中會(huì)間接形成，如肉制品中添加的亞硝酸鹽會(huì)在酸性環(huán)境中形成亞硝胺，而硝酸鹽在肉制品中使用的具有良好的呈色作用、抗氧化作用及增味作用，同時(shí)還可以抑制肉毒梭狀芽孢桿菌及許多其他類型腐敗菌的生長(zhǎng)，因而目前仍是肉制品加工中難以替代的添加成分。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)亞硝胺的生成機(jī)理進(jìn)行了深入的研究，通過(guò)控制亞硝胺的生成途徑來(lái)降低對(duì)人體可能造成的危害。
[0003]肉制品中N-亞硝胺的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，并且有多種物質(zhì)會(huì)影響亞硝化反應(yīng)。N-亞硝胺在肉制品中形成的初始原料有硝酸鹽、亞硝酸鹽、一級(jí)胺(伯胺)、二級(jí)胺(仲胺)、三級(jí)胺(叔胺)、酰胺、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸，或者是這些物質(zhì)的前體，通過(guò)微生物作用轉(zhuǎn)化為N-亞硝胺前體。
[0004]風(fēng)干腸是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，其歷史悠久，因其具有水分含量低、貯存期長(zhǎng)、賦有特殊質(zhì)地和風(fēng)味的特點(diǎn)而在東北地區(qū)擁有廣闊的消費(fèi)市場(chǎng)。亞硝酸鹽是風(fēng)干腸腌制過(guò)程中的主要成分之一，另外肉中豐富的蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸、胺類和酰胺類物質(zhì)等，這些都是形成亞硝胺主要的前體物質(zhì)。加之，風(fēng)干腸在其發(fā)酵過(guò)程中，微生物會(huì)降解蛋白質(zhì)、降低PH，利于亞硝胺的形成，增加了風(fēng)干腸的安全隱患。歐洲國(guó)家早在20世紀(jì)20年代就在發(fā)酵腸中引入了乳酸菌，40年代大規(guī)模地將發(fā)酵劑應(yīng)用于肉的腌制中，縮短了生產(chǎn)周期，產(chǎn)品質(zhì)量得到了提高。
[0005]目前，對(duì)于N-亞硝胺化合物的控制方法主要有三類:一是尋找一種物質(zhì)可以部分或者完全替代能夠生成N-亞硝胺化合物的前體物質(zhì)亞硝酸鹽；二是尋找一種物質(zhì)或方法來(lái)阻斷產(chǎn)品中N-亞硝胺的形成；三是尋找一種方法對(duì)產(chǎn)品中已形成的亞硝胺進(jìn)行分解。對(duì)于阻斷肉制品加工過(guò)程中N-亞硝胺形成的研究多集中在添加抗壞血酸和α-生育酚上，但由于溶解性具有局限性而限制了它們的應(yīng)用。關(guān)于亞硝酸鹽替代物的研究多集中在化學(xué)合成物質(zhì)上，這種方式已不能滿足人們對(duì)食品安全的要求，微生物發(fā)酵法作為一種安全的替代方法而得到了人們的關(guān)注。應(yīng)用微生物將肌紅蛋白(Mb)轉(zhuǎn)變成紅色的衍生物，其中研究最多的是乳酸菌屬和葡萄球菌屬。在肉制品中加入乳酸菌，使其產(chǎn)生乳酸，降低PH值，促進(jìn)亞硝酸鹽的還原作用，而使亞硝酸鹽分解，則可大大降低亞硝酸鹽殘留量，從而進(jìn)一步減少殘留的亞硝酸鹽與胺反應(yīng)生成致癌物質(zhì)亞硝胺。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是選用了一株具有降亞硝胺作用的彎曲乳桿菌2，將其應(yīng)用到風(fēng)干腸中，考察在發(fā)酵過(guò)程中亞硝胺的動(dòng)態(tài)變化。
[0007]本發(fā)明的彎曲乳桿菌2 (Lactobacillus curvatus 2)為從發(fā)酵酸乳中提取并分離鑒定的菌種，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)Jia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC N0.9172，保藏日期為2014年05月16日，菌種的分類命名為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)。
[0008]本發(fā)明中的彎曲乳桿菌2具有以下生物學(xué)特性:
[0009](I)形態(tài)特征:彎曲乳桿菌2革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性，彎曲桿狀，成短鏈狀排列，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛。
[0010](2)菌落特征:彎曲乳桿菌2在MRS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落形態(tài)為白色、凸起、圓形，邊緣光滑細(xì)密，直徑約2~3_。在液體培養(yǎng)基中均勻混濁生長(zhǎng)。
[0011]通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，彎曲乳桿菌2在液體培養(yǎng)基中具有降低亞硝胺的能力，因此本發(fā)明在風(fēng)干腸中添加彎曲乳桿菌進(jìn)行自然發(fā)酵，觀察其發(fā)酵過(guò)程中亞硝胺的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的彎曲乳桿菌2可以有效降低風(fēng)干腸中NDEA、NDPA、NDphA和NPIP四種亞硝胺的含量。
[0012]保藏信息:
[0013]保藏單位全稱:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；
[0014]保藏單位簡(jiǎn)稱:CGMCC ；
[0015]保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所；
[0016]保藏編號(hào):CGMCCN0.9172 ；
[0017]保藏日期:2014年05月16日。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)圖(20μ g/mL)；
[0019]圖2為接種彎曲乳桿菌2的培養(yǎng)基中亞硝胺的的動(dòng)態(tài)變化；
[0020]圖3為接種彎曲乳桿菌2的風(fēng)干腸中亞硝胺二甲基的動(dòng)態(tài)變化；
[0021]圖4為接種彎曲乳桿菌2的風(fēng)干腸中亞硝基哌啶的動(dòng)態(tài)變化；
[0022]圖5為接種彎曲乳桿菌2的風(fēng)干腸中亞硝基二丙胺的動(dòng)態(tài)變化；
[0023]圖6為接種彎曲乳桿菌2的風(fēng)干腸中亞硝基二苯胺的動(dòng)態(tài)變化；
[0024]圖中，1-亞硝基二甲胺，2-亞硝基嗎啉，3-亞硝基吡咯烷，4-亞硝基二乙胺，5-亞硝基哌啶，6-亞硝基二丙胺，7-亞硝基酰胺，8-亞硝基二苯胺，a-f指同一種亞硝胺，字母不同則說(shuō)明差異顯著(P<0.05)。

【具體實(shí)施方式】
[0025]下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限如此，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0026]1.材料和方法
[0027]1.1 材料
[0028]豬臀肉，購(gòu)于大潤(rùn)發(fā)超市；含有8種亞硝胺化合物的標(biāo)樣，包括亞硝基二甲胺(NDMA)、亞硝基吡咯烷(NPYR)、亞硝基二乙胺(NDEA)、亞硝基嗎啉(NMor)、亞硝基酰胺(NDBA)、亞硝基哌啶(NPIP)、亞硝基二丙胺(NDPA)、亞硝基二苯胺(NDphA)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；乙腈，德國(guó)Merck公司；二氯甲烷、氯化鈉、硫酸、亞硝酸鈉、冰乙酸、醋酸銨、購(gòu)于哈爾濱道外區(qū)盛達(dá)化驗(yàn)儀器銷售公司。以上試劑除乙腈為色譜純外，其余為分析純，水為超純水。
[0029]1.2儀器與設(shè)備
[0030]AgilentllOO高效液相色譜儀配備四元梯度泵與紫外檢測(cè)器,美國(guó)Agilent公司；K-D濃縮儀、水蒸氣蒸餾裝置，天津盛淼科技有限公司；HWS-系列恒溫恒濕培養(yǎng)箱，天津市泰藏斯特儀器有限公司。
[0031]1.3實(shí)驗(yàn)方法
[0032]1.3.1培養(yǎng)基中具有降亞硝胺能力菌株的篩選
[0033](I)MRS (Man Rogosa and Sharp)培養(yǎng)基
[0034]蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g,酵母提取物5.0g,葡萄糖20.0g,乙酸鈉5.0g,檸檬酸銨2.0g,吐溫80 1.0mL,磷酸氫二鉀2.0g,七水合硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g,蒸餾水100mL, ρΗ6.5~6.8。用于乳酸菌的活化、傳代。
[0035](II)菌株篩選
[0036]將活化好的彎曲乳桿菌2菌液0.5mL添加到MRS液體培養(yǎng)基中，加入濃度為20 μ g/mL的亞硝胺混標(biāo)，使其終濃度達(dá)到I μ g/mL。37°C下需氧培養(yǎng)12h，分別測(cè)定Oh和12h培養(yǎng)基中亞硝胺含量。由于亞硝胺具有揮發(fā)性，對(duì)照組中將菌液換成等體積的雙蒸水，同等條件下培養(yǎng)。對(duì)照組Oh和12h亞硝胺含量變化，即在培養(yǎng)基中亞硝胺的自然揮發(fā)量。
[0037]1.3.2哈爾濱風(fēng)干腸的制作方法
[0038](I)原輔料:
[0039]瘦肉(豬臀肉，豬里脊)4.5kg，肥肉(豬背脂)0.5kg，麯酒(玉泉大麯)0.15kg，亞硝酸鈉0.0045kg,葡萄糖0.25kg，味素0.075kg,鹽0.125kg，混合調(diào)料0.025kg (混合調(diào)料包括:花椒，大料，桂皮，丁香等)。
[0040](II)發(fā)酵劑制備
[0041]將活化好的彎曲乳桿菌2接種到MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)12h。發(fā)酵液于4°C條件下，1000g離心5min后，備用。添加發(fā)酵劑時(shí)，乳酸菌終濃度為107CFU/g肉餡。
[0042](III)風(fēng)干腸制作工藝流程
[0043]原料肉(剔除淋巴，筋腱，血管等結(jié)締組織)一切丁(Icm見(jiàn)方的肉丁)一腌制(加鹽和調(diào)味料等)一加發(fā)酵劑(對(duì)照組不添加)一拌餡一灌制一發(fā)酵風(fēng)干。
[0044]1.3.3亞硝胺的測(cè)定
[0045]1.3.3.1高效液相色譜條件
[0046]參考羅茜等的方法，略作改進(jìn)。采用C18柱(Elite，4.6mmX250mm，填料為Hypersil 0DS25 μ m)色譜柱,二元梯度洗脫,水相流動(dòng)相A為5mmol/L醋酸銨一醋酸緩沖液(pH 4.0)，有機(jī)流動(dòng)相B為乙腈。流速lmL/min,進(jìn)樣體積20 μ L，柱溫為35°C，于240nm處紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。具體梯度洗脫程序如表1所示。
[0047]表1洗脫程序
[0048]Tablel elut1n program
[0049]

【權(quán)利要求】
1.彎曲乳桿菌，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏編號(hào)為:CGMCC N0.9172。
2.如權(quán)利要求1 所述的彎曲乳桿菌在風(fēng)干腸中降低亞硝胺含量的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104164384SQ201410283158
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】孔保華, 張宏偉, 李木子, 牛海力, 夏秀芳 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)