與小麥常規(guī)育種全過(guò)程結(jié)合的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種與小麥常規(guī)育種全過(guò)程結(jié)合的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，本發(fā)明首次公開(kāi)了如何在常規(guī)育種全程中進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的具體實(shí)施方法，該方法在利用分子育種元件創(chuàng)制分子標(biāo)記輔助育種選擇群體的前提下，育種全過(guò)程均通過(guò)分子標(biāo)記對(duì)基因型進(jìn)行選擇，克服了常規(guī)育種靠表型選擇基因型的缺點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種與小麥常規(guī)育種全過(guò)程結(jié)合的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，屬 于分子標(biāo)記應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。 與小麥常規(guī)育種全過(guò)程結(jié)合的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方 法 【背景技術(shù)】
[0002] 作物新品種選育是隨著人類(lèi)文明史發(fā)展而一直進(jìn)行的科學(xué)創(chuàng)新。從距今約1萬(wàn)年 前開(kāi)始的隨機(jī)采集活動(dòng)到傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)，世世代代的祖先為我們留下了豐富多彩 的各類(lèi)農(nóng)家品種，這些農(nóng)家品種是各國(guó)種質(zhì)庫(kù)中的占有很高比例的育種材料，也是我們進(jìn) 行新品種創(chuàng)造的珍貴資源。
[0003] 1886年前后孟德?tīng)栭_(kāi)始的豌豆雜交是現(xiàn)代育種的標(biāo)志性事件，自此至今的130多 年里，育種家通過(guò)作物種質(zhì)或近緣種間有性雜交，培育了數(shù)目眾多的作物新品種，為滿(mǎn)足快 速增長(zhǎng)的人口提供了糧食安全，對(duì)經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展、社會(huì)進(jìn)步做出了巨大貢獻(xiàn)。但常規(guī)育種主 要采用表型選擇方法，在很大程度上依賴(lài)于經(jīng)驗(yàn)和機(jī)遇，由此導(dǎo)致的選擇盲目性和不可預(yù) 見(jiàn)性是作物育種效率低，單產(chǎn)徘徊不前的主要原因。
[0004] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，大多數(shù)常規(guī)育種單位選育出品種的組合與雜交組合的比率只有千分之 一，形成品種的株系與各代選擇株系的比例只有百萬(wàn)分之一，大大浪費(fèi)了人力物力。近十幾 年迅速發(fā)展起來(lái)的生物技術(shù)和生物信息技術(shù)促進(jìn)了分子標(biāo)記的快速發(fā)展和應(yīng)用。而分子標(biāo) 記育種，利用目標(biāo)基因可追蹤的特點(diǎn)可直接對(duì)基因型進(jìn)行選擇，在組合配置、F1選留及其后 代種植規(guī)模上，都會(huì)根據(jù)目標(biāo)基因/QTL的有無(wú)或聚合情況預(yù)先設(shè)計(jì)和具體實(shí)施。因此，分 子標(biāo)記輔助育種，可大大提高育種效率，加快育種進(jìn)程，一般可節(jié)省50 %左右的人力物力， 縮短1-2年的育種年限。但是，由于小麥基因組特別巨大（1.8X101(lbp)，重復(fù)序列多及大 多數(shù)重要性狀為多基因控制的數(shù)量性狀，僅用某性狀的1-2分子標(biāo)記在雜交選育中隨機(jī)輔 助選擇的效果并不理想，因此，小麥的分子標(biāo)記輔助選擇方案在技術(shù)上還需完善提高，其高 效化和規(guī)?；膯?wèn)題急待解決，分子標(biāo)記輔助育種必須與常規(guī)育種全過(guò)程有機(jī)結(jié)合，才能 真正實(shí)現(xiàn)和發(fā)揮分子標(biāo)記輔助育種的作用，培育出突破性小麥新品種。
[0005] 但目前還沒(méi)有一種與小麥常規(guī)育種全過(guò)程結(jié)合的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供與小麥常規(guī)育種全過(guò)程結(jié)合的多位點(diǎn)分子標(biāo)記 輔助選擇方法。
[0007] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0008] 與小麥常規(guī)育種全過(guò)程結(jié)合的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，步驟如下：
[〇〇〇9] (1)在血緣、地理和性狀差異的基礎(chǔ)上，根據(jù)育種目標(biāo)性狀確定遺傳背景清晰的親 本材料作為育種元件，然后按照兩親本目標(biāo)基因/QTL有無(wú)和互補(bǔ)選擇父本和母本，并配制 雜交組合F1 ;再根據(jù)育種目標(biāo)和有效基因/QTL在雜交后代中的貢獻(xiàn)率預(yù)測(cè)確定1-2個(gè)目 標(biāo)性狀的2個(gè)以上QTL的分子標(biāo)記，作為后代跟蹤標(biāo)記；
[〇〇1〇] (2)根據(jù)雜交組合F1生長(zhǎng)后期性狀，淘汰性狀差的組合，保留性狀好的雜交組合 F1收獲籽粒后，經(jīng)培育發(fā)芽后，提取DNA進(jìn)行目標(biāo)基因/QTL的檢測(cè)，根據(jù)目標(biāo)基因/QTL有 無(wú)或聚合情況，確定性狀好的雜交組合F1的淘汰或選留及種植規(guī)模；將含有目標(biāo)基因 /QTL 且表型有顯著雜種優(yōu)勢(shì)的組合列為重點(diǎn)選育組合F2,進(jìn)行大規(guī)模培育，將含有目標(biāo)基因/ QTL但表型雜種優(yōu)勢(shì)不突出，或不含有目標(biāo)基因/QTL但表型雜種優(yōu)勢(shì)突出的組合列為一般 組合F2,進(jìn)行小規(guī)模培育，淘汰沒(méi)有目標(biāo)性狀基因/QTL且表型無(wú)明顯雜種優(yōu)勢(shì)的組合；
[0011] (3)于冬前分蘗或拔節(jié)期，選擇重點(diǎn)組合F2的生長(zhǎng)健壯植株，提取DNA進(jìn)行目標(biāo) 性狀基因/QTL的標(biāo)記檢測(cè)跟蹤，生長(zhǎng)中后期，依據(jù)目標(biāo)性狀基因/QTL的有無(wú)及表型綜合性 狀進(jìn)行田間選優(yōu)淘劣；對(duì)一般組合F2則是先選表型綜合性狀優(yōu)良的植株，然后進(jìn)行目標(biāo)性 狀基因/QTL檢測(cè)；單株收獲后進(jìn)行考種、目標(biāo)基因/QTL和相應(yīng)性狀的相關(guān)分析，根據(jù)基因 型和表現(xiàn)型的綜合結(jié)果，按步驟（2)的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，分類(lèi)獲得的重點(diǎn)選育組合F3和一般組合 F3,并確定下代種植群體的大??；
[0012] 于冬前分蘗或拔節(jié)期，選擇重點(diǎn)組合F3的生長(zhǎng)健壯植株，提取DNA進(jìn)行目標(biāo)性狀 基因/QTL的標(biāo)記檢測(cè)跟蹤，生長(zhǎng)中后期，依據(jù)目標(biāo)性狀基因/QTL的有無(wú)及表型綜合性狀進(jìn) 行田間選優(yōu)淘劣；對(duì)一般組合F3則是先選表型綜合性狀優(yōu)良的植株，然后進(jìn)行目標(biāo)性狀基 因/QTL檢測(cè)；單株收獲后進(jìn)行考種、目標(biāo)基因/QTL和相應(yīng)性狀的相關(guān)分析，根據(jù)基因型和 表現(xiàn)型的綜合結(jié)果，按步驟（2)的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，分類(lèi)獲得的重點(diǎn)選育組合F4和一般組合F4,并 確定下代種植群體的大小；
[0013] 于冬前分蘗或拔節(jié)期，選擇重點(diǎn)組合F4的生長(zhǎng)健壯植株，提取DNA進(jìn)行目標(biāo)性狀 基因/QTL的標(biāo)記檢測(cè)跟蹤，生長(zhǎng)中后期，依據(jù)目標(biāo)性狀基因/QTL的有無(wú)及表型綜合性狀進(jìn) 行田間選優(yōu)淘劣；對(duì)一般組合F4則是先選表型綜合性狀優(yōu)良的植株，然后進(jìn)行目標(biāo)性狀基 因/QTL檢測(cè)；單株收獲后進(jìn)行考種、目標(biāo)基因/QTL和相應(yīng)性狀的相關(guān)分析，根據(jù)基因型和 表現(xiàn)型的綜合結(jié)果，按步驟（2)的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，分類(lèi)獲得的重點(diǎn)選育組合F5和一般組合F5,并 確定下代種植群體的大小；
[0014] (4)種植重點(diǎn)選育組合F5和一般組合F5，F(xiàn)5代田間整齊度達(dá)標(biāo)的株系，用分子標(biāo) 記跟蹤目標(biāo)基因/QTL的同時(shí)，選擇株型優(yōu)良、產(chǎn)量高、抗逆強(qiáng)的品系，即得。
[0015] 步驟（1)中血緣、地理和性狀差異的標(biāo)準(zhǔn)為本領(lǐng)域育種常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，如：血緣差異即 作為兩個(gè)親本材料的系譜中沒(méi)有共同親本或來(lái)源相同的姊妹系等；地理差異即兩個(gè)親本來(lái) 源于不同國(guó)別、不同生態(tài)區(qū)域、不同省份等；性狀差異即兩個(gè)親本在育種目標(biāo)如抗病性上的 差異即一個(gè)抗病、另一個(gè)不抗病或產(chǎn)量性狀的差異即一個(gè)高產(chǎn)、一個(gè)低產(chǎn)等。具體可參見(jiàn)： 沙征貴，余建華.幾個(gè)小麥品種主要性狀表現(xiàn)和系譜分析.《福建農(nóng)業(yè)科技》，1982年05期。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，按照兩親本目標(biāo)基因/QTL有無(wú)和互補(bǔ)選擇 父本和母本為：根據(jù)育種目標(biāo)，確定含有目標(biāo)基因/QTL且目標(biāo)性狀表現(xiàn)極端的個(gè)體作為育 種元件，即親本；其中，兩親本目標(biāo)基因/QTL有無(wú)是指通過(guò)檢測(cè)，一個(gè)親本中含有該育種目 標(biāo)的目標(biāo)基因/QTL，而另一個(gè)親本中不含有該育種目標(biāo)的目標(biāo)基因 /QTL ;而兩親本目標(biāo)基 因/QTL的互補(bǔ)是指當(dāng)育種目標(biāo)涉及到2個(gè)及以上性狀時(shí)，通過(guò)檢測(cè)，一個(gè)親本中含有一個(gè) 及以上目標(biāo)性狀的目標(biāo)基因/QTL，而另一個(gè)親本中含有剩余目標(biāo)性狀的目標(biāo)基因 /QTL ;表 明這兩個(gè)親本的目標(biāo)基因/QTL是互補(bǔ)的。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，上述確定含有目標(biāo)基因/QTL的步驟為利用QTL IciMapping version3. 2 軟件(http: //www. isbreeding. net)進(jìn)行石角定。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，育種目標(biāo)和有效基因/QTL在雜交后代中的 貢獻(xiàn)率預(yù)測(cè)彡10%。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，培育數(shù)量為雜交組合F1每一株系50?100 粒籽粒。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)或（3)中，大規(guī)模培育為種植1000?2000株； 小規(guī)模培育為種植100?200株。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，所述含有目標(biāo)基因/QTL是指通過(guò)檢測(cè)含有 QTL分子標(biāo)記的數(shù)目至少為2個(gè)。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，目標(biāo)基因/QTL聚合是指控制同一個(gè)性狀的 不同位點(diǎn)的聚合或控制不同目標(biāo)性狀的基因/QTL位點(diǎn)的聚合。
[0023] 所述步驟⑵中根據(jù)雜交組合F1生長(zhǎng)后期性狀，篩選性狀優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)采用本領(lǐng)域 常規(guī)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，如可采用《作物育種學(xué)總論》（王世杰著，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，出版 號(hào)：9787511600103,出版日期2009年8月）中記載的內(nèi)容。
[0024] 所述目標(biāo)基因/QTL的檢測(cè)可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，即利用目標(biāo)基因/QTL的分子 標(biāo)記進(jìn)行分子檢測(cè)。
[0025] 所述步驟（4)中田間整齊度達(dá)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，如采用《作物育種 學(xué)總論》（王世杰著，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，出版號(hào)：9787511600103,出版日期2009年 8月）中記載的內(nèi)容。
[0026] 所述步驟（4)中株型優(yōu)良、產(chǎn)量高、抗逆強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，如采用 《作物育種學(xué)總論》（王世杰著，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，出版號(hào)=9787511600103,出版日 期2009年8月）中記載的內(nèi)容。
[0027] 有益效果
[0028] 1、本發(fā)明首次公開(kāi)了如何在常規(guī)育種全程中進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的具體 實(shí)施方法，該方法在利用分子育種元件創(chuàng)制分子標(biāo)記輔助育種選擇群體的前提下，育種全 過(guò)程均通過(guò)分子標(biāo)記對(duì)基因型進(jìn)行選擇，克服了常規(guī)育種靠表型選擇基因型的缺點(diǎn)。
[0029] 2、本發(fā)明首次采用育種元件創(chuàng)制分子標(biāo)記選擇群體，育種元件明確了目標(biāo)基因/ QTL在親本中的要求，并對(duì)所要篩選的育種全過(guò)程實(shí)施分子標(biāo)記輔助選擇和多基因位點(diǎn)標(biāo) 記，按本所述方法可解決在常規(guī)育種中如何使用分子標(biāo)記和如何取得有效結(jié)果的問(wèn)題，可 實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助技術(shù)和常規(guī)育種的真正結(jié)合，提高了選擇準(zhǔn)確率和選出多基因/QTL聚 合的目標(biāo)品種。
[0030] 3.本發(fā)明技術(shù)方案能夠縮短育種周期，降低育種成本和提高育種效率，一個(gè)中等 規(guī)模的小麥育種團(tuán)隊(duì)，每年配制雜交組合的數(shù)目可減少50%，保留F1組合的比例可減少 30 %，F(xiàn)2種植面積減少50 %，F(xiàn)3-F4代的應(yīng)選株系可減少60 %，從組合配制到參試國(guó)家試驗(yàn) 的年限縮短2年，育成品種的效率可提高50%。 【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1 :TaGW2-6A基因的分子標(biāo)記Hap-6A-Pl/P2在山農(nóng)20和山農(nóng)01-35中的擴(kuò)增 結(jié)果；
[0032] 圖2 :標(biāo)記Hap-6A_P1/P2在F2分離世代部分株系的擴(kuò)增結(jié)果；
[0033] 圖中：M、marker，1_16、F2 株系；
[0034] 圖3 :標(biāo)記QGW6A-232在01-35及部分F2分離世代部分株系的擴(kuò)增產(chǎn)物PAGE電 泳結(jié)果；
[0035] 圖中：M、marker ;1、01-35, 2-20、F2 株系；
[0036] 圖4 :6個(gè)抗白粉病和6個(gè)抗條銹病基因分子標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果；
[0037] 圖中：各泳道自左向右依次為DL2000分子量標(biāo)記、山農(nóng)20、PH82-2-2和954072 ;
[0038] A-F、抗白粉病基因 Pml2 (A)、Pml6 (B)、Pm24 (C)、Pm30 (D)、Pm35 (E)和 Pm36 (F)的 分子標(biāo)記帶型；G-L、抗條銹病基因 Yr5 (G)、Yr9 (H)、Yrl5 (I)、Yr24 (J)、Yr26 (K)和 YrTpl (L) 的分子標(biāo)記帶型。 【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0040] 實(shí)驗(yàn)材料
[0041] 山農(nóng)01-35、小麥山農(nóng)20、PH82-2-2、954072山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì) 檢測(cè)中心品質(zhì)育種研究室有售；
[0042] PCR儀型號(hào)為德國(guó)Eppendorf5531梯度PCR儀；
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 利用2個(gè)大?；驑?biāo)記TaGW2-6A和QGW6A-232進(jìn)行粒重的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助 選擇，包括以下步驟：
[0045] 分子育種元件的選擇和F1組合配制
[0046] 分子育種元件的選擇：2008年2-4月利用粒重基因 TaGW2_6A的分子標(biāo)記 (Hap-6A-Pl/P2)和QGW6A-232分別對(duì)250份"973"項(xiàng)目組創(chuàng)制的材料進(jìn)行鑒定，其中分子 標(biāo)記標(biāo)記Hap-6A-Pl的上游引物,核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，分子標(biāo)記Hap-6A-Pl的 下游引物，核苷酸序列如SEQ ID勵(lì).2所示；分子標(biāo)記他?-6442的上游引物，核苷酸序列 如SEQ ID N0. 3所示，分子標(biāo)記Hap-6A-P2的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示； 分子標(biāo)記QGW6A-232的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，分子標(biāo)記QGW6A-232的 下游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0. 6所示。通過(guò)瓊脂糖電泳分析和聚丙烯酰胺凝膠電泳 分析篩選出同時(shí)含有2個(gè)小麥粒重的優(yōu)異等位基因（Hap-6A-G和QGW6A-232)的育種元件 山農(nóng)01-35作為高粒重分子育種元件（見(jiàn)圖1和圖3);山農(nóng)01-35常年千粒重在60克左 右；2008年10月將育種元件山農(nóng)01-35及其它親本材料種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)泰安實(shí)驗(yàn)農(nóng) 場(chǎng)。
[0047] 雜交組合F1配制和分子標(biāo)記輔助選擇群體構(gòu)建：2008年5月以大粒育種元件山 農(nóng)01-35為父本，以多穗、多粒的山農(nóng)20、山農(nóng)22、良星66和良星99等4個(gè)小麥品種作母 本（不含Hap-6A-G和QGW6A-232兩個(gè)高粒重基因擴(kuò)增片斷）進(jìn)行常規(guī)雜交，獲得4個(gè)雜交 組合F1，這些組合及其后代即為分子標(biāo)記輔助選擇群體。
[0048] 確定雜交組合F1的選留和雜交組合F2種植規(guī)模
[0049] 2008年10月將4個(gè)雜交組合F1種植于大田，每個(gè)雜交組合種植2行，每行100 粒。2010年夏收根據(jù)大田農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)結(jié)果，淘汰農(nóng)藝性狀優(yōu)勢(shì)較差的組 合2個(gè)即組合01-35 X山農(nóng)22和組合01-35 X良星66,保留其余2個(gè)組合；從收獲各雜交 組合F2籽粒中各取50粒于7-9月份室內(nèi)發(fā)芽，提取小麥的基因組DNA，用于TaGW2-6A的 分子標(biāo)記（Hap-6A-Pl/P2)和QGW6A-232聚合情況的分子檢測(cè)。
[0050] 分子檢測(cè)步驟如下：
[0051] a、每株系取1-2片小麥葉片，置于2mL離心管中，放入盛有液氮的容器內(nèi)，冷凍后 充分研磨，加入900 μ L 65°C預(yù)熱的DNA提取工作液，65°C水浴lh，水浴過(guò)程中小心輕搖數(shù) 次，充分混勻；室溫冷卻5min后加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（體積比為25:24:1)充 分混勻30min，10000g離心20min ;取上清夜加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，可見(jiàn)絮狀DNA 析出，10000g離心30min ;棄去上清液，用70 %的乙醇洗滌沉淀2次，將DNA沉淀晾干，用 100 μ L 1 X TE溶液溶解，制得待測(cè)小麥的DNA ;
[0052] b、TaGW2_6A的分子標(biāo)記以待測(cè)小麥的DNA為模板，分別用分子標(biāo)記Hap_6A_Pl和 Hap-6A-P2的檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分子標(biāo)記Hap-6A-Pl的上游引物，核苷酸序列如SEQID NO. 1所示，分子標(biāo)記Hap-6A-Pl的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示；分子標(biāo)記 Hap-6A-P2的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示，分子標(biāo)記Hap-6A-P2的下游引物， 核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示；
[0053] 引物Hap-6A_P1/P2的反應(yīng)體系和循環(huán)程序如下：
[0054] 首先用引物Hap-6A_P 1擴(kuò)增，PCR體系為20 μ L :
[0055] lOXbuffer(含 Mg2+)2yL、dNTP 1.6yL(10mmol Γ1)、每條引物 0.4yL、模板 DNA 50ng、lU Taq 聚合酶、13.4yL ddH20。
[0056] PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 50s，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin， 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。
[0057] 第一輪PCR擴(kuò)增完成后，用引物Hap-6A_P2進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，PCR體系為20 μ L :
[0058] 10父1311打61'(含]\%2+)2 4 1^(1階131.6 4 1^(10臟〇1171)、每條引物0.4 4 1^川丁&9聚 合酶、13. 4μ L ddH20。
[0059] 第一輪的PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為第二輪PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng)程序：
[0060] 95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 50s，57°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10min。
[0061] 擴(kuò)增完畢后用限制性?xún)?nèi)切酶TaqI (按產(chǎn)品說(shuō)明操作）酶切第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 反應(yīng)體系為20 μ L:
[0062] 含 TaqI 酶 1 μ L，lOXTaql buffer2y L，0. 1 % BSA 2 μ L, PCR 產(chǎn)物 10 μ L， ddH205 μ L。
[0063] 反應(yīng)溫度為65°C，酶切5min后加入loading buffer，PCR產(chǎn)物和酶切片段分別用 1. 5wt%和2wt%的瓊脂糖電泳分離。
[0064] 根據(jù)獲得的結(jié)果，如果得到大小為218bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，則所述待測(cè)小麥為 高粒重小麥。
[0065] c、QGW6A-232以待測(cè)小麥的DNA為模板，用分子標(biāo)記QGW6A-232的檢測(cè)引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，分子標(biāo)記QGW6A-232的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示，分子標(biāo)記 QGW6A-232的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
[0066] 該分子標(biāo)記檢測(cè)引物的反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增條件如下：
[0067] PCR擴(kuò)增體系為20 μ L，如表1所示：
[0068] 表 1
[0069]
【權(quán)利要求】
1. 與小麥常規(guī)育種全過(guò)程結(jié)合的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于，步驟如 下： (1) 在血緣、地理和性狀差異的基礎(chǔ)上，根據(jù)育種目標(biāo)性狀確定遺傳背景清晰的親本材 料作為育種元件，然后按照兩親本目標(biāo)基因/QTL有無(wú)和互補(bǔ)選擇父本和母本，并配制雜交 組合F1 ;再根據(jù)育種目標(biāo)和有效基因/ QTL在雜交后代中的貢獻(xiàn)率預(yù)測(cè)確定1-2個(gè)目標(biāo)性 狀的2個(gè)以上QTL的分子標(biāo)記，作為后代跟蹤標(biāo)記； (2) 根據(jù)雜交組合F1生長(zhǎng)后期性狀，淘汰性狀差的組合，保留性狀好的雜交組合F1收 獲籽粒后，經(jīng)培育發(fā)芽后，提取DNA進(jìn)行目標(biāo)基因/QTL的檢測(cè)，根據(jù)目標(biāo)基因/QTL有無(wú)或 聚合情況，確定性狀好的雜交組合F1的淘汰或選留及種植規(guī)模；將含有目標(biāo)基因/QTL且表 型有顯著雜種優(yōu)勢(shì)的組合列為重點(diǎn)選育組合F2,進(jìn)行大規(guī)模培育，將含有目標(biāo)基因/QTL但 表型雜種優(yōu)勢(shì)不突出，或不含有目標(biāo)基因/QTL但表型雜種優(yōu)勢(shì)突出的組合列為一般組合 F2,進(jìn)行小規(guī)模培育，淘汰沒(méi)有目標(biāo)性狀基因/QTL且表型無(wú)明顯雜種優(yōu)勢(shì)的組合； (3) 于冬前分蘗或拔節(jié)期，選擇重點(diǎn)組合F2的生長(zhǎng)健壯植株，提取DNA進(jìn)行目標(biāo)性狀 基因/QTL的標(biāo)記檢測(cè)跟蹤，生長(zhǎng)中后期，依據(jù)目標(biāo)性狀基因/QTL的有無(wú)及表型綜合性狀進(jìn) 行田間選優(yōu)淘劣；對(duì)一般組合F2則是先選表型綜合性狀優(yōu)良的植株，然后進(jìn)行目標(biāo)性狀基 因/QTL檢測(cè)；單株收獲后進(jìn)行考種、目標(biāo)基因/QTL和相應(yīng)性狀的相關(guān)分析，根據(jù)基因型和 表現(xiàn)型的綜合結(jié)果，按步驟（2)的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，分類(lèi)獲得的重點(diǎn)選育組合F3和一般組合F3,并 確定下代種植群體的大小； 于冬前分蘗或拔節(jié)期，選擇重點(diǎn)組合F3的生長(zhǎng)健壯植株，提取DNA進(jìn)行目標(biāo)性狀基因 /QTL的標(biāo)記檢測(cè)跟蹤，生長(zhǎng)中后期，依據(jù)目標(biāo)性狀基因/QTL的有無(wú)及表型綜合性狀進(jìn)行田 間選優(yōu)淘劣；對(duì)一般組合F3則是先選表型綜合性狀優(yōu)良的植株，然后進(jìn)行目標(biāo)性狀基因/ QTL檢測(cè)；單株收獲后進(jìn)行考種、目標(biāo)基因/QTL和相應(yīng)性狀的相關(guān)分析，根據(jù)基因型和表現(xiàn) 型的綜合結(jié)果，按步驟（2)的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，分類(lèi)獲得的重點(diǎn)選育組合F4和一般組合F4,并確定 下代種植群體的大??； 于冬前分蘗或拔節(jié)期，選擇重點(diǎn)組合F4的生長(zhǎng)健壯植株，提取DNA進(jìn)行目標(biāo)性狀基因 /QTL的標(biāo)記檢測(cè)跟蹤，生長(zhǎng)中后期，依據(jù)目標(biāo)性狀基因/QTL的有無(wú)及表型綜合性狀進(jìn)行田 間選優(yōu)淘劣；對(duì)一般組合F4則是先選表型綜合性狀優(yōu)良的植株，然后進(jìn)行目標(biāo)性狀基因/ QTL檢測(cè)；單株收獲后進(jìn)行考種、目標(biāo)基因/QTL和相應(yīng)性狀的相關(guān)分析，根據(jù)基因型和表現(xiàn) 型的綜合結(jié)果，按步驟（2)的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，分類(lèi)獲得的重點(diǎn)選育組合F5和一般組合F5,并確定 下代種植群體的大??； (4) 種植重點(diǎn)選育組合F5和一般組合F5，F(xiàn)5代田間整齊度達(dá)標(biāo)的株系，用分子標(biāo)記跟 蹤目標(biāo)基因/QTL的同時(shí)，選擇株型優(yōu)良、產(chǎn)量高、抗逆強(qiáng)的品系，即得。
2. 如權(quán)利要求1所述的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于，所述步驟（1)中， 按照兩親本目標(biāo)基因/QTL有無(wú)和互補(bǔ)選擇父本和母本為：根據(jù)育種目標(biāo)，確定含有目標(biāo)基 因/QTL且目標(biāo)性狀表現(xiàn)極端的個(gè)體作為育種元件，即親本；其中，兩親本目標(biāo)基因/QTL有 無(wú)是指通過(guò)檢測(cè)，一個(gè)親本中含有該育種目標(biāo)的目標(biāo)基因/QTL，而另一個(gè)親本中不含有該 育種目標(biāo)的目標(biāo)基因 /QTL ;而兩親本目標(biāo)基因/QTL的互補(bǔ)是指當(dāng)育種目標(biāo)涉及到2個(gè)及 以上性狀時(shí)，通過(guò)檢測(cè)，一個(gè)親本中含有一個(gè)及以上目標(biāo)性狀的目標(biāo)基因/QTL，而另一個(gè)親 本中含有剩余目標(biāo)性狀的目標(biāo)基因/QTL。
3. 如權(quán)利要求2所述的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于，所述確定含有目 標(biāo)基因/QTL的步驟為利用QTL IciMapping version 3. 2軟件進(jìn)行確定。
4. 如權(quán)利要求1所述的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于，所述步驟（1)中， 育種目標(biāo)和有效基因/ QTL在雜交后代中的貢獻(xiàn)率預(yù)測(cè)> 10%。
5. 如權(quán)利要求1所述的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于，所述步驟（2)中， 培育數(shù)量為雜交組合F1每一株系50?100粒籽粒。
6. 如權(quán)利要求1所述的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于，所述步驟（2)或 (3)中，大規(guī)模培育為種植1000?2000株；小規(guī)模培育為種植100?200株。
7. 如權(quán)利要求1所述的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于，所述步驟（2)中， 所述含有目標(biāo)基因/QTL是指通過(guò)檢測(cè)含有QTL分子標(biāo)記的數(shù)目至少為2個(gè)。
8. 如權(quán)利要求1所述的多位點(diǎn)分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于，所述步驟（2)中， 目標(biāo)基因/QTL聚合是指控制同一個(gè)性狀的不同位點(diǎn)的聚合或控制不同目標(biāo)性狀的基因/ QTL位點(diǎn)的聚合。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104109713SQ201410289103
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】田紀(jì)春, 鄧志英 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)