一種水體生物污染的溯源方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種水體生物污染的溯源方法，包括以下步驟：確定目標(biāo)水體污染物中的特征微生物；選擇特征微生物特異性基因片段，通過所述特異性基因片段定量目標(biāo)水體的污染源以及污染狀況。本發(fā)明提供的一種水體生物污染的溯源方法，通過確定目標(biāo)水體污染物中的特征微生物，然后通過特征微生物的特異性基因片段，來定量目標(biāo)水體的污染源以及污染狀況，將污染水平的檢測(cè)提升到分子水平，精確度高，靈敏度好，并且能很好的定位目標(biāo)污染源，能夠?qū)S污來源準(zhǔn)確定位并定量水體污染貢獻(xiàn)率，對(duì)于客觀評(píng)價(jià)養(yǎng)殖污染貢獻(xiàn)率和因地制宜治理水體污染都具有一定的指導(dǎo)意義。
【專利說明】一種水體生物污染的溯源方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種水體生物污染的溯源方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水是生命之源，水體質(zhì)量直接影響著人類的生產(chǎn)和生活。近年來，隨著人們生活質(zhì)量的提高和對(duì)畜牧產(chǎn)品需求的增加，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)得到了快速發(fā)展。養(yǎng)殖業(yè)逐漸向規(guī)?；s化發(fā)展，而規(guī)?；B(yǎng)殖產(chǎn)生的糞污很多，傳統(tǒng)的糞污處理方式已經(jīng)很難滿足如此之大的糞污處理要求。當(dāng)排入水體的糞便總量超過水體自然凈化能力時(shí)就會(huì)造成污染；此外由糞便帶入水體的病原微生物等也會(huì)給人和動(dòng)物的健康造成危害；過量的糞便污染會(huì)隨著地表徑流和地下滲漏進(jìn)入附近水體使地表水和地下水受到污染；糞便污染隨地表徑流進(jìn)入水體后會(huì)導(dǎo)致水體中固體懸浮物、化學(xué)需氧量和生物需氧量顯著升高；水體中的微生物能降解有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生大量氮、磷為水生植物的生長提供了過量的營養(yǎng)，使水體富營養(yǎng)化的風(fēng)險(xiǎn)增加；一般受養(yǎng)殖廢水污染嚴(yán)重的水體，其溶解氧被大量消耗，水生生物因缺氧窒息死亡，最終導(dǎo)致水體變黑、發(fā)臭。
[0003]目前對(duì)養(yǎng)殖業(yè)污染貢獻(xiàn)率是以污染系數(shù)計(jì)算的理論值位的考量是基于污染系數(shù)的理論值，與實(shí)際的污染貢獻(xiàn)率有一定的差異，同時(shí)由于缺乏對(duì)糞污來源的準(zhǔn)確掌握和定位，使得目前的治理工作大多停留在見污治污的末端治理階段，這在一定程度上增加了治污成本(Stoner N et al.，2007 ;馮廣達(dá)等，2010)。因此，區(qū)分和定位水體中糞便污染的主要來源成為解決這一問題的關(guān)鍵，鑒別可能的糞便污染源對(duì)客觀評(píng)價(jià)糞便污染與保障人類飲水安全具有重要意義，區(qū)分不同來源的糞便污染可以減少或消除由糞便帶入水體的致病菌對(duì)人類健康的影響，對(duì)于客觀評(píng)價(jià)養(yǎng)殖污染貢獻(xiàn)率和因地制宜治理水體污染都具有一定的指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種水體生物污染的溯源方法，以解決上述的問題。
[0005]在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一種水體生物污染的溯源方法，包括以下步驟:確定目標(biāo)水體污染物中的特征微生物；
[0006]選擇特征微生物特異性基因片段，通過所述特異性基因片段定量目標(biāo)水體的污染源以及污染狀況。
[0007]本發(fā)明實(shí)施例提供的一種水體生物污染的溯源方法，通過確定目標(biāo)水體污染物中的特征微生物，然后通過特征微生物的特異性基因片段，來定量目標(biāo)水體的污染源以及污染狀況，將污染水平的檢測(cè)提升到分子水平，精確度高，靈敏度好，并且能很好的定位目標(biāo)污染源，能夠?qū)S污來源準(zhǔn)確定位并定量水體污染貢獻(xiàn)率，對(duì)于客觀評(píng)價(jià)養(yǎng)殖污染貢獻(xiàn)率和因地制宜治理水體污染都具有一定的指導(dǎo)意義。
[0008]優(yōu)選地，根據(jù)檢出的特異性基因片段確定目標(biāo)水體的污染源。通過檢出的特異性基因片段來判斷特征微生物，以特征微生物來確定目標(biāo)水體的污染源。
[0009]具體地，所述目標(biāo)水體為含有豬排泄物污染水源，所述特異性基因片段為Pig-2-Bac,引物序列為:
[0010]上游引物序列5’ -GCATGAATTTAGCTTGCTAAATTTGAT-3’，
[0011]下游引物序列5’-ACCTCATACGGTATTAATCCGC-3’ ；
[0012]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量特征微生物的含量。
[0013]采用Pig-2-Bac作為豬排泄物污染水源的特異性基因片段，靈敏性和特異性好。
[0014]經(jīng)驗(yàn)證，優(yōu)選地，所述特異性基因片段的最低檢出限為400拷貝數(shù)。
[0015]優(yōu)選地，通過特異性基因片段的拷貝數(shù)來定量水體富營養(yǎng)化程度。通過測(cè)定特異性基因片段的拷貝數(shù)來定量水體富營養(yǎng)化程度，將水體富營養(yǎng)化程度的檢測(cè)提升到分子水平，精確度高，靈敏度好。
[0016]具體地，所述水體富營養(yǎng)化程度通過總氮、總磷和化學(xué)需氧量的含量來表征。
[0017]具體地，所述總氮量與Pig-2-Bac拷貝數(shù)之間的定量關(guān)系方程為:
[0018]4?時(shí)，Ig(TN) = 2.738+0.015X IgCt ； [0019]15? 時(shí)，Ig(TN) = 2.711+0.020 X IgCt ;
[0020]25?時(shí)，Ig(TN) = 2.718+0.019X IgCt ;
[0021]35。。時(shí)，Ig(TN) = 2.709+0.021 X IgCt ；
[0022]其中，TN為每升樣品中的總氮量mg ；Ct為100mL樣品中Pig_2_Bac拷貝數(shù)。
[0023]具體地，所述總磷量與Pig-2-Bac拷貝數(shù)之間的定量關(guān)系方程為:
[0024]4? 時(shí)，Ig(TP) = 1.528+0.016 X IgCt ；
[0025]15O 時(shí)，Ig(TP) = 1.442+0.030 X IgCt ；
[0026]25? 時(shí)，Ig(TP) = 1.478+0.025 X IgCt ；
[0027]35。。時(shí)，Ig(TP) = 1.501+0.023 X IgCt ；
[0028]其中，TP為每升樣品中的總磷量mg ；Ct為100mL樣品中Pig_2_Bac拷貝數(shù)。
[0029]具體地，所述化學(xué)需氧量與Pig-2-Bac拷貝數(shù)之間的定量關(guān)系方程為:
[0030]4? 時(shí)，Ig(COD) = 3.017+0.105 X IgCt ；
[0031]15。。時(shí)，Ig(COD) = 3.006+0.1lOXlgCt ；
[0032]25?時(shí)，Ig(COD) = 2.816+0.HlXlgCt ；
[0033]35O 時(shí)，Ig(COD) = 2.880+0.130 X IgCt ；
[0034]其中，COD為每升樣品中的化學(xué)需氧量mg ；Ct為100mL樣品中Pig_2_Bac拷貝數(shù)。
[0035]在不同的地段取樣，來反推出污染源的污染狀況，優(yōu)選地，根據(jù)不同溫度下樣品中Pig-2-Bac拷貝數(shù)的降解速率來推測(cè)污染源頭的污染狀況。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1示出了本發(fā)明實(shí)施例2中不同溫度處理微系統(tǒng)中Pig-2-Bac拷貝數(shù)的變化情況；
[0037]圖2示出了本發(fā)明實(shí)施例2中不同溫度處理微系統(tǒng)中總氮的變化情況；
[0038]圖3示出了本發(fā)明實(shí)施例2中不同溫度處理微系統(tǒng)中總磷的變化情況；
[0039]圖4示出了本發(fā)明實(shí)施例2中不同溫度處理微系統(tǒng)中COD的變化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面通過具體的實(shí)施例子并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。[0041]在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一種水體生物污染的溯源方法，包括以下步驟:確定目標(biāo)水體污染物中的特征微生物；
[0042]選擇特征微生物特異性基因片段，通過所述特異性基因片段定量目標(biāo)水體的污染源以及污染狀況。
[0043]本發(fā)明實(shí)施例提供的一種水體生物污染的溯源方法，通過確定目標(biāo)水體污染物中的特征微生物，然后通過特征微生物的特異性基因片段，來定量目標(biāo)水體的污染源以及污染狀況，將污染水平的檢測(cè)提升到分子水平，精確度高，靈敏度好，并且能很好的定位目標(biāo)污染源，能夠?qū)S污準(zhǔn)確定位，對(duì)于客觀評(píng)價(jià)養(yǎng)殖污染貢獻(xiàn)率和因地制宜治理水體污染都具有一定的指導(dǎo)意義。
[0044]實(shí)施例1
[0045]用滅菌的采樣瓶采集豬場(chǎng)糞水樣品、牛糞便、雞糞便、人糞便樣品，低溫保存，24h內(nèi)將樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。
[0046]采用孔徑為0.22 μ m的微孔濾膜過濾一定量的豬場(chǎng)廢水，將過濾得到的濾膜用液氮研磨，研磨所得的粉末移到1.5ml離心管；取一定質(zhì)量的糞便樣品用液氮研磨，將研磨所得粉末轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中；將樣品分別采用改良的CTAB法提取DNA，步驟如下:
[0047]在1.5ml 離心管中加入 Iml TENP 緩沖液(50mmol/L Tris-HCl, 20mmol/L EDTA,100mmol/L NaCl,0.01g/ml PVP, pH = 10),潤旋混勻，lOOOOr/min 離心 IOmin,棄上清，重復(fù)以上步驟，直到上清液清澈透明后，留沉淀，向沉淀中加入500 μ L的2XCTAB提取液，加Λ 20% SDS至終濃度為2 %，50 μ L異硫氰酸胍洗液，混勻后65°C水浴1.5h，每隔15min搖勻一次。水浴結(jié)束后，于冰上冷卻5min，加體積的氯仿/異戊醇，輕輕混勻后，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；用氯仿/異戊醇再抽提一次，取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；向上清中加入0.1倍體積的3M NaAc和0.6倍體積的異丙醇，_20°C靜置30min, 12000r/min離心10min ;棄上清,加入1ml的70 %乙醇洗漆沉淀，12000r/min離心IOmin ;去除上清，空氣中自然晾干，待離心管中液體揮發(fā)至無酒精味；沉淀溶解于30μ LddH20中，-20 V保存。檢測(cè)，提取的DNA純凈，無雜質(zhì)，提取效果好。
[0048]設(shè)計(jì)合成以下3對(duì)引物，引物1:
[0049]上游引物序列5’ -TACAGGCTTAACACATGCAAGTCG-3’，
[0050]下游引物序列5’-CTCATACGGTATTAATCCGCCTTT-3’ ；
[0051]引物2:
[0052]上游引物序列5’ -AACGCTAGCTACAGGCTTAAC-3’，
[0053]下游引物序列5’-CGGGCTATTCCTGACTATGGG-3’ ；
[0054]引物3:
[0055]上游引物序列5’ -GCATGAATTTAGCTTGCTAAATTTGAT-3’，
[0056]下游引物序列5’-ACCTCATACGGTATTAATCCGC-3’ ；
[0057]每個(gè)樣本取兩個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件按引物的說明進(jìn)行，其中P-1和P-2為豬場(chǎng)廢水總基因組，H-1和H-2為人糞便總基因組，C-1和C-2為牛糞便總基因組，CH-1和CH-2為雞糞便總基因組。擴(kuò)增結(jié)果如表1所示。
[0058]表1 3對(duì)引物qPCR擴(kuò)增4種樣品結(jié)果
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種水體生物污染的溯源方法，其特征在于，包括以下步驟:確定目標(biāo)水體污染物中的特征微生物； 選擇特征微生物特異性基因片段，通過所述特異性基因片段定量目標(biāo)水體的污染源以及污染狀況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水體生物污染的溯源方法，其特征在于，根據(jù)檢出的特異性基因片段確定目標(biāo)水體的污染源。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水體生物污染的溯源方法，其特征在于，所述目標(biāo)水體為含有豬排泄物污染水源，所述特異性基因片段為Pig-2-Bac，引物序列為: 上游引物序列 5’ -GCATGAATTTAGCTTGCTAAATTTGAT-3’， 下游引物序列 5’-ACCTCATACGGTATTAATCCGC-3’ ； 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量特征微生物的含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水體生物污染的溯源方法，其特征在于，所述特異性基因片段的最低檢出限為400拷貝數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的水體生物污染的溯源方法，其特征在于，通過特異性基因片段的拷貝數(shù)來定量水體富營養(yǎng)化程度。
6.根據(jù)權(quán)利要求 5所述的水體生物污染的溯源方法，其特征在于，所述水體富營養(yǎng)化程度通過總氮、總磷和化學(xué)需氧量的含量來表征。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的水體生物污染的溯源方法，其特征在于，所述總氮量與Pig-2-Bac拷貝數(shù)之間的定量關(guān)系方程為:
4°C 時(shí)，Ig(TN) = 2.738+0.015 X IgCt ；
15。。時(shí)，Ig(TN) = 2.711+0.020X IgCt ;
25。。時(shí)，Ig(TN) = 2.718+0.019 X IgCt ;
35。。時(shí)，Ig(TN) = 2.709+0.021 X IgCt ； 其中，TN為每升樣品中的總氮量mg ；Ct為100mL樣品中Pig-2-Bac拷貝數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的水體生物污染的溯源方法，其特征在于，所述總磷量與Pig-2-Bac拷貝數(shù)之間的定量關(guān)系方程為:
4°C 時(shí)，Ig(TP) = 1.528+0.016 X IgCt ；
15°C 時(shí)，Ig(TP) = 1.442+0.030 X IgCt ；
25°C 時(shí)，Ig(TP) = 1.478+0.025 X IgCt ；
35°C 時(shí)，Ig(TP) = 1.501+0.023 X IgCt ； 其中，TP為每升樣品中的總磷量mg ；Ct為100mL樣品中Pig-2-Bac拷貝數(shù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的水體生物污染的溯源方法，其特征在于，所述化學(xué)需氧量與Pig-2-Bac拷貝數(shù)之間的定量關(guān)系方程為:
4。。時(shí)，Ig(COD) = 3.017+0.105 X IgCt ；
15。。時(shí)，Ig(COD) = 3.006+0.1lOXlgCt ；
25。。時(shí)，Ig(COD) = 2.816+0.141 X IgCt ；
35。。時(shí)，Ig(COD) = 2.880+0.130 X IgCt ； 其中，COD為每升樣品中的化學(xué)需氧量mg ；Ct為100mL樣品中Pig-2-Bac拷貝數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水體生物污染的溯源方法，其特征在于，根據(jù)不同溫度下樣品中Pig-2-Bac拷 貝數(shù)的降解速率來推測(cè)污染源頭的污染狀況。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104017897SQ201410289558
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】郭萍, 朱昌雄, 王顯貴, 田云龍, 張莉 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所