一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法，將分離純化的胞外多聚物與高嶺土等進(jìn)行合理組合制備出復(fù)合微生物絮凝劑，然后將分離到的溶藻菌、藻毒素降解菌固定化，最后將復(fù)合微生物絮凝劑與固定化的溶藻菌和藻毒素降解菌合理復(fù)合，制備出復(fù)合微生物除藻劑。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)很好的殺藻及其藻毒素降解效果，且制備過程中使用的源材料價格低廉，制備成本低且這些材料不會破壞自然生態(tài)系統(tǒng)，本發(fā)明制備的除藻劑將絮凝除藻、微生物溶藻及藻毒素的微生物降解有機結(jié)合成一個整體，從而實現(xiàn)了水華的安全高效治理。
【專利說明】一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)?！炯夹g(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國的大中型湖泊（>50km2)占全國湖泊總面積的80%，是重要的水源地。但是在2 萬多座自然湖泊當(dāng)中，75%的湖泊都被藻類生長物污染，致使魚和其他生物無法生存，變成 死湖而走向消亡，其中以銅綠微囊藻污染最為普遍。因此，目前對于水華治理方法的研制是 環(huán)保研究領(lǐng)域一個重要的方向。如何實現(xiàn)有毒水華的快速、高效、安全治理且投入成本低， 是目前評判一個方法好壞的關(guān)鍵。然而現(xiàn)有的方法除藻效果單一等因素限制了水華治理的 效果，從而使得那些方法無法大規(guī)模應(yīng)用。
[0003] 目前，治理水華的方法大致分為：1、物理方法。此類方法有紫外、超聲、遮蔽、曝氣 混凝、打撈、活性炭吸附等。2、化學(xué)方法。這類方法主要是通過化學(xué)試劑也稱殺藻劑來控制 藻類繁殖，有機溴殺藻劑、銅鹽(硫酸銅、氯化銅)、高錳酸鉀等是應(yīng)用最多的除藻劑。3、生物 方法。即通過自然狀態(tài)下的病毒、溶藻菌、真菌、原生動物、魚類等的溶解或吞食藻類，控制 藻類的過度生長。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，以上幾種方法均存在各自的缺點，而且單一使用以 上方法水華治理效果較差。因此，將不同方法進(jìn)行有機復(fù)合，制備出一種高效且安全的復(fù)合 除藻劑從而實現(xiàn)水華的有效治理。
[0004] 因此，將溶藻菌、藻毒素降解菌以及絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選、微生物絮凝劑的制備、 微生物的固定化以及復(fù)合絮凝劑、復(fù)合除藻劑的制備過程整合成一個有機的整體，可以通 過以下幾個方面實現(xiàn)復(fù)合除藻劑的安全高效除藻效果：1、溶藻菌、藻毒素降解菌以及絮凝 物產(chǎn)生菌的篩選分別用于溶藻、降解藻毒素以及產(chǎn)生微生物絮凝劑。2、微生物的固定化，可 以保證細(xì)菌在惡劣的自然環(huán)境中穩(wěn)定的生長，并且固定化的環(huán)境可以為細(xì)菌發(fā)揮各自作用 提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。3、微生物絮凝劑的制備技術(shù)可以保證微生物絮凝劑的純度，減少其 使用量。4、將以上幾部分有機復(fù)合，制備出一種復(fù)合除藻劑，從而一次實現(xiàn)對有害藻類的絮 凝沉降、微生物溶藻以及藻毒素的微生物降解，進(jìn)而實現(xiàn)水華的高效且安全治理。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法， 包括以下步驟： (1) 溶藻菌（R1)、藻毒素降解菌(Ml)的固定化：以海藻酸鈉為固定材料，以麗培養(yǎng)基 作為溶劑，配制質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的海藻酸鈉溶液后，對溶藻菌（R1)和藻毒素降解菌(Ml)分 別進(jìn)行固定化； (2) 胞外多聚物的分離純化：以MMDT培養(yǎng)基培養(yǎng)胞外多聚物分泌菌（DT)，將培養(yǎng)24小 時后的培養(yǎng)液通過進(jìn)一步純化，得到胞外多聚物制品； (3) 復(fù)合微生物絮凝劑的制備：以高嶺土、硫酸鋁鉀、氯化鈣以及步驟（2)得到的胞外 多聚物制品為原料，結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計方法設(shè)計胞外多聚物制品、高嶺土、硫酸鋁鉀、氯化鈣 之間的比例，得到絮凝效果最好的復(fù)合微生物絮凝劑； (4) 復(fù)合微生物除藻劑的制備：以步驟（1)得到的固定化的溶藻菌和固定化的藻毒素 降解菌與步驟（3)得到的復(fù)合微生物絮凝劑為原料，制備出微生物復(fù)合除藻劑。
[0008] 進(jìn)一步地，所述步驟（3)中，絮凝效果最好的復(fù)合微生物絮凝劑中，胞外多聚物制 品、高嶺土、硫酸鋁鉀、氯化鈣的質(zhì)量比為0. 25X ΚΓ3 :5. 64 :0. 08 :0. 125。
[0009] 本發(fā)明的有益效果是： 該方法中需要投放到水體中的微生物均為自然界中篩選到的安全菌株，釋放到自然界 中不會產(chǎn)生負(fù)面影響； 制備過程中使用的源材料價格低廉，制備成本低且這些材料不會破壞自然生態(tài)系統(tǒng)。
[0010] 該技術(shù)制備的除藻劑將絮凝除藻、微生物溶藻及藻毒素的微生物降解有機結(jié)合成 一個整體，從而實現(xiàn)了水華的安全高效治理。
[0011] 該方法中使用的菌株均為高效菌株，分別具有很高的溶藻、藻毒素降解及絮凝除 藻效果，三者結(jié)合可以實現(xiàn)水體中有害藻類的高效去除。
[0012] 所述溶藻菌（R1)保存于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號：CGMCC No. 9198,分類命名：檸檬酸桿菌 (Citrobacter sp.)。保藏日期為 2014 年 5 月 23 日。
[0013] 所述藻毒素降解菌（Ml)保存于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號：CGMCC No. 9197,分類命名：多粘 類芽孢桿菌（Peanibacillus polymyxa)。保藏日期為2014年5月23日。
[0014] 所述胞外多聚物分泌菌（DT)保存于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號：CGMCC No. 9196,分類命名： 解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)。保藏日期為2014年5月23日。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是復(fù)合除藻劑的制備路線圖； 圖2是本發(fā)明復(fù)合除藻劑的絮凝效果圖； 圖3是本發(fā)明復(fù)合除藻劑的溶藻效果圖； 圖4是本發(fā)明復(fù)合除藻劑的藻毒素降解效果圖。

【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明的方法、步驟或條件 所做的修改或替換，均屬于本發(fā)明范圍，若未特殊指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟悉的常規(guī)手段。
[0017] 實施例1溶藻菌（R1)的篩選 1. 1富集：將200UL采集的水樣接種于100mL LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm富集培養(yǎng) 24h。取富集培養(yǎng)后的菌液5mL離心去除培養(yǎng)基，用無菌水清洗菌體3次后懸浮于10mL無 菌水中，得到富集培養(yǎng)的細(xì)菌液。
[0018] 1. 2初篩：將步驟1. 1得到的富集培養(yǎng)的細(xì)菌液接種于25mL的銅綠微囊藻液 (0D_=1.0)中，混合均勻后人工智能培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d (人工智能培養(yǎng)箱中，光照強度為 2000LX，光暗時間比為12:12,溫度為25 土 1°C )，銅綠微囊藻液出現(xiàn)黃化現(xiàn)象：銅綠微囊藻 液由原來的綠色變成黃色，黃色越明顯，則表明細(xì)菌液的溶藻效果越好。
[0019] 取lmL黃化的銅綠微囊藻培養(yǎng)液用無菌水稀釋1000倍，取200uL涂布在LB固體培 養(yǎng)基上，37 °C培養(yǎng)48h。隨機挑選LB固體培養(yǎng)基上形狀不同的單菌落接種到10mL MM培養(yǎng)基 (MM 培養(yǎng)基的成分為：K2HP043H20 2g/L，MgS047H20 0.3g/L，（NH4)2S04 0.2g/L，CaCl2 0.03g/ L，NaCl 0.9g/L，微量元素溶液0. 5 mL/L，葡萄糖20g/L;其中，微量元素溶液配方為：MnS04 1. 2311 g/L，ZnS04 0· 356g/L，F(xiàn)eS04 0· 256 g/L，CuS045H20 0· 3127 g/L，pH 6. 0)中，37?、 200rpm培養(yǎng)48h，得到16種單菌落的MM培養(yǎng)液； 1. 3復(fù)篩：將步驟1. 2得到的16種單菌落的MM培養(yǎng)液，用銅綠微囊藻液驗證其溶藻效 果，即將5mL各單菌落的MM培養(yǎng)液分別與25mL銅綠微囊藻液混合培養(yǎng)，驗證時的培養(yǎng)條件 為：光照強度為2000Lx，光暗時間比為12h : 12h，溫度25±1°C，時間為48h。通過對 比銅綠微囊藻液黃化效果(黃化表示能夠溶藻)，從16株單菌落篩選出中溶藻效果最好的單 一菌落，該菌落為溶藻菌菌落，將該溶藻菌菌落命名為R1。
[0020] 1.4分子生物學(xué)鑒定：取5yL R1細(xì)菌液（0D6CICI=0. 5)接種到5mL LB液體 培養(yǎng)基中，37°C，200rpm，12h后，取lmL R1細(xì)菌培養(yǎng)液，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒 (Axygen，USA)提取R1基因組后，進(jìn)行16S rRNA PCR。條件如下：選取兩對引物為27F : 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3，和 1492R:5，-TACGGTTACCTGTTACGACTT-3， ；PCR 體系 (50yL):10XPCR 緩沖液 5yL，25 mmol/L dNTP 4yL，基因組（50ng/ul ) 12.5yL， 27F/1492R(20ymol /L)引物各 1.25yL，rTaq 0 5yL，ddH20 25.3mL。PCR 程序為：94°C 預(yù)變性3111丨11，941：308,501：308,721：908,30個循環(huán)，72 1：5111丨11，161：5111丨11。？〇?產(chǎn)物 送至生工生物工程上海股份有限公司進(jìn)行測序。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對16S rRNA測序結(jié)果 進(jìn)行BLAST比對分析然后利用ClustalX2. 0進(jìn)行多序列比對最后通過MEGA4. 0軟件的鄰 接（neighbor-joining, NJ)模型進(jìn)行Bootstrap分析1000次重復(fù)驗證，生成系統(tǒng)發(fā)育樹。 實驗結(jié)果表明R1為朽1檬酸桿菌屬)。
[0021] 實施例2藻毒素降解菌（Ml)的篩選 2. 1初篩：取lmL步驟1. 1中得到的細(xì)菌富集培養(yǎng)液，接種到20mL含有銅綠微囊藻藻 毒素粗提液(藻毒素濃度不計）的MM (無葡萄糖）液體培養(yǎng)基中（藻毒素粗提液與無葡萄糖 MM液體培養(yǎng)基的體積比為1 :1)，接后搖床避光培養(yǎng)（200rpm，37°C )，觀察菌株的生長情況 并選擇長勢最好的菌株以供復(fù)篩。
[0022] 2. 2復(fù)篩：向1L無葡萄糖的麗培養(yǎng)基中添加20mg的MC-LR使用該培養(yǎng)基對2. 1 中的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)，200rpm，37°C避光培養(yǎng)48h，篩選出生長能力最好的細(xì)菌，即為銅綠微 囊藻藻毒素降解菌，并將其命名為Ml。
[0023] 2.3分子生物學(xué)鑒定：方法見1.4,鑒定結(jié)果表明，Ml屬于多粘類芽孢桿菌 iPeanibacillus polymyxa、。
[0024] 實施例3胞外多聚物分泌菌（DT)的篩選 3. 1單菌落的活化：隨意取實驗室保存的單菌落若干，先各自接種到5mL LB液體培養(yǎng) 基200rpm，37°C培養(yǎng)12h后培養(yǎng)液作為種子液（0D6(KI=0. 5 )，待用。
[0025] 3. 2單菌落的培養(yǎng)：各取lmL不同種子液接種到100mL MMDT培養(yǎng)基（蔗糖5g/L， 葡萄糖 2g/L，麥芽糖 2g/L，酵母膏 5g/L，NH4Cl 1.5g/L，（NH4)2S04 1.5g/L，F(xiàn)eCl3 0. Olg/ L，MnCl2 0.01g/L，pH 8.0)中，30°C下培養(yǎng)24h，得到各細(xì)菌MMDT培養(yǎng)液。
[0026] 3. 3絮凝活性測定：分別取lmL3. 2中得到的MMDT培養(yǎng)液，加入到40 mL高嶺土 懸浮液中（10 g/L)，再加入lmL CaCl2溶液（1(^/1)，200印111，21^11使其完全混勻后，靜置 30min后，取4mL上清液測定上清液的0D 55(I，計算絮凝率（Flocculating Rate，F(xiàn)R)(見公 式Eq. 1)，以不加菌液只加 CaCl2溶液的高嶺土混合液作為對照組。從而根據(jù)絮凝率篩選出 絮凝效果好的胞外多聚物（EPS)分泌菌，將該菌命名為DT。
[0027] FR= (b_a)/b*100% Eq. 1 a是各菌液組〇D55Q值，b為對照組0D55Q值。
[0028] 3.4分子生物學(xué)鑒定：方法參照1.4。鑒定結(jié)果表明，DT屬于解淀粉芽孢桿菌 {Bacillus amyloliquefaciens、。
[0029] 實施例4 一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法，包括以下步驟： (1)溶藻菌、藻毒素降解菌的固定化，具體為： 1.1溶藻菌的固定化：使用80 mL MM培養(yǎng)基為溶劑，溶解2g海藻酸鈉，配制海藻酸鈉 溶液。將 100yLRl(0D6QQ=0.5)接種到 100mL LB 培養(yǎng)基，37°C、200rpm 培養(yǎng) 48h 后，8000rpm 離心5min，收集R1菌體。再用20 mL MM培養(yǎng)基再將R1菌體重懸，并將該懸浮液加入到上 述海藻酸鈉溶液中，充分混合后，使用lmL藍(lán)色槍頭將該混合液逐滴注入體積為100mL的 CaCl2溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%)中，4°C靜置24h后，制備出包埋著R1的海藻酸鈉小球，直徑平 均為2mm。
[0030] 1. 2銅綠微囊藻藻毒素降解菌的固定化：以相同的方法培養(yǎng)并固定銅綠微囊藻毒 素降解菌M1，制備出包埋著Ml的海藻酸鈉小球，直徑平均為2mm。
[0031] (2)胞外多聚物的分離純化：以MMDT培養(yǎng)基培養(yǎng)胞外多聚物分泌菌，將培養(yǎng)24小 時后的培養(yǎng)液通過進(jìn)一步純化，得到胞外多聚物制品；具體為： 2. 1細(xì)菌DT的培養(yǎng)：取lmL活化的細(xì)菌DT(0D6CICI=0. 5)，接種的1L MMDT培養(yǎng)基中，30°C， 200rpm培養(yǎng)24h，室溫下靜置48h。
[0032] 2. 2 EPS粗提：將2. 1中培養(yǎng)液4000rpm離心30min后丟棄上清，然后用50mL無菌 水溶解沉淀，加入_20°C預(yù)冰的丙酮100mL，于4°C冰箱中靜置24h待析出物穩(wěn)定。4000rpm 離心30min后，丟棄上清收集沉淀部分。
[0033] 2. 3 EPS純化：用50mL無菌水溶解2. 2中制備的沉淀，加入50 mLSevage (氯仿： 正丁醇=5 :1)溶液，潤旋振蕩器充分振蕩5min后，離心（4000rpm離心30min)收集上清液， 冷凍干燥機對收集到的上清液冷凍干燥，制得EPS。
[0034] (3)復(fù)合微生物絮凝劑的制備：以高嶺土、硫酸鋁鉀、氯化鈣以及步驟（2)得到的 胞外多聚物制品為原料，結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計方法設(shè)計胞外多聚物制品、高嶺土、硫酸鋁鉀、氯 化鈣之間的比例，得到絮凝效果最好的復(fù)合微生物絮凝劑，具體為： 3. 1 BBD實驗設(shè)計：使用3水平(高（+1)，中（0)，低（-1))4因素（EPS、高嶺土、硫酸鋁 鉀、氯化I丐)Box-Behnken Design (BBD)設(shè)計出27組實驗。各因素設(shè)計值及真實值見表1。
[0035] 表1編碼及實驗值水平

【權(quán)利要求】
1. 一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 溶藻菌、藻毒素降解菌的固定化：以海藻酸鈉為固定材料，以MM培養(yǎng)基作為溶劑， 配制質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的海藻酸鈉溶液后，對溶藻菌和藻毒素降解菌分別進(jìn)行固定化； (2) 胞外多聚物的分離純化：以MMDT培養(yǎng)基培養(yǎng)胞外多聚物分泌菌，將培養(yǎng)24小時后 的培養(yǎng)液通過進(jìn)一步純化，得到胞外多聚物制品； (3) 復(fù)合微生物絮凝劑的制備：以高嶺土、硫酸鋁鉀、氯化鈣以及步驟（2)得到的胞外 多聚物制品為原料，結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計方法設(shè)計胞外多聚物制品、高嶺土、硫酸鋁鉀、氯化鈣 之間的比例，得到絮凝效果最好的復(fù)合微生物絮凝劑； (4) 復(fù)合微生物除藻劑的制備：以步驟（1)得到的固定化的溶藻菌和固定化的藻毒素 降解菌與步驟（3)得到的復(fù)合微生物絮凝劑為原料，制備出微生物復(fù)合除藻劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法，其特征在于，所述步驟 (3)中，絮凝效果最好的復(fù)合微生物絮凝劑中，胞外多聚物制品、高嶺土、硫酸鋁鉀、氯化鈣 的質(zhì)量比為 〇· 25X 1(Γ3 :5· 64 :0· 08 :0· 125。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法，其特征在于，所述溶藻 菌保存于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（CGMCC)，保藏編號：CGMCC No. 9198,分類命名：檸檬酸桿菌(C/iro如cier sp.)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法，其特征在于，所述 藻毒素降解菌保存于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號：CGMCC No. 9197,分類命名：多粘類芽孢桿菌 iPeanibacillus polymyxa、。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物復(fù)合除藻劑的制備方法，其特征在于，所述胞 外多聚物分泌菌保存于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號：CGMCC No. 9196,分類命名：解淀粉芽孢桿菌 {Bacillus amyloliquefaciens、。
【文檔編號】C12R1/07GK104140963SQ201410289634
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】孫朋飛, 趙宇華, 王冠, 盧麗玲 申請人:浙江大學(xué)