硫酸慶大霉素C1a的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗生素發(fā)酵【技術領域】，提供了一種硫酸慶大霉素C1a的制備方法，通過改進慶大霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的組分用量，提高了慶大霉素C1a的產量，本發(fā)明硫酸慶大霉素C1a的制備方法生產工藝簡單易操作，通過改進硫酸慶大霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的組分用量和提取分離方法，獲得高質量的硫酸慶大霉素C1a。
【專利說明】硫酸慶大霉素Cl a的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及抗生素發(fā)酵【技術領域】，具體涉及硫酸慶大霉素Cla的制備方法。
【背景技術】
[0002]硫酸慶大霉素為氨基糖苷類抗生素，對各種革蘭陰性細菌及革蘭陽性細菌都有良好抗菌作用，對各種腸桿菌科細菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬及銅綠假單胞菌等有良好抗菌作用，奈瑟菌屬和流感嗜血桿菌對該品中度敏感。對布魯菌屬、鼠疫桿菌、不動桿菌屬、胎兒彎曲菌也有一定作用。對葡萄球菌屬(包括金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌)中甲氧西林敏感菌株的約80%有良好抗菌作用，但甲氧西林耐藥株則對該品多數(shù)耐藥。對鏈球菌屬和肺炎鏈球菌的作用較差，腸球菌屬則對該品大多耐藥，硫酸慶大霉素與β內酰胺類合用時，多數(shù)可獲得協(xié)同抗菌作用。硫酸慶大霉素的作用機制是與細菌核糖體30S亞單位結合，抑制細菌蛋白質的合成，近年來革蘭陰性桿菌對慶大霉素耐藥株顯著增多。硫酸慶大霉素Cla是硫酸慶大霉素組分之一，是合成硫酸依替米星的原料，硫酸依替米星為廣譜抗生素，對大部分革蘭氏陽性菌及陰性菌具有良好的抗菌作用，尤其對大腸桿菌、克雷白肺炎桿菌、沙雷氏菌、沙門氏菌和葡萄菌屬等均有較好的抗菌活性，對部分慶大霉素、小諾霉素和頭孢唑啉耐藥的金葡菌、大腸桿菌、克雷白肺炎桿菌均具有抗菌活性，對產生青霉素酶的部分葡萄球菌和部分低水平甲氧西林耐藥的葡萄球菌亦有一定抗菌活性。硫酸依替米星具有高效、低毒、抗耐藥菌等特點，抗菌譜廣，對多種病原菌有較好的抗菌作用，對呼吸道感染、腎臟和泌尿系統(tǒng)感染、皮膚組織感染均有較好的療效。
[0003]現(xiàn)有硫酸慶大霉素Cla的制備方法是:由慶大霉素菌種誘變得到生產慶大霉素Cla高的菌種，由該菌種進行發(fā)酵，提取出硫酸慶大霉素Cla，該方法的缺點是，菌種發(fā)酵單位低，發(fā)酵單位通常為995u/ml左右。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明提供了一種能夠，通過改進硫酸慶大霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的組分用量和提取分離，獲得高質量的硫酸慶大霉素Cla的制備方法，其發(fā)酵單位達到1600u/ml以上。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為:
硫酸慶大霉素Cla的制備方法，包括以下步驟:
1)取慶大霉素沙土孢子置于孢子斜面培養(yǎng)基上進行孢子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34-38°C，培養(yǎng)時間為8-12天，得到斜面培養(yǎng)后的慶大霉素孢子；
2)將步驟I)中得到的斜面培養(yǎng)后的慶大霉素孢子進行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)的孢子接入量為:孢子斜面挖取0.25-0.3cm2接入一個搖瓶，培養(yǎng)溫度為34_38°C，培養(yǎng)時間為30-40小時，得到慶大霉素搖瓶菌絲；
3)將步驟2)得到的慶大霉素搖瓶菌絲置于種子培養(yǎng)基上進行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)的接入量為:按種子培養(yǎng)基體積的千分之二接入搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為34-38°C，培養(yǎng)時間為40-50小時，得到慶大霉素種子培養(yǎng)物；
4)將步驟3)得到的慶大霉素種子培養(yǎng)物置于繁殖罐中進行擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)接入量為擴大培養(yǎng)基體積的20-30%，培養(yǎng)溫度為34-38°C，培養(yǎng)時間為40-50小時，得到慶大霉素繁殖培養(yǎng)物；
5)將步驟4)得到的慶大霉素繁殖培養(yǎng)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基上進行發(fā)酵，培養(yǎng)物的接入量為擴大培養(yǎng)基體積的20-30%，發(fā)酵溫度為34-38°C，發(fā)酵時間為120-150小時，得到慶大霉素發(fā)酵產物；
6)將步驟5)得到的慶大霉素發(fā)酵產物進行酸化處理至pH值為2-3，得到酸化液；
7)將步驟6)得到的慶大霉素酸化液進行中和處理，處理后得到pH值為6.8-7.0的中和液；
8)將步驟7)得到的中和液以732樹脂進行吸附4-6小時，進行固液分離，液體部分進污水站進行污水處理，固體部分為吸附了慶大霉素各種組分的飽和732樹脂；
9)將步驟8)得到的吸附了慶大霉素各種組分的飽和732樹脂，上柱去除Ca2+、Mg2+、Cr1，得到去除離子的飽和732樹脂；
10)將步驟9)得到 的去除離子的飽和732樹脂，以質量百分含量為4.5-5.5%的氨水進行解析，得到慶大霉素解析液；
11)將步驟10)得到的慶大霉素解析液以711樹脂進行脫色，得到慶大霉素脫色液；
12)將步驟11)得到的慶大霉素脫色液以薄膜進行濃縮，得到慶大霉素初濃縮液；
13)將步驟12)得到的慶大霉素濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素濃縮液；
14)將步驟13)得到的硫酸慶大霉素濃縮液加活性炭，加熱到60-80°C過濾，得到硫酸慶大霉素成品液；
15)將步驟14)得到的硫酸慶大霉素成品液加純化水稀釋，稀釋至硫酸慶大霉素成品液體積的20倍，得到硫酸慶大霉素稀釋液；
16)將步驟15)得到的硫酸慶大霉素稀釋液用HZD-2樹脂進行動態(tài)吸附，硫酸慶大霉素稀釋液與HZD-2樹脂體積比為10:1.25 ；
17)將步驟16)得到的飽和HZD-2樹脂裝入徑高比為1:20的樹脂柱，用0.2-0.5%的氨水洗滌，洗至慶大霉素Cla含量大于95%時，用4.5-5.5%氨水解析，得到慶大霉素Cla解析液；
18)將步驟17)得到的慶大霉素Cla解析液濃縮，得到慶大霉素Cla初濃縮液；
19)將步驟18)得到的慶大霉素Cla初濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素Cla濃縮
液；
20)將步驟19)得到的硫酸慶大霉素Cla濃縮液加活性炭，加熱到60-80°C過濾，得到硫Ife慶大霉素Cla成品液；
21)將步驟20)得到的硫酸慶大霉素Cla成品液通過噴塔進行噴霧干燥，得到硫酸慶大霉素Cla成品粉；
進一步的，上述的硫酸慶大霉素的制備方法，所述步驟I)中慶大霉素沙土孢子的制備方法為:
a、按重量百分比慶大霉素沙土孢子培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%,硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%,麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%,瓊脂2.0% ;配制好的沙土孢子培養(yǎng)基在每個茄子瓶中分裝100ml，茄子瓶容積為500毫升，經滅菌后，斜放，凝固，滅菌條件為0.1MPa, 30分鐘，120度;
b、于超凈工作臺上，在火焰保護下，用無菌接種棒挑取砂土孢子0.1g于茄子瓶斜面培養(yǎng)基內，先劃中線，而后從下而上往兩邊劃線，均勻鋪開，塞好棉塞；
C、培養(yǎng)與保存:接種好的斜面包扎好后，34-38°C恒溫室架上培養(yǎng)8-12天，培養(yǎng)好的孢子斜面，4 °C冰箱儲存待用。
[0006]進一步的，在所述步驟I)中，按重量百分比計為孢子斜面培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%,硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%,麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%,瓊脂2.0%，余量為水。
[0007]進一步的，在所述步驟2)中，按重量百分比搖瓶培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%,硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%,麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，余量為水。
[0008]進一步的，在所述步驟3)中，按重量百分比種子培養(yǎng)基的配方為:淀粉1.5%，玉米粉1.0%，黃豆餅粉1%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷0.0005%,余量為水。
[0009]進一步的，在所述步驟4)中，按重量百分比擴大培養(yǎng)基的配方為:淀粉1.5%，玉米粉1.0%，黃豆餅粉1%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷0.0005%,余量為水。
[0010]進一步的，在所述步驟5)中，按重量百分比發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:淀粉4.5%，黃豆餅粉3.5%，玉米粉1.0%，碳酸鈣0.5%，蛋白胨0.4%，二氯化鈷0.0005%,硝酸鉀0.01份，硫酸銨0.1%，泡敵0.01%,余量為水。
[0011]進一步的，上述的硫酸慶大霉素的制備方法，
所述步驟6)中，酸化處理是以濃度30%的鹽酸進行處理，調PH2~3 ;
所述步驟7)中，中和處理是以濃度40%的氫氧化鈉進行處理，調pH6.8-7.0 ；
所述步驟8)中，吸附處理所用的732樹脂為001X7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂； 所述步驟9)中，去除Ca2+、Mg2+、Cl—1的柱子為Φ Im高2m柱;
所述步驟10)中，所述飽和樹脂是指每毫升樹脂吸附了 8萬單位慶大霉素得到的樹脂； 所述步驟11)中，脫色處理所用的711樹脂為強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂；
所述步驟12)中，濃縮量為500L/h，濃縮至原來的1/7 ；
所述步驟13)中，硫酸的濃度為98%，調至pH5.3 ；
所述步驟20)中，噴霧干燥的條件為進風溫度130°C，出風溫度85°C，噴速100L/h。
[0012]本發(fā)明的有益效果為:采用本發(fā)明硫酸慶大霉素Cla的制備方法，由硫酸慶大霉素發(fā)酵液提取硫酸慶大霉素Cla，發(fā)酵單位高，生產工藝簡單易操作，發(fā)酵單位達到1600U/ml以上。
【具體實施方式】
[0013]實施例1:
硫酸慶大霉素Cla的制備方法，包括以下步驟:
I)取慶大霉素沙土孢子置于孢子斜面培養(yǎng)基上進行孢子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時間為8-12天，得到斜面培養(yǎng)后的慶大霉素孢子；
慶大霉素沙土孢子的制備方法為:a、沙土孢子培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉(NaCl) 0.05%,硝酸鉀(KNO3) 0.1%，碳酸鈣(CaCO3) 0.1%，磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.02%，麩皮 1.8%，硫酸鎂(MgSO4) 0.02%,瓊脂2.0%，余量為水；配制好的沙土孢子培養(yǎng)基在每個茄子瓶中分裝100ml，茄子瓶容積為500毫升，經滅菌后，斜放，凝固，滅菌條件為0.1MPa, 30分鐘，120度；
b、于超凈工作臺上，在火焰保護下，用無菌接種棒挑取砂土孢子0.1g于茄子瓶斜面培養(yǎng)基內，先劃中線，而后從下而上往兩邊劃線，均勻鋪開，塞好棉塞；
C、培養(yǎng)與保存:接種好的斜面包扎好后，35°C恒溫室架上培養(yǎng)10天，培養(yǎng)好的孢子斜面，4°C冰箱儲存待用；
孢子斜面培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，瓊脂2%，余量為水；
2)將步驟I)中得到的斜面培養(yǎng)后的慶大霉素孢子進行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)的孢子接入量為:孢子斜面挖取0.25cm2接入一個搖瓶，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時間35小時，得到慶大霉素搖瓶菌絲；
搖瓶培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，余量為水；
3)將步驟2)得到的慶大霉素搖瓶菌絲置于種子培養(yǎng)基上進行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)的接入量為:慶大霉素搖瓶菌絲按種子培養(yǎng)基體積的千分之二接入搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為34-38°C，培養(yǎng)時間為48小時，得到慶大霉素種子培養(yǎng)物； 種子培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:淀粉1.5%，玉米粉1.5%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷(CoCl2) 0.0005%，余量為水；
4)將步驟3)得到的慶大霉素種子培養(yǎng)物置于繁殖罐中進行擴大培養(yǎng)，慶大霉素種子培養(yǎng)物接入量為擴大培養(yǎng)基體積的25%，培養(yǎng)溫度為34-38°C，培養(yǎng)時間為45小時，得到慶大霉素繁殖培養(yǎng)物；
擴大培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:淀粉1.5%，玉米粉1.5%，黃豆餅粉1%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷(CoCl2) 0.0005%，余量為水；
5)將步驟4)得到的慶大霉素繁殖培養(yǎng)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基上進行發(fā)酵，慶大霉素繁殖培養(yǎng)物的接入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的25%，發(fā)酵溫度為35°C，發(fā)酵時間為135小時，得到慶大霉素發(fā)酵產物；
發(fā)酵培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:淀粉4.5%，黃豆餅粉3.5%，玉米粉1%，碳酸鈣0.5%，蛋白胨0.4%，二氯化鈷(CoCl2)0.0005%,硝酸鉀0.01%,硫酸銨0.1%，泡敵0.01%,余量為水；
6)將步驟5)得到的慶大霉素發(fā)酵產物10噸，進行酸化處理至pH值為2.5，得到慶大霉素酸化液；酸化處理是以濃度30%的鹽酸進行處理，調pH2.5 ；
7)將步驟6)得到的慶大霉素酸化液進行中和處理，處理后得到pH值為6.8-7.0的慶大霉素發(fā)酵液；中和處理是以濃度40%的氫氧化鈉進行處理，調pH6.8 ；
8)將步驟7)得到的慶大霉素發(fā)酵液加732樹脂236L，進行吸附處理，得到樹脂吸附后的慶大霉素發(fā)酵液；吸附處理所用的732樹脂為001X7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂；
9)將步驟8)得到的樹脂吸附后的慶大霉素發(fā)酵液，過100目篩網進行固液分離，得到吸附慶大霉素的飽和732樹脂，將得到的飽和732樹脂上柱去除Ca2+Jg'Cr1，得到去除離子的飽和732樹脂；去除Ca2+、Mg2+、CF1的柱子為Φ Im高2m柱；
10)將步驟9)得到的去除離子的飽和樹脂，以質量百分含量為4.5-5.5%的氨水進行解析，得到慶大霉素解析液700升；所述飽和樹脂是指每毫升樹脂吸附了 8萬單位慶大霉素得到的樹脂；
11)將步驟10)得到的慶大霉素解析液以711樹脂進行脫色，得到慶大霉素脫色液700升；脫色處理所用的7 11樹脂為強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂；
12)將步驟11)得到的慶大霉素脫色液以薄膜進行濃縮，得到慶大霉素初濃縮液100升；濃縮量為500L/h，濃縮至原來的1/7 ；
13)將步驟12)得到的慶大霉素初濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素濃縮液；硫酸的濃度為98%，調至ρΗ5.3 ；
14)將步驟13)得到的硫酸慶大霉素濃縮液加活性炭15公斤，加熱到70°C過濾，得到硫Ife慶大霉素成品液18升；
15)將步驟14)得到的硫酸慶大霉素成品液加純化水342升稀釋，稀釋至360升；
16)將步驟15)得到的硫酸慶大霉素稀釋液用30升HZD-2樹脂進行動態(tài)吸附，吸附時間為8小時；
17)將步驟16)得到的飽和HZD-2樹脂裝入徑高比為1:20的樹脂柱，用0.2%的氨水洗滌，洗至慶大霉素Cla含量大于95%時，用4.5-5.5%氨水解析，得到慶大霉素Cla解析液500 升；
18)將步驟17)得到的500升慶大霉素Cla解析液濃縮，得到慶大霉素Cla初濃縮液50升；
19)將步驟18)得到的慶大霉素Cla初濃縮液加入濃度為98%的硫酸，調至pH5.3，制得硫酸慶大霉素Cla濃縮液55升；
20)將步驟19)得到的硫酸慶大霉素Cla濃縮液加活性炭10公斤，加熱到60-80°C過濾，得到硫酸慶大霉素Cla成品液52升；
21)將步驟20)得到的硫酸慶大霉素Cla成品液通過噴塔進行噴霧干燥，得到硫酸慶大霉素Cla成品粉9.5公斤；
實施例2
硫酸慶大霉素Cla的制備方法，包括以下步驟:
1)取慶大霉素沙土孢子置于孢子斜面培養(yǎng)基上進行孢子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34°C，培養(yǎng)時間為8天，得到斜面培養(yǎng)后的慶大霉素孢子；
2)將步驟I)中得到的斜面培養(yǎng)后的慶大霉素孢子進行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)的孢子接入量為:孢子斜面挖取0.3cm2接入一個搖瓶，培養(yǎng)溫度為38°C，培養(yǎng)時間為40小時，得到慶大霉素搖瓶菌絲；
3)將步驟2)得到的慶大霉素搖瓶菌絲置于種子培養(yǎng)基上進行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)的接入量為:慶大霉素搖瓶菌絲按種子培養(yǎng)基體積的千分之二接入搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為38°C，培養(yǎng)時間為48小時，得到慶大霉素種子培養(yǎng)物；
4)將步驟3)得到的慶大霉素種子培養(yǎng)物置于繁殖罐中進行擴大培養(yǎng)，慶大霉素種子培養(yǎng)物接入量為擴大培養(yǎng)基體積的20%，培養(yǎng)溫度為34°C，培養(yǎng)時間為40小時，得到慶大霉素繁殖培養(yǎng)物；5)將步驟4)得到的慶大霉素繁殖培養(yǎng)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基上進行發(fā)酵，慶大霉素繁殖培養(yǎng)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基上進行發(fā)酵，培養(yǎng)物的接入量為擴大培養(yǎng)基體積的20%，發(fā)酵溫度為34°C，發(fā)酵時間為120小時，得到慶大霉素發(fā)酵產物；
6)將步驟5)得到的慶大霉素發(fā)酵產物進行酸化處理至pH值為3，得到酸化液；
7)將步驟6)得到的慶大霉素酸化液進行中和處理，處理后得到pH值為6.8的中和液；
8)將步驟7)得到的中和液以732樹脂進行吸附4小時，進行固液分離，液體部分進污水站進行污水處理，固體部分為吸附了慶大霉素各種組分的飽和732樹脂；
9)將步驟8)得到的飽和732樹脂上柱去除Ca2+、Mg2+、Cr1，得到去除離子的飽和732樹脂；
10)將步驟9)得到的去除離子的飽和732樹脂以質量百分含量為4.5%%的氨水進行解析，得到慶大霉素解析液；
11)將步驟10)得到的慶大霉素解析液以711樹脂進行脫色，得到慶大霉素脫色液；
12)將步驟11)得到的慶大霉素脫色液以薄膜進行濃縮，得到慶大霉素初濃縮液；
13)將步驟12)得到的慶大霉素初濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素濃縮液；
14)將步驟13)得到的硫酸慶大霉素濃縮液加活性炭，加熱到60°C過濾，得到硫酸慶大霉素成品液；
15)將步驟14)得到的硫酸慶大霉素成品液加純化水稀釋，稀釋至硫酸慶大霉素成品液體積的20倍；
16)將步驟15)得到的硫酸慶大霉素稀釋液用HZD-2樹脂進行動態(tài)吸附，硫酸慶大霉素稀釋液與HZD-2樹脂體積比為10:1.25 ；
17)將步驟16)得到的飽和HZD-2樹脂裝入徑高比為1:20的樹脂柱，用0.2-0.5%的氨水洗滌，洗至慶大霉素Cla含量大于95%時，用4.5%氨水解析，得到慶大霉素Cla解析液；
18)將步驟17)得到的慶大霉素Cla解析液濃縮，得到慶大霉素Cla初濃縮液；
19)將步驟18)得到的慶大霉素Cla初濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素Cla濃縮
液；
20)將步驟19)得到的硫酸慶大霉素Cla濃縮液加活性炭，加熱到60°C過濾，得到硫酸慶大霉素Cla成品液；
21)將步驟20)得到的硫酸慶大霉素Cla成品液通過噴塔進行噴霧干燥，得到硫酸慶大霉素Cla成品粉；
步驟I)中慶大霉素沙土孢子的制備方法為:
a、慶大霉素沙土孢子培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%,麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%,瓊脂2.0% ；配制好的慶大霉素沙土孢子培養(yǎng)基在每個茄子瓶中分裝100ml，茄子瓶容積為500毫升，經滅菌后，斜放，凝固，滅菌條件為0.1MPa, 30分鐘，120度；
b、于超凈工作臺上，在火焰保護下，用無菌接種棒挑取砂土孢子0.1g于茄子瓶斜面培養(yǎng)基內，先劃中線，而后從下而上往兩邊劃線，均勻鋪開，塞好棉塞；
C、培養(yǎng)與保存:.接種好的斜面包扎好后，34-38°C恒溫室架上培養(yǎng)18天，培養(yǎng)好的孢子斜面，4 °C冰箱儲存待用。
[0014]步驟I)中，孢子斜面培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%,麩皮1.8%,硫酸鎂0.02%,瓊脂2.0%，
余量為水。
[0015]步驟2)中，搖瓶培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉
0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，余量為水。
[0016]步驟3)中，種子培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:淀粉1.5%，玉米粉1.0%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷0.0005%,余量為水。
[0017]步驟4)中，擴大培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:淀粉1.5%，玉米粉1.0%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷0.0005%,余量為水。
[0018]步驟5)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:淀粉4.5%，黃豆餅粉3.5%，玉米粉1.0%，碳酸鈣0.5%，蛋白胨0.4%，二氯化鈷0.0005%,硝酸鉀0.01%，硫酸銨0.1%，泡敵
0.01%，余量為水。
[0019]步驟6)中，酸化處理是以濃度30%的鹽酸進行處理，調pH2 ；
步驟7)中，中和處理是以濃度40%的氫氧化鈉進行處理，調pH6.8 ；
步驟8)中，吸附處理所用的732樹脂為001X7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂； 步驟9)中，去除Ca2+、Mg2+、Cl—1的柱子為Φ Im高2m柱;
步驟10)中，所述飽和樹脂是指每毫升樹脂吸附了 8萬單位慶大霉素得到的樹脂； 步驟11)中，脫色處理所用的711樹脂為強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂；
步驟12)中，濃縮量為500L/h，濃縮至原來的1/7 ；
步驟13)中，硫酸的濃度為98%，調至pH5.3 ；
步驟21)中，噴霧干燥的條件為進風溫度130°C，出風溫度85°C，噴速100L/h。
[0020]實施例3
硫酸慶大霉素Cla的制備方法，包括以下步驟:
1)取慶大霉素沙土孢子置于孢子斜面培養(yǎng)基上進行孢子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為38°C，培養(yǎng)時間為12天，得到斜面培養(yǎng)后的慶大霉素孢子；
2)將步驟I)中得到的斜面培養(yǎng)后的慶大霉素孢子進行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)的孢子接入量為:孢子斜面挖取0.3cm2接入一個搖瓶，培養(yǎng)溫度為38°C，培養(yǎng)時間為40小時，得到慶大霉素搖瓶菌絲；
3)將步驟2)得到的慶大霉素搖瓶菌絲置于種子培養(yǎng)基上進行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)的接入量為:慶大霉素搖瓶菌絲按種子培養(yǎng)基體積的千分之二接入搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為38°C，培養(yǎng)時間為48小時，得到慶大霉素種子培養(yǎng)物；
4)將步驟3)得到的慶大霉素種子培養(yǎng)物置于繁殖罐中進行擴大培養(yǎng)，慶大霉素種子培養(yǎng)物接入量為擴大培養(yǎng)基體積的30%，培養(yǎng)溫度為38°C，培養(yǎng)時間為50小時，得到慶大霉素繁殖培養(yǎng)物；
5)將步驟4)得到的慶大霉素繁殖培養(yǎng)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基上進行發(fā)酵，慶大霉素繁殖培養(yǎng)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基上進行發(fā)酵，培養(yǎng)物的接入量為擴大培養(yǎng)基體積的30%，發(fā)酵溫度為38°C，發(fā)酵時間為150小時，得到慶大霉素發(fā)酵產物；
6)將步驟5)得到的慶大霉素發(fā)酵產物進行酸化處理至pH值為3，得到酸化液；
7)將步驟6)得到的慶大霉素酸化液進行中和處理，處理后得到pH值為7.0的中和液；
8)將步驟7)得到的中和液以732樹脂進行吸附6小時，進行固液分離，液體部分進污水站進行污水處理，固體部分為吸附了慶大霉素各種組分的飽和732樹脂；
9)將步驟8)得到的飽和732樹脂上柱去除Ca2+、Mg2+、Cr1，得到去除離子的飽和732樹脂；
10)將步驟9)得到的去除離子的飽和732樹脂以質量百分含量5.5%的氨水進行解析，得到慶大霉素解析液；
11)將步驟10)得到的慶大霉素解析液以711樹脂進行脫色，得到慶大霉素脫色液；
12)將步驟11)得到的慶大霉素脫色液以薄膜進行濃縮，得到慶大霉素濃縮液；
13)將步驟12)得到的慶大霉素濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素濃縮液；
14)將步驟13)得到的硫酸慶大霉素濃縮液加活性炭，加熱到80°C過濾，得到硫酸慶大霉素成品液；
15)將步驟14)得到的硫酸慶大霉素成品液加純化水稀釋，稀釋至硫酸慶大霉素成品液體積的20倍；
16)將步驟15)得到的硫酸慶大霉素稀釋液用HZD-2樹脂進行動態(tài)吸附，硫酸慶大霉素稀釋液與HZD-2樹脂體積比為10:1.25 ；
17)將步驟16)得到的飽和H ZD-2樹脂裝入徑高比為1:20的樹脂柱，用0.5%的氨水洗滌，洗至慶大霉素Cla含量大于95%時，用4.5-5.5%氨水解析，得到慶大霉素Cla解析液；
18)將步驟17)得到的慶大霉素Cla解析液濃縮，得到慶大霉素Cla濃縮液；
19)將步驟18)得到的慶大霉素Cla濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素Cla濃縮液；
20)將步驟19)得到的硫酸慶大霉素Cla濃縮液加活性炭，加熱到80°C過濾，得到硫酸慶大霉素Cla成品液；
21)將步驟20)得到的硫酸慶大霉素Cla成品液通過噴塔進行噴霧干燥，得到硫酸慶大霉素Cla成品粉；
步驟I)中慶大霉素沙土孢子的制備方法為:
a、慶大霉素沙土孢子培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%,麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%,瓊脂2.0% ；配制好的慶大霉素沙土孢子培養(yǎng)基在每個茄子瓶中分裝100ml，茄子瓶容積為500毫升，經滅菌后，斜放，凝固，滅菌條件為0.1MPa, 30分鐘，120度；
b、于超凈工作臺上，在火焰保護下，用無菌接種棒挑取砂土孢子0.1g于茄子瓶斜面培養(yǎng)基內，先劃中線，而后從下而上往兩邊劃線，均勻鋪開，塞好棉塞；
C、培養(yǎng)與保存:接種好的斜面包扎好后，34-38°C恒溫室架上培養(yǎng)12天，培養(yǎng)好的孢子斜面，4 °C冰箱儲存待用。
[0021]孢子斜面培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，瓊脂2.0%，余量為水。
[0022]步驟2)中，搖瓶培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，余量為水。
[0023]步驟3)中，種子培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:淀粉1.5%，玉米粉1.0%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷0.0005%,余量為水。
[0024]步驟4)中，擴大培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:淀粉1.5%，玉米粉1.0%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷0.0005%,余量為水。[0025]步驟5)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方按重量百分比計為:淀粉4.5%，黃豆餅粉3.5%，玉米粉1.0%，碳酸鈣0.5%，蛋白胨0.4%，二氯化鈷0.0005%,硝酸鉀0.01%,硫酸銨0.1%，泡敵
0.01%，余量為水。
[0026]步驟6)中，酸化處理是以濃度30%的鹽酸進行處理，調pH2~3 ;
步驟7)中，中和處理是以濃度40%的氫氧化鈉進行處理，調pH6.8~7.0 ;
步驟8)中，吸附處理所用的732樹脂為001X7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂； 步驟9)中，去除Ca2+、Mg2+、Cl—1的柱子為Φ Im高2m柱;
步驟10)中，飽和樹脂是指每毫升樹脂吸附了 8萬單位慶大霉素得到的樹脂；
步驟11)中，脫色處理所用的711樹脂為強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂；
步驟12)中，濃縮量為500L/h，濃縮至原來的1/7 ；
步驟13)中，硫酸的濃度為98%，調至pH5.3 ；
步驟21)中，噴霧干燥的條件為進風溫度130°C，出風溫度85°C，噴速100L/h。
[0027]本發(fā)明發(fā)酵單位與現(xiàn)有方法發(fā)酵單位比較.
【權利要求】
1.硫酸慶大霉素Cla的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)取慶大霉素沙土孢子置于孢子斜面培養(yǎng)基上進行孢子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34-38°C，培養(yǎng)時間為8-12天，得到斜面培養(yǎng)后的慶大霉素孢子； 2)將步驟I)中得到的斜面培養(yǎng)后的慶大霉素孢子進行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)的孢子接入量為:孢子斜面挖取0.25-0.3cm2接入一個搖瓶，培養(yǎng)溫度為34_38°C，培養(yǎng)時間為30-40小時，得到慶大霉素搖瓶菌絲； 3)將步驟2)得到的慶大霉素搖瓶菌絲置于種子培養(yǎng)基上進行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)的接入量為:慶大霉素搖瓶菌絲按種子培養(yǎng)基體積的千分之二接入搖瓶種子，培養(yǎng)溫度為34-38°C，培養(yǎng)時間為48小時，得到慶大霉素種子培養(yǎng)物； 4)將步驟3)得到的慶大霉素種子培養(yǎng)物置于繁殖罐中進行擴大培養(yǎng)，慶大霉素種子培養(yǎng)物接入量為擴大培養(yǎng)基體積的20-30%，培養(yǎng)溫度為34-38°C，培養(yǎng)時間為40-50小時，得到慶大霉素繁殖培養(yǎng)物； 5)將步驟4)得到的慶大霉素繁殖培養(yǎng)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基上進行發(fā)酵，慶大霉素繁殖培養(yǎng)物置于發(fā)酵培養(yǎng)基上進行發(fā)酵，培養(yǎng)物的接入量為擴大培養(yǎng)基體積的20-30%，發(fā)酵溫度為34-38°C，發(fā)酵時間為120-150小時，得到慶大霉素發(fā)酵產物； 6)將步驟5)得到的慶大霉素發(fā)酵產物進行酸化處理至pH值為2-3，得到酸化液； 7)將步驟6)得到的慶大霉素酸化液進行中和處理，處理后得到pH值為6.8-7.0的中和液； 8)將步驟7)得到的中和液以732樹脂進行吸附4-6小時，進行固液分離，液體部分進污水站進行污水處理，固體部分為吸附了慶大霉素各種組分的飽和732樹脂； 9)將步驟8)得到的飽和732樹脂上柱去除Ca2+、Mg2+、Cr1，得到去除離子的飽和732樹脂； 10)將步驟9)得到的去除離子的飽和732樹脂以質量百分含量為4.5-5.5%的氨水進行解析，得到慶大霉素解析液； 11)將步驟10)得到的慶大霉素解析液以711樹脂進行脫色，得到慶大霉素脫色液； 12)將步驟11)得到的慶大霉素脫色液以薄膜進行濃縮，得到慶大霉素初濃縮液； 13)將步驟12)得到的慶大霉素初濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素濃縮液； 14)將步驟13)得到的硫酸慶大霉素濃縮液加活性炭，加熱到60-80°C過濾，得到硫酸慶大霉素成品液； 15)將步驟14)得到的硫酸慶大霉素成品液加純化水稀釋，稀釋至硫酸慶大霉素成品液體積的20倍，得到硫酸慶大霉素稀釋液； 16)將步驟15)得到的硫酸慶大霉素稀釋液用HZD-2樹脂進行動態(tài)吸附，硫酸慶大霉素稀釋液與HZD-2樹脂體積比為10:1.25 ； 17)將步驟16)得到的飽和HZD-2樹脂裝入徑高比為1:20的樹脂柱，用0.2-0.5%的氨水洗滌，洗至慶大霉素Cla含量大于95%時，用4.5-5.5%氨水解析，得到慶大霉素Cla解析液； 18)將步驟17)得到的慶大霉素Cla解析液濃縮，得到慶大霉素Cla初濃縮液； 19)將步驟18)得到的慶大霉素Cla初濃縮液加入硫酸后制得硫酸慶大霉素Cla濃縮液；20)將步驟19)得到的硫酸慶大霉素Cla濃縮液加活性炭，加熱到60-80°C過濾，得到硫Ife慶大霉素Cla成品液； 21)將步驟20)得到的硫酸慶大霉素Cla成品液通過噴塔進行噴霧干燥，得到粉狀硫酸慶大霉素Cla成品。
2.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素Cla的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中慶大霉素沙土孢子的制備方法為: a、按重量百分比慶大霉素沙土孢子培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%,硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%,麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%,瓊脂2.0% ;配制好的慶大霉素沙土孢子培養(yǎng)基在每個茄子瓶中分裝100ml，茄子瓶容積為500毫升，經滅菌后，斜放，凝固，滅菌條件為0.1MPa, 30分鐘，120度； b、于超凈工作臺上，在火焰保護下，用無菌接種棒挑取砂土孢子0.1g于茄子瓶斜面培養(yǎng)基內，先劃中線，而后從下而上往兩邊劃線，均勻鋪開，塞好棉塞； C、培養(yǎng)與保存:接種好的斜面包扎好后，34-38°C恒溫室架上培養(yǎng)18-12天，培養(yǎng)好的孢子斜面，4 V冰箱儲存待用。
3.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素Cla的制備方法，其特征在于，在所述步驟I)中，按重量百分比計為孢子斜面培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，瓊脂2.0%，余量為水。
4.根據權利 要求1所述的硫酸慶大霉Cla素的制備方法，其特征在于，在所述步驟2)中，按重量百分比搖瓶培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉1.0%，氯化鈉0.05%，硝酸鉀0.1%，碳酸鈣0.1%，磷酸氫二鉀0.02%，麩皮1.8%，硫酸鎂0.02%，余量為水。
5.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素Cla的制備方法，在所述步驟3)中，按重量百分比搖瓶培養(yǎng)基的配方為:淀粉1.5%，玉米粉1.0%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷0.0005%,余量為水。
6.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素Cla的制備方法，其特征在于，在所述步驟4)中，按重量百分比搖瓶培養(yǎng)基的配方為:淀粉1.5%，玉米粉1.0%，黃豆餅粉1.0%，硝酸鉀0.05%，蛋白胨0.2%，二氯化鈷0.0005%,余量為水。
7.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素Cla的制備方法，其特征在于，在所述步驟5)中，按重量百分比發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:淀粉4.5%，黃豆餅粉3.5%，玉米粉1.0%，碳酸鈣0.5%，蛋白胨0.4%，二氯化鈷0.0005%，硝酸鉀0.01%，硫酸銨0.1%，泡敵0.01%，余量為水。
8.根據權利要求1所述的硫酸慶大霉素Cla的制備方法，其特征在于: 所述步驟6)中，酸化處理是以濃度30%的鹽酸進行處理，調pH2~3 ; 所述步驟7)中，中和處理是以濃度40%的氫氧化鈉進行處理，調pH6.8-7.0 ； 所述步驟8)中，吸附處理所用的732樹脂為001X7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂； 所述步驟9)中，去除Ca2+、Mg2+、Cl—1的柱子為Φ Im高2m柱; 所述步驟10)中，所述飽和樹脂是指每毫升樹脂吸附了 8萬單位慶大霉素得到的樹脂； 所述步驟11)中，脫色處理所用的711樹脂為強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂； 所述步驟12)中，濃縮量為500L/h，濃縮至原來的1/7 ； 所述步驟13)中，硫酸的濃度為98%，調至pH5.3 ； 所述步驟21)中，噴霧干燥的條件為進風溫度130°C，出風溫度85°C，噴速100L/h。
【文檔編號】C12P19/50GK104017844SQ201410289751
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權日:2014年6月26日
【發(fā)明者】葛祥斌, 王麗麗, 孫永國, 馬金鳳, 張文浩, 李賢坤, 王永盛, 楊俊法, 張健 申請人:煙臺只楚藥業(yè)有限公司