一種提高綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的一種提高綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的方法，將染色分離獲取的質(zhì)次BCB-卵母細(xì)胞，體外成熟、體外受精后用含有200nMol/L組蛋白去乙?；种苿┣乓志谹(TSA)培養(yǎng)液培養(yǎng)10h，用不含有TSA的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后統(tǒng)計(jì)卵裂率，培養(yǎng)7d后統(tǒng)計(jì)囊胚率即可，另將染色分離獲取的BCB+卵母細(xì)胞用成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)至24h直接利用。該法對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外利用，具有重要的實(shí)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種提高綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組蛋白去乙酰化抑制劑曲古抑菌素A(TSA)，對(duì)經(jīng)過(guò)BCB篩選后的質(zhì)量 不好的BCB陰性卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方法，能顯著提高綿羊卵母細(xì)胞體外胚胎發(fā)育率。

【背景技術(shù)】
[0002] TSA是一種非競(jìng)爭(zhēng)性可逆的組蛋白乙?；种苿?，其來(lái)源于鏈霉素的代謝產(chǎn)物，它 的主要作用是增強(qiáng)組蛋白的乙酰化水平。TSA可以特異性抑制組蛋白去乙酰化酶的活性，降 低DNA甲基化水平并激活印記基因和管家基因的表達(dá)。而組蛋白的高乙?；娇梢栽鰪?qiáng) 轉(zhuǎn)錄因子與核小體的作用，有利于基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)。當(dāng)組蛋白乙?；饔眠_(dá)到高峰時(shí)胚胎 的基因組被激活，并與基因表達(dá)水平的增加相一致。因此，組蛋白去乙?；种苿㏕SA可能 會(huì)對(duì)綿羊卵母細(xì)胞及體外胚胎的發(fā)育能力產(chǎn)生影響。
[0003] 在前期研究的一種用于綿羊卵母細(xì)胞體外的篩選培養(yǎng)方法（專利號(hào)： ZL200910113567. 9)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)BCB篩選后的陰性卵母細(xì)胞成熟率極顯著低于陽(yáng)性卵母 細(xì)胞，因而，如何提高陰性卵母細(xì)胞質(zhì)量成為亟待解決的問(wèn)題。文獻(xiàn)檢索披露：l.Reprod FertDev，2007,19 (1)，169,作者：ZhangYH等，發(fā)表的《TSA優(yōu)化處理的克隆胚胎體外培 養(yǎng)體系可以得到克隆小豬》文章得出，50nM的TSA能提高豬克隆胚胎體外培養(yǎng)的囊胚率。 2.Zygote，2009,17, 209-215,作者：ShuntaroIkeda等，發(fā)表的《在牛的卵母細(xì)胞體外受精 過(guò)程中通過(guò)TSA增加組蛋白乙酰化水平影響囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)》文章得出，在牛的卵母細(xì)胞 體外受精過(guò)程中經(jīng)TSA處理后，顯著提高了囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)。3.R印rodDev，2011，57(1): 34-42,作者：LeeMJ等，發(fā)表的《TSA提高了牛體細(xì)胞核移植胚胎的發(fā)育》文章得出，TSA處 理牛克隆胚胎，可以顯著提高牛體細(xì)胞核移植的效率。
[0004] 國(guó)內(nèi)有中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所劉曉等8人發(fā)表的《曲古抑菌素A對(duì) 豬卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚胎發(fā)育能力的影響》、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 李向臣等5人發(fā)表的《TSA對(duì)灘羊成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞的作用》、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科 學(xué)學(xué)院黃波等5人發(fā)表的《TSA濃度及處理時(shí)間對(duì)豬體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育影響》。
[0005] 本發(fā)明將TSA與BCB篩選技術(shù)相結(jié)合作為本方法的切入點(diǎn)，展開(kāi)的方法學(xué)與應(yīng)用 學(xué)的研究，能極大地提高綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力，具有重要的實(shí)踐意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目在于：為提高綿羊卵母細(xì)胞的質(zhì)量，即先采用BCB染色篩選，再對(duì)篩選 后的質(zhì)量差的卵母細(xì)胞用TSA進(jìn)行抑制培養(yǎng)，效果十分明顯，該方法簡(jiǎn)單易操作，實(shí)用性極 強(qiáng)。
[0007] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種提高綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的方法，分步 實(shí)施；
[0008] 步驟1將染色分離獲取的質(zhì)次BCB-卵母細(xì)胞，用成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，按25-30 枚/滴，放入前2h平衡好的體積為55-78iil/滴的成熟培養(yǎng)液中，放入0)2箱，在5%C02、 95 %的空氣條件下培養(yǎng)；
[0009] 步驟2將步驟1體外成熟23_25h的卵母細(xì)胞取出，用0. 1 %的透明質(zhì)酸酶處理 30-60s，經(jīng)吹吸，脫去卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞；用體外受精液洗滌2-4次，按25-30枚/ 滴的密度加入前2h平衡好的50-70ill的體外受精液滴內(nèi)；水浴解凍精液，移入前2h平衡 好的裝有體外受精液的試管，放入C02箱，上游20-25min，取上清，在1500rpm條件下，離心 4-5min，棄去上清液，將剩余的精子沉淀，按2-4X106個(gè)/ml的密度加入體外受精液滴，與 處理好的卵母細(xì)胞共同孵育；
[0010] 步驟3將步驟2受精20-23h的卵取出，移至平衡好的含有TSA的體外培養(yǎng)液內(nèi)， 經(jīng)吹吸，脫去卵丘細(xì)胞及黏附卵上的精子，洗滌3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好 的500yl/孔的含有TSA的體外培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)10h，再用不含TSA的體外培養(yǎng)液洗滌2-3 次，放置于不含TSA的體外培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)7d，統(tǒng)計(jì)囊胚率；
[0011] 其中BCB-卵母細(xì)胞的獲?。赫≡讱?0min內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在30-35°C， 含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3h內(nèi)用生理鹽水清洗3-4次，用 吸有l(wèi)ml抽卵液，帶有9號(hào)針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8mm的卵泡，將注射器內(nèi)回 收的卵泡液打在35-60mm的皿內(nèi)，在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣?xì)胞，放入添加濃度為25-30yMol/ L的BCB染色液，置于35-39°C水浴中染色80-90min，在顯微鏡下將BCB+和BCB-卵母細(xì)胞 分離，其中將染色分離的BCB+卵母細(xì)胞，用成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)至24h，直接利用；
[0012] 步驟4實(shí)驗(yàn)液體的配制：
[0013] 抽卵液：TCM199_hepes+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml肝素納；
[0014] 亮甲酚藍(lán)染色液：PBS+26iiMol/L亮甲酚藍(lán)+5mg/mlBSA;
[0015] 成熟培養(yǎng)液：TCM199-HC03+10 %FBS+0. 05IU/mlFSH+0. 05IU/mlLH+1iig/ml estradiol+24. 2ug/ml丙麗酸納 +0?ImM/L半胱;氛酸 +10ng/mlEGF+lOOIU/ml雙抗；
[0016] S0F:6. 29mg/mlNaCL+0. 534mg/mlKCL+0. 162mg/mlKH2P04+0. 6ii1/ml乳酸鈉 +0? 089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml丙酮酸鈉 +0? 299mg/mlCaCL2 ? 2H20 ;
[0017] 體外受精液：S0F+20%FBS+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml硫酸慶大霉素；
[0018] 體外培養(yǎng)液：S0F+3mg/mlBSA;
[0019] 含TSA體外培養(yǎng)液：S0F+200nMol/LTSA+3mg/mlBSA。
[0020] 本發(fā)明在前期的研究中，已經(jīng)驗(yàn)證了亮甲酚藍(lán)染色（BCB)(專利號(hào)： ZL200910113567. 9)可用于測(cè)定G6TOH活性，根據(jù)G6TOH活性的不同，BCB染色呈現(xiàn)不同程 度的著色；并且發(fā)現(xiàn)BCB-卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟率、卵裂率、囊胚率顯著低于BCB+組，因 此采用TSA與BCB篩選技術(shù)相結(jié)合；就是將BCB-卵母細(xì)胞使用添加TSA的培養(yǎng)液作用10 和，能提高BCB-卵母細(xì)胞質(zhì)量，而B(niǎo)CB+卵母細(xì)胞質(zhì)量不受任何影響，從而能提高卵母細(xì)胞 總體發(fā)育效率。
[0021] 本發(fā)明的構(gòu)思及研究機(jī)理表明，添加曲古抑菌素A能顯著提高經(jīng)BCB篩選后的質(zhì) 次BCB-卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)囊胚發(fā)育率。采用TSA與BCB篩選技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)路線科學(xué) 合理，組合方法達(dá)到了創(chuàng)新效果，且有獨(dú)到之處，彰顯技術(shù)進(jìn)步。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明.
[0023] 實(shí)施例
[0024] 將染色分離獲取的質(zhì)次BCB-卵母細(xì)胞，用成熟培養(yǎng)液洗滌3次，按28枚/滴，放 入前2h平衡好的體積為60iU/滴的成熟培養(yǎng)液中，放入C02箱，在5%C02、95%的空氣條 件下培養(yǎng)；將體外成熟24h的卵母細(xì)胞取出，用0. 1 %的透明質(zhì)酸酶處理45s，經(jīng)吹吸，脫去 部分卵丘細(xì)胞；用體外受精液洗滌3次，按28枚/滴的密度加入前2h平衡好的60ill的體 外受精液滴內(nèi)；水浴解凍精液，移入前2h平衡好的裝有體外受精液的試管，放入C02箱，上 游23min，取上清，在1500rpm條件下，離心5min，棄去上清液，將剩余的精子沉淀，按3X106 個(gè)/ml的密度加入體外受精液滴，與處理好的卵母細(xì)胞共同孵育；將受精21h的卵取出，移 至平衡好的含有TSA的體外培養(yǎng)液內(nèi)，經(jīng)吹吸，脫去全部卵丘細(xì)胞及黏附卵上的精子，洗滌 4次，按60枚/孔的密度移入平衡好的500yl/孔的含有TSA的體外培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)10h，再 用不含TSA的體外培養(yǎng)液洗滌3次，放置于不含TSA的體外培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)7d，統(tǒng)計(jì)囊胚率；
[0025] 其中BCB-卵母細(xì)胞的獲?。赫≡讱?0min內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在32°C，含 1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3h內(nèi)用生理鹽水清洗3次；用吸有 lml抽卵液，帶有9號(hào)針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面6_的卵泡，將注射器內(nèi)回收的卵泡 液打在45mm的皿內(nèi)，在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣?xì)胞，放入添加濃度為30yMol/L的BCB染色液， 至于36°C水浴中染色90min;在顯微鏡下將BCB+和BCB-卵母細(xì)胞分離，分別培養(yǎng)至24h， 再分別進(jìn)行體外受精，將受精22h的BCB-卵母細(xì)胞取出，移至平衡好的含有TSA的體外培 養(yǎng)液內(nèi)，經(jīng)吹吸，脫去全部卵丘細(xì)胞及黏附卵上的精子，洗滌4次，按60枚/孔的密度移入 平衡好的500yl/孔的含有TSA的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)10h，再用不含TSA的培養(yǎng)液洗滌3次，入 培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)48h后統(tǒng)計(jì)卵裂率，7d后統(tǒng)計(jì)囊胚率即可；
[0026] 其中染色分離的BCB+卵母細(xì)胞直接利用即可；
[0027] 其中實(shí)驗(yàn)液體的配置：
[0028] 抽卵液：TCM199_hepes+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml肝素納；
[0029] 亮甲酚藍(lán)染色液：PBS+26iiMol/L亮甲酚藍(lán)+5mg/mlBSA;
[0030] 成熟培養(yǎng)液：TCM199-HC03+10 %FBS+0. 05IU/mlFSH+0. 05IU/mlLH+1iig/ml estradiol+24. 2ug/ml丙麗酸納 +0?ImM/L半胱;氛酸 +10ng/mlEGF+lOOIU/ml雙抗；
[0031] S0F:6. 29mg/mlNaCL+0. 534mg/mlKCL+0. 162mg/mlKH2P04+0. 1/ml乳酸鈉 +0? 089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0. 0357mg/ml丙酮酸鈉 +0? 299mg/mlCaCL2 ? 2H20 ;
[0032] 體外受精液：S0F+20%FBS+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml硫酸慶大霉素；
[0033] 含TSA體外培養(yǎng)液：S0F+200nMol/LTSA+3mg/mlBSA.
[0034] 體外培養(yǎng)液：S0F+3mg/mlBSA;
[0035] 本方法采用顯微鏡檢測(cè)卵母細(xì)胞質(zhì)量，細(xì)胞質(zhì)不著藍(lán)色的BCB-卵母細(xì)胞質(zhì)量顯 著低于胞質(zhì)著藍(lán)色的BCB+卵母細(xì)胞。
[0036] 本方法試驗(yàn)選用的TCM199-h印es、PVA、肝素鈉、亮甲酚藍(lán)、PBS、BSA、FBS、FSH、LH、 estradi〇l、EGF、半胱氨酸、TSA均購(gòu)自SIGMA公司、雙抗購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公 司。
[0037] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)驗(yàn)證：用一組數(shù)據(jù)驗(yàn)證其采用TSA與BCB染色相結(jié)合的方法的有 效性。
[0038] 將TSA與BCB染色相結(jié)合，能最大限度的提高卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力。
[0039] 表 1
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種提高綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的方法，其特征在于：分步實(shí)施； 步驟1將染色分離獲取的質(zhì)次BCB-卵母細(xì)胞，用成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，按25-30枚/ 滴，放入前2h平衡好的體積為55-78 yl/滴的成熟培養(yǎng)液中，放入C02箱，在5% C02、95%的 空氣條件下培養(yǎng)； 步驟2將步驟1體外成熟23-25h的卵母細(xì)胞取出，用0. 1%的透明質(zhì)酸酶處理30-60s， 經(jīng)吹吸，脫去卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞；用體外受精液洗滌2-4次，按25-30枚/滴的密度 加入前2h平衡好的50-70 ill的體外受精液滴內(nèi)；水浴解凍精液，移入前2h平衡好的裝有 體外受精液的試管，放入C02箱，上游20-25min，取上清，在1500rpm條件下，離心4-5min， 棄去上清液，將剩余的精子沉淀，按2-4X 106個(gè)/ml的密度加入體外受精液滴，與處理好的 卵母細(xì)胞共同孵育； 步驟3將步驟2受精20-23h的卵取出，移至平衡好的含有TSA的體外培養(yǎng)液內(nèi)，經(jīng) 吹吸，脫去卵丘細(xì)胞及黏附卵上的精子，洗滌3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的 500 yl/孔的含有TSA的體外培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)10h，再用不含TSA的體外培養(yǎng)液洗滌2-3次， 放置于不含TSA的體外培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)7d，統(tǒng)計(jì)囊胚率； 其中BCB-卵母細(xì)胞的獲?。赫≡讱?0min內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在30-35°C，含 1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3h內(nèi)用生理鹽水清洗3-4次，用吸有 lml抽卵液，帶有9號(hào)針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8_的卵泡，將注射器內(nèi)回收的卵 泡液打在35-60mm的皿內(nèi)，在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣?xì)胞，放入添加濃度為25-30 y Mol/L的BCB 染色液，置于35-39°C水浴中染色80-90min，在顯微鏡下將BCB+和BCB-卵母細(xì)胞分離，其 中將染色分離的BCB+卵母細(xì)胞，用成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)至24h，直接利用； 步驟4實(shí)驗(yàn)液體的配制： 抽卵液：TCM199hepes+lmg/ml PVA+0. 7 mg / ml 肝素納； 亮甲酚藍(lán)染色液：PBS+26 ii Mol/L亮甲酚藍(lán)+ 5mg/ml BSA ; 成熟培養(yǎng)液：TCM199H⑶3+10%FBS+0. 05IU/ml FSH+0. 05IU/ml LH+1 ii g/ml estradiol+24. 2 u g/ml 丙麗酸納 +0? ImM/L 半胱;氛酸 +10ng/ml EGF+lOOIU/ml 雙抗； SOF :6. 29mg/ml NaCL +0? 534 mg/ml KCL+0. 162 mg/ml KH2P04+0. 6 ii 1/ml 乳酸鈉 +0? 089mg/ml MgS04+2. lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸鈉 +0? 299mg/mlCaCL2 ? 2H20 ; 體外受精液：S0F+20%FBS +6IU/ml肝素鈉+100IU/ml硫酸慶大霉素； 體外培養(yǎng)液：S0F+3mg/mlBSA ; 含 TSA 體外培養(yǎng)液：S0F+200nMol/L TSA+ 3mg/mlBSA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：顯微鏡檢測(cè)卵母細(xì)胞質(zhì)量，細(xì)胞質(zhì)不著藍(lán)色 的BCB-卵母細(xì)胞質(zhì)量顯著低于胞質(zhì)著藍(lán)色的BCB+卵母細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：試驗(yàn)選用的TCM199hepeS、PVA、肝素鈉、亮甲 酚藍(lán)、PBS、BSA、FBS、FSH、LH、estradiol、EGF、半胱氨酸、TSA 均購(gòu)自 SIGMA 公司、雙抗購(gòu) 自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。
【文檔編號(hào)】C12N5/075GK104342400SQ201410289845
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】黃俊成, 汪立芹, 楊楠, 林嘉鵬, 吳陽(yáng)升, 趙云程 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國(guó)-澳大利亞綿羊育種研究中心