快速檢測hla-b*1502等位基因的引物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種快速檢測HLA-B*1502基因的引物、含有該引物的試劑盒以及采用該引物和試劑盒快速檢測HLA-B*1502基因的方法。本發(fā)明使用了HLA-B*1502基因的特異性引物，且采用多重引物的組合設(shè)計，完全覆蓋了HLA-B*1502基因的SNP位點，增強了特異性的結(jié)合，更加有效地防止了假陽性的產(chǎn)生。此外，本發(fā)明將特異性引物，dNTPs，PCR緩沖液和染料預(yù)先混合，大大節(jié)省了操作時間和工作量，具有快速、簡便、準確、直觀的特點，在3小時內(nèi)即可完成整個基因的篩查和分型實驗，解決了HLA-B*1502基因用于抗癲癇類等藥物安全性用藥指導(dǎo)的問題。
【專利說明】快速檢測HLA-B*1502等位基因的引物、試劑盒及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及快速檢測HLA-B*1502等位基因的引物、 試劑盒及方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 癲癇是一種古老的神經(jīng)系統(tǒng)常見病，嚴重危害著人類的健康。我國約有900多萬 癲癇患者，其中600萬病人每年仍有發(fā)作，而且每年還會出現(xiàn)60萬新發(fā)病例?？R西平 (CBZ)、苯妥英鈉（PHT)、拉莫三嗪（LTG)、奧卡西平（0XC)和苯巴比妥（PB)是常見的芳香族 抗癲癇藥物（AEDs)。這些藥物廣泛應(yīng)用于臨床且能有效地控制癲癇發(fā)作與神經(jīng)痛，但是同 時他們也會導(dǎo)致皮膚型藥物不良反應(yīng)（cADRs)。
[0003] 隨著人類基因組學(xué)和藥物基因組學(xué)研究的不斷深入，一些藥物所致嚴重皮膚反應(yīng) 與人類白細胞抗原HLA基因的關(guān)系得到了確認。HLA基因位于人體第6號染色體，是一群緊 密連鎖的復(fù)等位基因，包括100多個基因座位，已發(fā)現(xiàn)9000多個等位基因，全長3600kb，占 人類整個基因組的1/3000。HLA是調(diào)控人體特異性免疫應(yīng)答和決定疾病易感性個體差異的 主要基因系統(tǒng)。在不同的種族或同一種族不同群體中的分布顯示明顯的特異性。
[0004] 經(jīng)過研究，抗癲癇藥物引起的皮膚不良反應(yīng)的基因相關(guān)性得到了逐步揭示，其中 HLA-B*1502與CBZ-SJS/TEN的強相關(guān)性業(yè)已得到確認。因此，美國FDA已做出相關(guān)警告，建 議服用卡馬西平前進行HLA-B*1502基因分型檢測。英國藥品和健康產(chǎn)品管理局（MHRA)亦 發(fā)布了相關(guān)使用警告。
[0005] 目前檢測HLA-B*1502的主要方法為PCR-SBT (基于測序分型的聚合酶鏈反應(yīng)）、 PCR-SSP(序列特異引物引導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)）、PCR-SS0 (序列特異性寡核苷酸探針雜交聚 合酶鏈反應(yīng)）和RT-PCR(熒光定量PCR反應(yīng)）等檢測方法。其中PCR-SBT方法是對HLA基 因的B位點進行測序，進而確定HLA-B*1502高分辨率的方法，但其檢測的步驟繁瑣，費用昂 貴并且周轉(zhuǎn)時間較長（大于1天），不適合對于用藥安全性的快速指導(dǎo)。RT-PCR的檢測方 法需要特定的儀器，且試劑、耗材較貴，而且需要制備標準品，對實驗環(huán)境要求高。PCR-SSP 方法是利用與HLA等位基因序列互補的引物，對待測樣本DNA進行特異性PCR擴增，具有成 本低，時間短的特性。雖然，總的來說PCR-SSP是一種相對簡單方便、特異性高的方法，且目 前已有基于PCR-SSP方法進行單特異引物檢測HLA-B*1502的試劑盒，但目前市面上的試劑 盒涵蓋的基因型別較少，容易出現(xiàn)假陽性，遠遠不能滿足對用藥安全性的快速、簡便、高特 異性檢測HLA-B*1502基因的需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，基于最新的HLA數(shù)據(jù)庫，考慮不同引物 設(shè)計的位置、序列、涵蓋的等位基因數(shù)量等因素，并應(yīng)用單管多重PCR反應(yīng)體系，通過兩個 反應(yīng)即實現(xiàn)了基因型別的檢測，從而提供了一種快速，簡便、高特異性、易標準化地定性檢 測HLA-B*1502基因的PCR-SSP方法。
[0007] 為此，本發(fā)明一方面提供了一種快速檢測HLA_B*1502基因的引物，其包含SEQ ID NO. 1-4所示的檢測引物EPR) 1、EPRO1、EPF02和EPR02，所述四種引物分別組成引物組P1和 P2,其中 P1 組為 EPR)1-EPR01-EPF02-EPR02, P2 組為 EPR)1-EPR02-EPF02-EPR01。
[0008] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，該引物還進一步包含SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所 示的內(nèi)對照引物NCXF和NCXR。
[0009] 本發(fā)明另一方面提供了 一種快速檢測HLA-B* 1502基因的試劑盒，其包含PCR反應(yīng) 混合液和Taq酶，所述PCR反應(yīng)混合液中分別包含如上所述的引物組P1和P2,所述Taq酶 的濃度優(yōu)選為5U/yL。
[0010] 在本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒中快速檢測HLA-B*1502基因的引物 EPR)1、EPR01、EPF02 和 EPR02 的濃度均為 0· 5 μ M。
[0011] 在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒的PCR反應(yīng)混合液中進一步包含如上 所述的內(nèi)對照引物。
[0012] 在本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒中內(nèi)對照引物NCXF和NCXR的濃度均 為 0· 2 μ M。
[0013] 在本發(fā)明再一優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒的PCR反應(yīng)混合液中進一步包含 dNTPs，染料和PCR緩沖液，染料進一步優(yōu)選為甲酚紅。
[0014] 在本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒中dNTPs濃度為0. 2mM，染料濃度為 0. 01 %，PCR緩沖液組成為：Tris-HCL濃度10mM，氯化鉀濃度50mM，氯化鎂濃度1. 5mM，明膠 濃度 0. 001%。
[0015] 本發(fā)明另一方面提供了一種快速檢測HLA-B*1502基因的方法，其包含以下步驟：
[0016] 1、提取待檢測樣品的DNA溶液；
[0017] 2、采用如上所述的引物或采用如上所述的試劑盒，以步驟1中提取的DNA溶液作 為模板，進行PCR擴增；
[0018] 3、PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，進行結(jié)果判讀，當內(nèi)對照條帶和HLA_B*1502基因條帶 同時出現(xiàn)時，表明該基因為HLA-B*1502基因陽性，而只出現(xiàn)內(nèi)對照條帶時，則表明該基因 為HLA-B*1502基因陰性
[0019] 本發(fā)明再一方面提供了如上所述的引物或如上所述的試劑盒在快速檢測 HLA-B*1502基因中的應(yīng)用。
[0020] 由上述描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明基于PCR-SSP技術(shù)開發(fā)的HLA-B*1502 基因篩查試劑盒，由于使用了特異性引物，且采用多重引物的組合設(shè)計，完全覆蓋了 HLA-B*1502基因的SNP位點，增強了特異性的結(jié)合，更加有效地防止了假陽性的產(chǎn)生，具 有快速、簡便、準確、直觀的特點，并且實驗成本低，僅需微量檢材即可完成實驗檢測所需。 同時，本發(fā)明的檢測試劑盒可以很直觀地根據(jù)PCR擴增后電泳條帶的有無情況，即可判斷 HLA-B*1502的等位基因型，從而完成HLA-B*1502的快速篩查。
[0021] 此外，本發(fā)明將引物，dNTPs，PCR緩沖液和染料預(yù)先混合，可大大節(jié)省實驗者的操 作時間和工作量。并且，本發(fā)明將等位基因的多對引物混合，完成同時擴增，實現(xiàn)了兩個PCR 反應(yīng)即可完成等位基因的分型，滿足了高通量的實驗需求，直接得出分型和篩查結(jié)果，具有 靈敏、穩(wěn)定、準確、高效的特點。在擁有合格DNA樣品的情況下，本發(fā)明在3小時內(nèi)即可完成 整個基因篩查和分型實驗，解決了 HLA-B*1502基因用于抗癲癇類藥物安全性用藥指導(dǎo)的 問題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1 :檢測樣品的凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0023] 下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本 發(fā)明。應(yīng)當指出，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā) 明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0024] 實施例1 :快速檢測HLA_B*1502基因的引物設(shè)計
[0025] PCR引物設(shè)計所需要的所有HLA等位基因的數(shù)據(jù)來源于MGT/HLADatabase (R elease3. 15. 0, 2014-01-17)，具體網(wǎng)址為：http ://www. ebi. nc. uk/ipd/imgt/hla/。引 物設(shè)計采用人工方法，設(shè)計的引物在IMGT數(shù)據(jù)庫中進行比對，確認該引物能特異性結(jié)合 HLA-B*1502等位基因。在引物設(shè)計過程中，關(guān)鍵是使設(shè)計的引物在特定的PCR緩沖體系環(huán) 境下，能夠特異地擴增HLA-B*1502基因，即該引物為一種"具有序列特異性的SSP"。
[0026] 為了采用特異性的PCR-SSP對HLA-B*1502基因進行篩查，在HLA-B*1502基因 的SNP位點區(qū)域分別設(shè)計了特異性引物EPF01(SEQ ID N0. 1)、引物EPR01(SEQ ID N0. 2)、 引物EPR)2 (SEQ ID NO. 3)和引物EPR02 (SEQ ID NO. 4)，4個引物分別組合為P1和P2兩 組，以防止HLA-B*1502基因的漏檢，其中PI組為EPF01-EPR01-EPF02-EPR02, P2組為 EPFO1-EPR02-EPF02-EPR01〇
[0027] 同時，對下游引物的3'端引入了錯配堿基的特異性設(shè)計，以增強引物擴增的特異 性。
[0028] 為了保證反應(yīng)體系的正常進行，還設(shè)計了一對上下游引物NCXF(SEQ ID N0. 5)和 NCXR (SEQ ID NO. 6)，作為內(nèi)對照引物。
[0029] 具體設(shè)計的引物情況如表1所示。
[0030] 表1.快速檢測HLA-B*1502基因的引物
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測HLA-B*1502基因的引物，其包含SEQ ID NO. 1-4所示的檢測引 物EPTO1、EPR01、EPF02和EPR02，所述四種引物分別組成引物組P1和P2，其中P1組為 EPF01-EPR01-EPF02-EPR02, P2 組為 EPF01-EPR02-EPF02-EPR01。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其進一步包含SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的內(nèi)對 照引物NCXF和NCXR。
3. -種快速檢測HLA_B*1502基因的試劑盒，其包含PCR反應(yīng)混合液和Taq酶，所述PCR 反應(yīng)混合液分別包含權(quán)利要求1所述的引物組P1和P2,所述Taq酶的濃度優(yōu)選為5U/μ L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中快速檢測HLA-B* 1502基因的引物EPTO1、 EPR01、EPF02 和 EPR02 的濃度均為 0. 5 μ Μ。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其中PCR反應(yīng)混合液中進一步包含權(quán)利要求2 所述的內(nèi)對照引物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中內(nèi)對照引物NCXF和NCXR的濃度均為0. 2 μ M。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3至6任一項所述的試劑盒，其中PCR反應(yīng)混合液中進一步包含 dNTPs，染料和PCR緩沖液，染料優(yōu)選為甲酚紅。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中dNTPs濃度為0. 2mM，染料濃度為0. 01 %，PCR緩 沖液組成為：Tris-HCL濃度10mM，氯化鉀濃度50mM，氯化鎂濃度1. 5mM，明膠濃度0. 001 %。
9. 一種快速檢測HLA-B*1502基因的方法，其包含以下步驟： (1) 提取待檢測樣品的DNA溶液， (2) 采用權(quán)利要求1或2所述的引物，或采用權(quán)利要求3至8中任一項所述的試劑盒， 以步驟⑴中提取的DNA溶液作為模板，進行PCR擴增； (3) PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，進行結(jié)果判讀，當內(nèi)對照條帶和HLA-B*1502基因條帶同 時出現(xiàn)時，表明該基因為HLA-B*1502基因陽性，而只出現(xiàn)內(nèi)對照條帶時，則表明該基因為 HLA-B*1502基因陰性。
10. 權(quán)利要求1或2所述的引物，或者權(quán)利要求3至8中任一項所述的試劑盒在快速檢 測HLA-B*1502基因中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104046696SQ201410293464
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】鄭仲征, 潘捷, 謝志聰 申請人:上海荻碩貝肯生物科技有限公司