一種去除糜蛋白酶中的內毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種去除糜蛋白酶中的內毒素的方法。該方法包括下述步驟：將糜蛋白酶濾餅溶解于水中，超濾濃縮得到濃縮液，依次加入磷酸鹽水溶液和鈣鹽水溶液，調節(jié)pH值為8～9，離心，即可。本發(fā)明的在糜蛋白酶生產(chǎn)過程中去除內毒素的方法，在不影響糜蛋白酶活性、收率的前提下，有效地去除糜蛋白酶生產(chǎn)中含有的內毒素污染物，目前已經(jīng)應用于糜蛋白酶原料藥生產(chǎn)，內毒素含量符合2010版中國藥典要求。
【專利說明】一種去除糜蛋白酶中的內毒素的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領域，具體涉及一種去除糜蛋白酶中的內毒素的方法。
【背景技術】
[0002]糜蛋白酶作為一類肽鏈內切酶，其在創(chuàng)傷手術后愈合、抗炎、眼科手術等方面被廣泛應用；同時作為一種肌內注射藥品，為保障其臨床應用安全性，2010版藥典規(guī)定每I單位糜蛋白酶中含內毒素的量應小于0.075EU。內毒素產(chǎn)生于革蘭氏陰性細菌的細胞外壁，其主要成份是脂多糖(LPS)及類脂A，是熱原的活性部分。它們的相對分子質量一般為I萬~
2.5萬，在水溶液中形成締合體，相對分子質量可達50萬~100萬。其具有耐熱性和化學穩(wěn)定性，不易被除滅。注入人體的注射劑中含有熱原量達I μ g/kg就可引起不良反應，發(fā)熱反應通常在注入1小時后出現(xiàn)，可使人體產(chǎn)生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時體溫可升至40°C以上，嚴重者甚至昏迷、虛脫，如不及時搶救，可危及生命。因此，在生物制品生產(chǎn)過程中，需要有嚴格的工藝控制策略對內毒素進行去除或限量控制。
[0003]目前，水溶液中常用的內毒素去除方法主要有如下幾種:
[0004]1、超濾 [0005]內毒素具有較大的相對分子質量，因此，可選用超濾膜去除水中的內毒素。在使用超濾方法去除內毒素時需要根據(jù)被處理藥物的相對分子質量、特性選擇超濾膜的孔徑及材質，因此該方法不具備通用性。另外，內毒素并不以單一分子存在，而是以相對分子質量不等的集聚體存在，因此大小不一，這也給超濾法去除內毒素帶來了挑戰(zhàn)。
[0006]2、活性炭吸附法
[0007]活性炭吸附是一種較早用于內毒素去除的方法，但是，由于活性炭選擇性差，在吸附內毒素的同時吸附有效活性成分，影響產(chǎn)品收率。
[0008]3、化學降解法
[0009]化學降解法是指用強酸、強堿或氧化劑等使內毒素降解以達到去除內毒素的目的，這種方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，該方法的使用需結合產(chǎn)品的理化性質。
[0010]4、離子交換色譜法
[0011]離子交換色譜法是根據(jù)內毒素帶有部分負電荷的性質，用陰離子交換色譜來去除內毒素，但這種方法不適合于溶液中存在其它帶負電荷物質的情況。
[0012]蛋白質種類較多，其分離純化步驟各不相同，不同終產(chǎn)品對內毒素含量要求也有差異，因此，去除內毒素的方法和效果無法完全通用。糜蛋白酶作為一種活性蛋白酶類藥物，其具有易失活、不穩(wěn)定的特點，在內毒素去除過程中保證其本身性質及有效活性成分不受影響至關重要，這也是本領域長期以來存在的、難以克服的技術難題。在糜蛋白酶內毒素去除方法選擇過程中，超濾法因糜蛋白酶分子量較大而無法應用，活性炭吸附法專一性不強，化學降解法極易造成糜蛋白酶失活，色譜法耗時較長，不利于糜蛋白酶穩(wěn)定。
【發(fā)明內容】

[0013]本發(fā)明所要解決的技術問題在于為了克服現(xiàn)有技術中糜蛋白酶中的內毒素無法去除徹底、易造成糜蛋白酶失活、耗時較長的缺陷，而提供了一種去除糜蛋白酶中的內毒素的方法。本發(fā)明的方法將超濾與磷酸鈣沉淀聯(lián)合使用，可以有效除去內毒素，且不會影響糜蛋白酶的活性，適用于大規(guī)模條件下除去蛋白質中的內毒素。
[0014]本發(fā)明是通過以下技術方案解決上述技術問題的:
[0015]本發(fā)明提供了一種去除糜蛋白酶中的內毒素的方法，其包括下述步驟:將糜蛋白酶濾餅溶解于水中，超濾濃縮得到濃縮液，依次加入磷酸鹽水溶液和鈣鹽水溶液，調節(jié)PH值為8~9,離心，即可。
[0016]其中，所述的糜蛋白酶濾餅可為本領域常規(guī)的糜蛋白酶處理方法得到的糜蛋白酶濾餅，一般經(jīng)過多步鹽析、結晶、過濾、活化、鹽析得到，較佳地通過下述步驟得到:將糜蛋白酶原料用水溶解，加入硫酸調節(jié)pH值為2~3，加入飽和硫酸銨溶液鹽析，加入磷酸緩沖液調節(jié)pH值為7.5~7.7，再加入胰蛋白酶進行活化，用硫酸調節(jié)pH值為3.5~4.5，加入固體硫酸銨進行鹽析，即得到糜蛋白酶濾餅。
[0017]所述的糜蛋白酶濾餅更佳地通過下述步驟制得:在糜蛋白酶原料中加入7倍量(v/w)純化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液調節(jié)pH值為2.8~3.2，攪拌，放置過夜，加
2.5mol/L H2SO4溶液調pH值為2.5~2.7，再加2倍量(v/w)飽和硫酸銨溶液攪拌均勻，再用5mol/L NaOH溶液調pH值為4.9~5.1，置25°C恒溫箱，保溫48小時，布氏漏斗過濾，收集濾餅，濾液棄去，過濾所得濾餅，用3倍量(v/w)純化水溶解后，以I倍量(v/w)飽和硫酸銨鹽析，25°C保溫24小時，反復3次，后二次濾出母液，收集待用，濾餅待活化；將以上結晶后過濾的濾餅加入3倍量(v/w)純化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液90ml助溶，待完全溶解后，布氏漏斗過濾，收集濾液，用2.5mol/L H2SO4溶液調濾液pH值至2.8~3.1 ;加5mol/LNaOH溶液調pH為7.4~7.7，再加入I倍量(v/w濾餅重)0.5mol/L、pH7.6的磷酸緩沖液，攪拌均勻得結晶物溶液，再按胰蛋白酶:結晶物溶液=5mg: 100mL的比例加入胰蛋白酶，置4°C冰箱中活化72小時，pH控制在7.6 ;將以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液調pH值為
3.9~4.1，測活化液體積，按500g/L加入固體硫酸銨進行鹽析，放置過夜，次日布氏漏斗過濾，棄濾液，即得糜蛋白酶濾餅。
[0018]其中，所述的水與所述的糜蛋白酶濾餅的體積質量比較佳地為8~12ml/g。
[0019]其中，所述的超濾濃縮采用的超濾膜較佳地為德國賽多利斯公司的Hydrosart超濾膜，截留相對分子質量是5kDa或lOkDa。
[0020]其中，所述的超濾濃縮得到的濃縮液的體積較佳地為超濾濃縮前體積的0.1~
0.3 倍。
[0021]其中，所述的磷酸鹽可為本領域常規(guī)的可溶于水的各種磷酸鹽，較佳地為磷酸鈉和/或磷酸鉀。
[0022]其中，所述的鈣鹽可為本領域常規(guī)的可溶于水的各種鈣鹽，較佳地為醋酸鈣和/或氯化鈣。
[0023]其中，所述的磷酸鹽水溶液與所述的濃縮液的體積比較佳地為(0.1~0.2):1。
[0024]其中，所述的鈣鹽水溶液與所述的磷酸鹽水溶液的體積比較佳地為(0.5~0.7):
1[0025]其中，所述的磷酸鹽水溶液的濃度較佳地為0.2~0.5mol/L。
[0026]其中，所述的鈣鹽水溶液的濃度較佳地為0.8~1.5mol/L。
[0027]其中，所述的磷酸鹽與所述的鈣鹽的摩爾比較佳地為1:(0.5~2)，更佳地為1:
1.5。
[0028]其中，所述的離心的轉速較佳地為3000~4000rpm。
[0029]其中，所述的離心較佳地為冷凍離心10~30min，冷凍離心的溫度較佳地為4~10。。。
[0030]其中，所述的離心結束后還可進行后處理；所述的后處理包括下述步驟:透析，加入硅藻土，過濾，凍干，即得成品。所述的透析的溫度較佳地為3~5°C。
[0031]在符合本領域常識 的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
[0032]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0033]本發(fā)明的積極進步效果在于:
[0034](I)本發(fā)明先通過超濾方法大大減少了糜蛋白酶操作體積，同時，使糜蛋白酶溶液中內毒素得到富集，有利于后續(xù)磷酸鈣沉淀內毒素及透析、凍干，提高生產(chǎn)效率。
[0035](2)在磷酸鈣沉淀糜蛋白酶中的內毒素技術方案中，磷酸鹽與鈣鹽的摩爾比為1:1.5時恰好完全反應生成磷酸鈣沉淀，用以吸附內毒素，后續(xù)經(jīng)離心操作除去沉淀復合物。過量的磷酸鹽或鈣鹽溶液不利于糜蛋白酶穩(wěn)定性，并且會影響后續(xù)終產(chǎn)品質量符合標準(如熾灼殘渣)。整個磷酸鈣沉淀內毒素操作工序耗時30-60分鐘，極大降低了對糜蛋白酶活性的影響。
[0036](3)本發(fā)明的在糜蛋白酶生產(chǎn)過程中去除內毒素的方法，在不影響糜蛋白酶活性、收率的前提下，有效地去除糜蛋白酶生產(chǎn)中含有的內毒素污染物，目前已經(jīng)應用于糜蛋白酶原料藥生產(chǎn)，內毒素含量符合2010版中國藥典要求。
【具體實施方式】
[0037]下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0038]實施例1
[0039]糜蛋白酶原料批號091269，產(chǎn)自內蒙古集寧牛羊臟器加工部，糜蛋白酶糜原是新鮮牛胰臟經(jīng)硫酸浸泡、絞碎、鹽析結晶所得，其純度(質量百分比)不應低于30%。糜蛋白酶原料投料llOOg，加7倍量(v/w)純化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml調節(jié)pH為
3.0，攪拌8小時后，放置過夜。次日攪拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液調pH為2.6，再加2倍量(v/w)飽和硫酸銨溶液攪拌均勻，再用5mol/L NaOH溶液調pH為5.0，置25°C恒溫箱，保溫48小時，布氏漏斗過濾，收集濾餅，濾液棄去。過濾所得濾餅，用3倍量(v/w)純化水溶解后，以I倍量(v/w)飽和硫酸銨鹽析，25°C恒溫保溫24小時，反復3次，后二次濾出母液，收集待用，濾餅待活化。將以上結晶后過濾的濾餅置于不銹鋼桶內，加入3倍量(v/w)純化水，并加2.5mol/LH2S04溶液90ml助溶。待完全溶解后，布氏漏斗過濾，收集濾液，用2.5mol/LH2SO4溶液調濾液pH至3.0，攪拌3小時。[0040]加5mol/L NaOH溶液調pH為7.6，再加入I倍量(v/w濾餅重)0.5mol/L、pH為7.6的磷酸緩沖液，攪拌均勻得結晶物溶液，測PH為7.6，再按比例(胰蛋白酶:結晶物溶液=5mg: 100ml)加入胰蛋白酶，置4°C冰箱中活化72小時，活化第二天應注意其pH值，pH控制在7.6。
[0041]將以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液調pH為3.9，測活化液體積，按500g/L加入固體硫酸銨進行鹽析，放置過夜，次日布氏漏斗過濾，棄濾液，收集濾餅1648g,加純化水16500ml溶解,過濾,收集濾液。用IOkD的超濾膜(型號:Hydrosart德國賽多利斯公司)進行超濾濃縮，超濾后溶液體積為2400ml。緩慢加入240ml0.4mol/L的4°C磷酸三鈉溶液，攪拌，再緩慢加入144mllmol/L的4°C醋酸鈣溶液，攪拌，用2.5M NaOH調節(jié)pH至8.51，攪拌10分鐘后用3000轉/分的轉速4°C離心20分鐘，后續(xù)溶液扎包，約100mL/包，4°C左右透析3天，每12小時換水一次(水溫控制在4°C左右)。
[0042]收集、合并透析液，加100g硅藻土，過濾，量取濾液體積，用折疊式過濾器(0.22 μ m孔徑濾膜、德國賽多利斯公司)過濾，調節(jié)pH為6.0，濾液裝盤(1000ml/盤)，送凍干機(上海東富龍科技股份有限公司)凍干得糜蛋白酶成品110201。
[0043]實施例2 [0044]糜蛋白酶原料批號091270，產(chǎn)自內蒙古集寧牛羊臟器加工部，糜蛋白酶糜原是新鮮牛胰臟經(jīng)硫酸浸泡、絞碎、鹽析結晶所得，其質量百分比純度不應低于30%。糜蛋白酶原料投料llOOg，加7倍量(v/w)純化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml調節(jié)pH為3.1，攪拌8小時后，放置過夜。次日攪拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液調pH為2.5，再加2倍量(v/w)飽和硫酸銨溶液攪拌均勻，再用5mol/L NaOH溶液調pH為4.9，置25°C恒溫箱，保溫48小時，布氏漏斗過濾，收集濾餅，濾液棄去。過濾所得濾餅，用3倍量(v/w)純化水溶解后，以I倍量(v/w)飽和硫酸銨鹽析，25°C恒溫保溫24小時，反復3次，后二次濾出母液，收集待用，濾餅待活化。將以上結晶后過濾的濾餅置于不銹鋼桶內，加入3倍量(v/w)純化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液IlOml助溶。待完全溶解后，布氏漏斗過濾，收集濾液，用2.5mol/L H2SO4溶液調濾液pH至2.9，攪拌3小時。
[0045]加5mol/L NaOH溶液調pH為7.6，再加入I倍量(v/w濾餅重)0.5mol/L、pH為7.6的磷酸緩沖液，攪拌均勻得結晶物溶液，測PH為7.6，再按比例(胰蛋白酶:結晶物溶液=5mg: 100ml)加入胰蛋白酶，置4°C冰箱中活化72小時，活化第二天應注意其pH值，pH控制在7.6。
[0046]將以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液調pH為4.1，測活化液體積，按500g/L加入固體硫酸銨進行鹽析，放置過夜，次日布氏漏斗過濾，棄濾液，收集濾餅1895g,加純化水18950ml溶解，過濾，收集濾液。用5kD的超濾膜(型號:HydroSart德國賽多利斯公司)進行超濾濃縮，超濾后溶液體積為2800ml。緩慢加入300ml0.4mol/L的4°C磷酸三鈉溶液，攪拌，再緩慢加入180mllmol/L的4°C醋酸鈣溶液，攪拌，用2.5M NaOH調節(jié)pH至8.00，攪拌10分鐘后用3000轉/分的轉速冷凍離心20分鐘，后續(xù)溶液扎包，約100mL/包，4°C左右透析3天，每12小時換水一次(水溫控制在4°C左右)。
[0047]收集、合并透析液，加100g硅藻土，過濾，量取濾液體積，用折疊式過濾器(0.22 μ m孔徑濾膜、德國賽多利斯公司)過濾，調節(jié)pH為6.0，濾液裝盤(1000ml/盤)，送凍干機(上海東富龍科技股份有限公司)凍干得糜蛋白酶成品110202。[0048]實施例3
[0049]糜蛋白酶原料批號091271，產(chǎn)自內蒙古集寧牛羊臟器加工部，糜蛋白酶糜原是新鮮牛胰臟經(jīng)硫酸浸泡、絞碎、鹽析結晶所得，其質量百分比純度不應低于30%。糜蛋白酶原料投料llOOg，加7倍量(v/w)純化水溶解，并加2.5mol/L H2SO4溶液290ml調節(jié)pH為2.9，攪拌8小時后，放置過夜。次日攪拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液調pH為2.5，再加2倍量(v/w)飽和硫酸銨溶液攪拌均勻，再用5mol/L NaOH溶液調pH為5.0，置25°C恒溫箱，保溫48小時，布氏漏斗過濾，收集濾餅，濾液棄去。過濾所得濾餅，用3倍量(v/w)純化水溶解后，以I倍量(v/w)飽和硫酸銨鹽析，25°C恒溫保溫24小時，反復3次，后二次濾出母液，收集待用，濾餅待活化。將以上結晶后過濾的濾餅置于不銹鋼桶內，加入3倍量(v/w)純化水，并加2.5mol/L H2SO4溶液100mL助溶。待完全溶解后，布氏漏斗過濾，收集濾液，用2.5mol/L H2SO4溶液調濾液pH至2.9，攪拌3小時。
[0050]加5mol/L NaOH溶液調pH為7.6，再加入I倍量(v/w濾餅重)0.5mol/L、pH為7.6的磷酸緩沖液，攪拌均勻得結晶物溶液，測PH為7.6，再按比例(胰蛋白酶:結晶物溶液=5mg: 100ml)加入胰蛋白酶，置4°C冰箱中活化72小時，活化第二天應注意其pH值，pH控制在7.6。
[0051]將以上活化液用2.5mol/L H2SO4溶液調pH為4.1，測活化液體積，按500g/L加入固體硫酸銨進行鹽析，放置過夜，次日布氏漏斗過濾，棄濾液，收集濾餅1850g,加純化水18000ml溶解，過濾，收集濾液。用IOkD的超濾膜(型號=Hydrosart賽多利斯、德國賽多利斯公司)進行超濾濃縮，超濾后溶液體積為2500ml。緩慢加入480ml0.4mol/L的4°C磷酸三鈉溶液，攪拌，再緩慢加入288ml lmol/L的4°C醋酸鈣溶液，攪拌，用2.5M NaOH調節(jié)pH至
9.00，攪拌10分鐘后 用3000轉/分的轉速冷凍離心20分鐘，后續(xù)溶液扎包，約100mL/包，4°C左右透析3天，每12小時換水一次(水溫控制在4°C左右)。
[0052]收集、合并透析液，加100g硅藻土，過濾，量取濾液體積，用折疊式過濾器(0.22 μ m孔徑濾膜、德國賽多利斯公司)過濾，調節(jié)pH為6.0，濾液裝盤(1000ml/盤)，送凍干機(上海東富龍科技股份有限公司)凍干得糜蛋白酶成品110203。
[0053]實施例4
[0054]實施例1~3中的三批次糜蛋白酶內毒素檢測均按照2010版中國藥典二部XIE “細菌內毒素檢查法”。即采用鱟試劑法來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的含量是否符合規(guī)定，檢測結果如下表1所示，其中陰性對照品為注射用水，陽性對照品為內毒素標準品(購于中國食品藥品檢定研究院)。
[0055]表1三批糜蛋白酶成品內毒素檢測結果
【權利要求】
1.一種去除糜蛋白酶中的內毒素的方法，其包括下述步驟:將糜蛋白酶濾餅溶解于水中，超濾濃縮得到濃縮液，依次加入磷酸鹽水溶液和鈣鹽水溶液，調節(jié)PH值為8~9，離心，即可。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的糜蛋白酶濾餅通過下述步驟得到:將糜蛋白酶原料用水溶解，加入硫酸調節(jié)PH值為2~3，加入飽和硫酸銨溶液鹽析，加入磷酸緩沖液調節(jié)pH值為7.5~7.7，再加入胰蛋白酶進行活化，用硫酸調節(jié)pH值為3.5~4.5，加入固體硫酸銨進行鹽析，即得到糜蛋白酶濾餅。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水與所述的糜蛋白酶濾餅的體積質量比為8~12ml/g ； 和/或，所述的超濾濃縮采用的超濾膜為德國賽多利斯公司的Hydrosart超濾膜，截留相對分子質量是5kDa或IOkDa ； 和/或，所述的超濾濃縮得到的濃縮液的體積為超濾濃縮前體積的0.1~0.3倍。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽為磷酸鈉和/或磷酸鉀； 和/或，所述的鈣鹽為醋酸鈣和/或氯化鈣。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽水溶液與所述的濃縮液的體積比為(0.1~0.2):1 ； 和/或，所述的鈣鹽水溶液與所述的磷酸鹽水溶液的體積比為(0.5~0.7):1。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽水溶液的濃度為0.2~0.5mol/L； 和/或，所述的鈣鹽水溶液的濃度為0.8~1.5mol/L。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽與所述的鈣鹽的摩爾比為1:(0.5 ~2)。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽與所述的鈣鹽的摩爾比為1:1.5。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心的轉速為3000~4000rpm。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心為冷凍離心10~30min;所述的冷凍離心的溫度較佳地為4~10°C。
【文檔編號】C12N9/76GK104017793SQ201410294578
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權日:2014年6月26日
【發(fā)明者】黃臻輝, 周建華, 周偉潔, 琚姝, 王克平 申請人:上海第一生化藥業(yè)有限公司