一種提取線粒體中多聚核糖體的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取線粒體中多聚核糖體的方法及其應(yīng)用。提取線粒體中多聚核糖體的方法包括如下步驟：用線粒體提取緩沖液提取靶細胞的線粒體；再核糖體提取緩沖液裂解得到線粒體核糖體懸液；線粒體核糖體懸液分兩等份，其中一份用RNA酶處理，另外一份不做處理作為對照；配制10-30%蔗糖密度梯度，平衡后將線粒體核糖體懸液鋪在蔗糖密度梯度上層，4℃180000×g離心2-4小時；從上到下收集各離心組分，提取各組分的RNA和蛋白質(zhì)進行分析確定多聚核糖體所在組分。本發(fā)明可以清楚明了的檢測到線粒體中的多聚核糖體，并且對多聚核糖體組分中的線粒體mRNA進行定量分析，得到待研究線粒體基因的翻譯水平。
【專利說明】—種提取線粒體中多聚核糖體的方法及其應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本技術(shù)涉及分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)以及生物化學(xué)，具體涉及一種提取線粒體中多聚核糖體的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]真核生物的線粒體是一種半自主細胞器，它具有自己獨特的遺傳系統(tǒng)，即線粒體雙鏈閉合環(huán)狀DNA，以及DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)。線粒體核糖體約59S，是由大亞基和小亞基組成，它功能非常專一，主要用于呼吸鏈的膜蛋白的翻譯。多聚核糖體指合成蛋白質(zhì)時，多個甚至幾十個核糖體串聯(lián)在一條mRNA上，這是真核生物保證高效翻譯的機制之一。對細胞質(zhì)中多聚核糖體的分離提取的經(jīng)典方法為蔗糖密度梯度離心方法。
[0004]核糖體和多聚核糖體的分離是鑒定翻譯機器組分和翻譯效率的經(jīng)典生物化學(xué)方法，也是研究領(lǐng)域內(nèi)認可度很高的方法，核糖體不同的沉降區(qū)段可以反映特定的信使RNA的翻譯效率以及翻譯調(diào)控因子與核糖體的相互作用。
[0005]由于線粒體的翻譯發(fā)生在內(nèi)膜上，核糖體以及相關(guān)輔助因子都與膜結(jié)構(gòu)相連，這對多聚核糖體的分離增加了難度。現(xiàn)有的成功分離提取線粒體多聚核糖體的研究并不多見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種提取線粒體中多聚核糖體的方法。
[0007]由于根據(jù)領(lǐng)域內(nèi)公認的多聚核糖體的多肽產(chǎn)生能力是核糖體單體的5-10倍，目前檢測線粒體中翻譯效率的方法不能有效分離核糖體與多聚核糖體，導(dǎo)致翻譯效率分析不能有效反映真實情況。本發(fā)明的目的還在于提供一種上述方法在分析線粒體中基因翻譯水平的應(yīng)用。
[0008]一種提取線粒體中多聚核糖體的方法，包含如下步驟:
(I)用線粒體提取緩沖液提取靶細胞的線粒體。
[0009](2)線粒體用核糖體提取緩沖液裂解得到線粒體核糖體懸液。
[0010](3)線粒體核糖體懸液分兩等份，其中一份用RNA酶處理，另外一份不做處理作為對照。
[0011](4)配制10-30%蔗糖密度梯度，平衡后將線粒體核糖體懸液鋪在蔗糖密度梯度上MA0C 180000Xg 離心 2-4 小時。
[0012](5)從上到下收集各離心組分，提取各組分的RNA和蛋白質(zhì)，通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR分析線粒體核糖體大亞基RNA組分和小亞基RNA組分和免疫印跡檢測線粒體核糖體蛋白亞基MRPS27、MRPL24，根據(jù)用RNA酶處理的組分和未用RNA酶處理組分中MRPS27、MRPL24含量的不同來確定多聚核糖體所在組分。
[0013]步驟(1)中所述的線粒體提取緩沖液的配方優(yōu)選為:0.01Μ Tris_M0PS，0.01MEGTA/Tris，0.2M 蔗糖，pH 7.4，用 DEPC 水配制。
[0014]步驟(2)中所述的核糖體提取緩沖液的配方優(yōu)選為:260mM蔗糖，10mM KC1，20mM MgCl2, 1mM Tris pH 7.5,1% Triton X-100, 5mM β -疏基乙醇，IXRoche proteaseinhibitor。
[0015]步驟(3)中用RNA酶處理優(yōu)選為5U/y LRNA酶，25°C處理40min。
[0016]更優(yōu)選的，步驟(1)為:將靶細胞培養(yǎng)于4個15cm細胞培養(yǎng)皿中，用預(yù)冷的PBS洗2遍，將細胞刮下，4°C 200Xg離心收集到離心管中；用3mL線粒體提取緩沖液輕懸細胞沉淀，漿約100后將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，4°C 500 X g離心3min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，重復(fù)離心；收集上清于4°C 800 Xg離心5min，重復(fù)離心；收集上清于4°C18000Xg離心10min，棄上清，用預(yù)冷的線粒體提取緩沖液將沉淀懸起，于4°C 20000Xg離心5min，沉淀即為線粒體。
[0017]步驟(2)為:用500yL預(yù)冷的核糖體提取緩沖液裂解線粒體沉淀，于冰上放置20min,于4°C 9400 Xg離心45min，收集上清，即為線粒體核糖體裂解液。
[0018]上述提取線粒體中多聚核糖體的方法可用于分析線粒體中基因翻譯水平。通過本發(fā)明方法可以行之有效的區(qū)分線粒體中核糖體與多聚核糖體，通過定量PCR精確分析線粒體中核糖體與多聚核糖體的翻譯效率；亦可以通過質(zhì)譜與免疫印跡鑒定相結(jié)合分析線粒體核糖體或多聚核糖 體組分了解線粒體翻譯機器的組成以及線粒體翻譯的調(diào)節(jié)因子。
[0019]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:本發(fā)明可以清楚明了的檢測到線粒體中的多聚核糖體，并且對多聚核糖體組分中的線粒體mRNA進行定量分析，得到待研究線粒體基因的翻譯水平。與目前流行的核糖體結(jié)合mRNA高通量測序方法相比，更精確的分析了線粒體中多聚核糖體中的mRNA的翻譯效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是蔗糖密度梯度離心后對各組分進行線粒體核糖體RNA的定量PCR分析結(jié)果圖，圖中縱坐標指每個組分所占總和的百分比，總和為13個組分的總和。
[0021]圖2是蔗糖密度梯度離心后對各組分進行線粒體核糖體蛋白亞基的免疫印跡分析及核酸酶處理后多聚核糖體解聚效果的檢測結(jié)果圖，在第12、13組分為線粒體多聚核糖體。
[0022]圖3是蔗糖密度梯度離心后對各組分進行線粒體mRNA的定量PCR分析結(jié)果圖，圖中縱坐標指每個組分所占總和的百分比，總和為13個組分的總和。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述。應(yīng)理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本技術(shù)的范圍。
[0024]下述實施例中所有操作均在應(yīng)低溫下進行(即盡量在冰上進行)。
[0025]實施例1
(I) C2C12細胞線粒體的提取培養(yǎng)C2C12細胞于4個15cm細胞培養(yǎng)皿中，用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH 7.4)洗2遍，再用細胞刮輕柔的將細胞刮下，4°C 200Xg離心收集到離心管中。用約3mL線粒體提取緩沖液 IBc (0.01M Tris-MOPS, 0.01M EGTA/Tris, 0.2M 蔗糖，pH 7.4，均用 DEPC 水配制)輕懸細胞沉淀，轉(zhuǎn)移到提前預(yù)冷的勻漿器中，于冰上上下勻漿約100次。將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，4°C 500Xg離心3min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，重復(fù)離心。收集上清于4°C800 Xg離心5 min，重復(fù)離心。收集上清于4°C 18000 Xg離心10min，棄上清，用預(yù)冷的IBc將沉淀輕輕懸起，于4°C 20000 Xg離心5min,沉淀即為線粒體。
[0026]( 2 )提取線粒體核糖體
用500 μ L預(yù)冷的核糖體提取緩沖液(260mM蔗糖，10mM KCl,20mM MgCl2, 1mM Tris pH
7.5,1% Triton X-100, 5mM β -疏基乙醇，I X Roche protease inhibitor)輕輕裂解線粒體沉淀，于冰上放置20min。于4°C 9400 X g離心45min，除去膜結(jié)構(gòu)及不溶性蛋白，收集上清，即為線粒體核糖體裂解液。
[0027](3)蔗糖密度4°C梯度離心
用梯度生成儀配制8mL 10-30%蔗糖密度梯度于13mL BECKMAN離心管中，4°C平衡過夜。將約500 μ L的(2)得到的線粒體核糖體裂解液小心鋪在上層，于4°C 180000Xg離心2小時30分鐘。小心的由上到下吸取密度梯度，分成13個組分，用于提取RNA及蛋白質(zhì)。每個鹿糖梯度組分加入3倍體積的TRIZOL LS試劑(LifeTechnologies),按照標準流程提取其中的RNA和蛋白，通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR的方法比較各組分線粒體核糖體大亞基(16S)RNA組分和小亞基(12S) RNA組分的含量，初步推斷最后12、13兩個組分為線粒體多聚核糖體(見圖1)。 [0028]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄標準化流程，引物為隨機引物。
[0029]定量PCR為標準SyBr Green流程，PCR引物如下:
12S rRNA 引物:
F: CAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT, R: GAGGGTGACGGGCGGTGTGT ；
16S rRNA 引物:
F:ACCGCAAGGGAAAGATGAAA, R: GCCACATAGACGAGTTGATTC ?
[0030](4) RNA酶處理確定多聚核糖體組分
為了鑒定蔗糖密度梯度中多聚核糖體的組分，將(2)提取的線粒體核糖體懸液在進行密度梯度離心之前用5U/ μ L RNase I (終濃度)于25°C處理40min。再按照(3)的方法進行離心分離，提取RNA和蛋白質(zhì)。對各組分進行線粒體核糖體蛋白亞基(MRPS27、MRPL24)的免疫印跡分析檢測核酸酶處理后多聚核糖體解聚的效果(免疫印跡方法為標準流程，請注意線粒體蛋白多為跨膜蛋白，上樣前應(yīng)注意震蕩)。
[0031]MRPS27是線粒體核糖體小亞基的組分，MRPL24是線粒體核糖體大亞基的組分，通過分析這兩個蛋白在蔗糖密度梯度不同位置的分布，可以確定線粒體核糖體亞基、核糖體單體以及多聚核糖體的分布和豐度。RNase I可以切割mRNA，使多聚核糖體解聚。未用RNaseI處理的線粒體核糖體懸液，第12、13兩個組分有豐度很高的MRPS27和MRPL24 ；RNase I處理后的線粒體核糖體懸液，第12、13兩個組分幾乎檢測不到MRPS27和MRPL24 (見圖2)，結(jié)果表明12、13兩個組分為線粒體多聚核糖體。
[0032](5)線粒體COXl和NDl mRNA翻譯效率通過圖1的結(jié)果和圖2所示的策略，分析得出第10和11組分為核糖體；第12和13組分為多聚核糖體，通過對核糖體組分和多聚核糖體組分的COXl和NDl mRNA的定量PCR分析，可以得到不同組分中mRNA的相對豐度，根據(jù)領(lǐng)域內(nèi)公認的多聚核糖體的多肽產(chǎn)生能力是核糖體單體的5-10倍。可以分析不同處理條件下COXl和NDl mRNA的翻譯效率。
[0033]定量PCR引物如下:
COXl 引物:F:TCCAACTCATCCCTTGACATC, R:TCCTGCTATGATAGCAAACACT ；
NDl 引物:F: TTACCAGAACTCTACTCAACT, R:ATCGTAACGGAAGCGTGGATA。
[0034]結(jié)果見圖3，第3、4、5是核糖體小亞基結(jié)合的mRNA所占的百分比；6、7是核糖體大亞基結(jié)合的mRNA所占的百分比；9、10、11是核糖體單體結(jié)合的mRNA所占的百分比；12、13是多聚核糖體結(jié)合的mRNA所占的百分比。
[0035]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方 式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種提取線粒體中多聚核糖體的方法，其特征在于包含如下步驟: (1)用線粒體提取緩沖液提取靶細胞的線粒體； (2)線粒體用核糖體提取緩沖液裂解得到線粒體核糖體懸液； (3)線粒體核糖體懸液分兩等份，其中一份用RNA酶處理，另外一份不做處理作為對昭.>、、、? (4)配制10-30%蔗糖密度梯度，平衡后將線粒體核糖體懸液鋪在蔗糖密度梯度上層，40C 180000 Xg 離心 2-4 小時； (5)從上到下收集各離心組分，提取各組分的RNA和蛋白質(zhì)，通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR分析線粒體核糖體大亞基RNA組分和小亞基RNA組分和免疫印跡檢測線粒體核糖體蛋白亞基MRPS27、MRPL24，根據(jù)用RNA酶處理的組分和未用RNA酶處理組分中MRPS27、MRPL24含量的不同來確定多聚核糖體所在組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取線粒體中多聚核糖體的方法，其特征在于:步驟(1)中所述的線粒體提取緩沖液的配方為:0.01M Tris-MOPS, 0.01M EGTA/Tris，0.2M蔗糖，pH 7.4，用DEPC水配制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取線粒體中多聚核糖體的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的核糖體提取緩沖液的配方為:260mM蔗糖，10mM KCl,20mM MgCl2, 1mM Tris pH 7.5，1%Triton X-100, 5mM β -疏基乙醇，I X Roche protease inhibitor。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取線粒體中多聚核糖體的方法，其特征在于:步驟(3)中用RNA 酶處理為 5U/ μ LRNA 酶，25°C 處理 40min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取線粒體中多聚核糖體的方法，其特征在于: 步驟(1)為:將靶細胞培養(yǎng)于4個15cm細胞培養(yǎng)皿中，用預(yù)冷的PBS洗2遍，將細胞刮下，4°C 200Xg離心收集到離心管中；用3mL線粒體提取緩沖液輕懸細胞沉淀，漿約100后將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，4°C 500 Xg離心3min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，重復(fù)離心;收集上清于4°C 800 Xg離心5min，重復(fù)離心；收集上清于4°C 18000 Xg離心1min,棄上清，用預(yù)冷的線粒體提取緩沖液將沉淀懸起，于4°C 20000Xg離心5min，沉淀即為線粒體； 步驟(2)為:用500 μ L預(yù)冷的核糖體提取緩沖液裂解線粒體沉淀，于冰上放置20min，于4°C 9400 Xg離心45min，收集上清，即為線粒體核糖體裂解液。
6.權(quán)利要求1-5任一項所述的提取線粒體中多聚核糖體的方法在分析線粒體基因翻譯水平中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104032026SQ201410296349
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】張曉榮, 付向東 申請人:武漢大學(xué)