一種血液單核細胞分離的輔助部件的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血液單核細胞分離的輔助部件，是一個起到半隔離作用，用于對加液進行速度限制，防止滴加液體時速度過快的緩沖塊，該緩沖塊由圓柱形緩沖底座，圓錐形操作結構及無菌吊繩孔組成，其中圓柱形緩沖底座、圓錐形操作結構為一個整體，所述圓柱形緩沖底座的直徑比離心管內壁直徑小1-3mm，保證血液能從圓柱形緩沖底座與離心管之間流到下面，圓錐形操作結構的母線與底面夾角為55-65°，無菌吊繩孔上系一根用于移動緩沖塊的無菌吊繩。本發(fā)明的輔助部件可以起到緩沖作用，血液必須通過緩沖塊與離心管壁的縫隙流到淋巴細胞分離液的表面，防止了血樣滴加速度過快對液體分層的影響。
【專利說明】一種血液單核細胞分離的輔助部件

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞分離領域，具體是一種血液單核細胞分離的輔助部件。

【背景技術】
[0002]單核細胞(英語:Monocyte)是人體免疫系統(tǒng)中的一種白細胞。單核細胞來源于骨髓中的造血干細胞，并在骨髓中發(fā)育。當它們從骨髓進入血液時仍然是尚未成熟的細單核細胞胞。與其他血細胞比較，單核細胞內含有更多的非特異性脂酶，并且具有更強的吞噬作用。單核細胞在血液中停留2-3天后遷移到周圍組織中，細胞體積繼續(xù)增大，直徑可達50-80 μ m,細胞內所含的溶酶體顆粒和線粒體的數(shù)目也增多,成為成熟的細胞。固定在組織中的單核細胞稱為組織巨噬細胞，它們經(jīng)常大量存在于淋巴結、肺泡壁、骨髓、肝和脾等器官。激活了的單核細胞和組織巨噬細胞能生成并釋放多種細胞毒、干擾素和白細胞介素，參與機體防衛(wèi)機制，還產(chǎn)生一些能促進內皮細胞和平滑肌細胞生長的因子。在炎癥周圍單核細胞能進行細胞分裂，并包圍異物。單核細胞(monocytes)是體積最大的白細胞。其細胞核常偏位，呈多形性，如卵圓形、腎形、馬蹄形、不規(guī)則形等，常有折疊感；染色質呈疏松網(wǎng)狀，著色較淺。胞質較多，嗜堿性，但因含大量細小的嗜天青顆粒而染成灰藍色，顆粒含過氧化物酶。
[0003]在醫(yī)學和生物學上，單核細胞是免疫細胞和血液干細胞的來源，為此，分離技術得到快速發(fā)展，現(xiàn)有最常用的單核細胞分離技術就是密度梯度區(qū)帶離心法(簡稱區(qū)帶離心法)。
[0004]密度梯度離心法是將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。此法的優(yōu)點是:①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。此法的缺點是:①離心時間較長需要制備惰性梯度介質溶液；③操作嚴格，不易掌握。
[0005]密度梯度離心法亦稱平衡密度梯度離心法。用超離心機對小分子物質溶液，長時間加一個離心力場達到沉降平衡，在沉降池內從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內比溶劑密度大的部分就產(chǎn)生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。利用這種現(xiàn)象，測定核酸或蛋白質等的浮游密度，或根據(jù)其差別進行分析的一種沉降平衡法。自1958年米西爾遜(M.Meselson),斯塔爾(F.ff.Stahl),維諾格拉德(J.Vinograd)成功地分離了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以來，該法取得許多成果。為得到必要的濃度梯度，多采用濃氯化銫溶液，所以有時也使用氯化銫濃度梯度離心法這個名稱，還可采用氯化銣、溴化銫等溶液。通常利用分析超離心機，但在將細胞顆粒成分進行分離等以純化為目的的情況，利用密度差，使用分離超離心機，采用預先制備好的蔗糖等的密度梯度。〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液，預先在分離超離心機的樣品地內制備出密度梯度，在其上面再加上一層少量的大分子溶液后，離心，大分子就形成層狀而沉降。若含有沉降系數(shù)不同的許多成分，就會出現(xiàn)許多層。這種情況采用適當?shù)木幣盘柎a，取出樣品池內的溶液，然后進行研究。這是與〔I〕不同的一種沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分離物這點上是有優(yōu)越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦稱為蔗糖密度梯度離心法。
[0006]原理:不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。介質梯度應預先形成，介質的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。
[0007]步驟
[0008]1.在離心管中加入適量淋巴細胞分離液。
[0009]2.取肝素抗凝靜脈血與等量生理鹽水充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpmX20分鐘。
[0010]3.離心后管內分為三層，上層為血漿和生理鹽水的混合液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，這一層就是單個核細胞，包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。
[0011]4.用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入5倍以上體積的生理鹽水，1500rpmX 10分鐘，洗滌細胞兩次。
[0012]5.末次離心后，棄上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2%臺盼蘭染液混合，于血球計數(shù)板上，計數(shù)四個大方格內的細胞總數(shù)。
[0013]現(xiàn)有的密度梯度離心法也存在諸多問題:1、操作步驟無法再簡化，無法進行智能自動化操作；2、離心時間太長；3、在加液時，淋巴細胞分離液加在離心管底部，血液加在上層，但是由于操作原因，經(jīng)常出現(xiàn)加液速度太快，大量血液和淋巴細胞分離液混合，影響最終分尚效果。
[0014]為了解決以上的問題,greiner品牌設計的Leucosep?分離管,其核心技術是在高透明度的聚丙烯離心管中加入了一個多孔篩板。該篩板由高規(guī)格的聚乙烯制成，通過嚴格控制篩板的孔徑大小來分離細胞，大大縮短了樣本處理的時間?？梢灾苯訉⒉杉降目鼓蚬撬铇颖镜谷隠eucosepTM分離管中。多孔篩板能防止樣本和分離液的提前混合。由于各種血細胞密度的不同，在離心過程中，淋巴細胞和單核細胞都會與紅細胞和粒細胞分開，淋巴細胞和單核細胞會在分離液的上層富集。


【發(fā)明內容】

[0015]密度梯度離心法是現(xiàn)有主要的血液單核細胞分離技術，具有技術難度低，操作簡單的優(yōu)點，但是必須先將淋巴細胞分離液加入底層，再緩慢的將血液加入在淋巴細胞分離液上面，會形成明顯的分層，從而在離心處理后達到好的分離效果，但是往往由于操作時用力過大，造成血液與淋巴細胞分離液混合在一起，影響最終分離效果，為此，本發(fā)明提供了一種血液單核細胞分離的輔助部件，覆蓋于淋巴細胞分離液表面，從而防止血液加入時速度過快，達到防止兩種液體混合的目的。
[0016]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案:
[0017]一種血液單核細胞分離的輔助部件，是一個起到半隔離作用，用于對加液進行速度限制，防止滴加液體時速度過快的緩沖塊，該緩沖塊由圓柱形緩沖底座，圓錐形操作結構及無菌吊繩孔組成，其中圓柱形緩沖底座、圓錐形操作結構為一個整體，所述圓柱形緩沖底座的直徑比離心管內壁直徑小l_3mm，保證血液能從圓柱形緩沖底座與離心管之間流到下面，圓錐形操作結構的母線與底面夾角為55-65°，無菌吊繩孔上系一根用于移動緩沖塊的無菌吊繩；所述的緩沖塊和無菌吊繩的材料，是任何具有疏水性、無細胞毒性、密度小于淋巴細胞分離液、水及血液的材料。
[0018]作為本發(fā)明進一步的方案:所述的緩沖塊具有以下特征:①、所述圓柱形緩沖底座3的直徑比離心管內壁直徑小2mm，血液可以從中間流到下面、密度小于水，保證密度小于淋巴細胞分離液和血液，從而保證加樣之后能浮在血液樣品之上、是疏水的材料，不會粘上淋巴細胞分離液、血液和水、表面光滑、對生物細胞無毒。
[0019]作為本發(fā)明進一步的方案:圓錐形操作結構的母線與底面夾角為60°。
[0020]作為本發(fā)明進一步的方案:所述無菌吊繩的光滑的直徑為Imm細繩，并具有以下特征:①、光滑、疏水、對細胞無毒、密度與緩沖塊材料一致，或者小于緩沖組件材料的密度；從而保證加樣之后能浮在血液樣品之上；所述無菌吊繩可以將緩沖塊移進離心管，以及在加樣完成后從離心管中移出緩沖塊。
[0021]作為本發(fā)明進一步的方案:所述離心管為15ml或者50ml標準離心管。
[0022]現(xiàn)有的密度梯度離心法主要使用實驗室中的15ml和50ml離心管進行，為了節(jié)省操作，完全依靠人的操作技巧進行加液，這會造成在大量實驗面前，技術人員為了追求時間，提高操作速度忽略了淋巴細胞分離液和血液的分層，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的輔助部件可以起到緩沖作用，血液必須通過緩沖塊與離心管壁的縫隙流到淋巴細胞分離液的表面，防止了血樣滴加速度過快對液體分層的影響。本發(fā)明還具有以下優(yōu)點:
[0023]1、成本低，現(xiàn)有專用離心管大多國外設計，價格昂貴，不適用于大規(guī)模醫(yī)療或者實驗使用，而本產(chǎn)品造價低廉；
[0024]2、工藝要求較低，該設計的產(chǎn)品無需高精度加工，制作結構簡單；
[0025]3、使用靈活性強，任何普通離心管，包括15ml和50ml離心管，只要是標準的管體，都可以使用對應的組件，同時對于特殊直徑的離心管，只需要將直徑進行修改就可以制作出對于的產(chǎn)品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為血液單核細胞分離的輔助部件的主視圖；
[0027]圖2為血液單核細胞分離的輔助部件的左視圖；
[0028]圖3為血液單核細胞分離的輔助部件的俯視圖；
[0029]圖4為血液單核細胞分離的輔助部件的使用狀態(tài)圖。

【具體實施方式】
[0030]下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0031]請參閱圖1?4，本發(fā)明實施例中，一種血液單核細胞分離的輔助部件，是一個起到半隔離作用，用于對加液進行速度限制，防止滴加液體時速度過快的緩沖塊，該緩沖塊由圓柱形緩沖底座3，圓錐形操作結構2及無菌吊繩孔I組成，其中圓柱形緩沖底座3、圓錐形操作結構2為一個整體，所述圓柱形緩沖底座3的直徑比離心管5內壁直徑小l_3mm，保證血液能從圓柱形緩沖底座3與離心管5之間流到下面，圓錐形操作結構2的母線與底面夾角為55-65°，最佳為60°，無菌吊繩孔I上系一根用于移動緩沖塊的無菌吊繩4;所述的緩沖塊和無菌吊繩4的材料，是任何具有疏水性、無細胞毒性、密度小于淋巴細胞分離液、水及血液的材料。
[0032]所述的緩沖塊具有以下特征:①、所述圓柱形緩沖底座3的直徑比離心管5內壁直徑小2mm，血液可以從中間流到下面、密度小于水，保證密度小于淋巴細胞分離液和血液，從而保證加樣之后能浮在血液樣品之上；③、是疏水的材料，不會粘上淋巴細胞分離液、血液和水、表面光滑、對生物細胞無毒。所述無菌吊繩4的光滑的直徑為Imm細繩，并具有以下特征:①、光滑、疏水、對細胞無毒、密度與緩沖塊材料一致，或者小于緩沖組件材料的密度；從而保證加樣之后能浮在血液樣品之上；所述無菌吊繩4可以將緩沖塊移進離心管5，以及在加樣完成后從離心管5中移出緩沖塊。所述離心管5為15ml或者50ml標準離心管。
[0033]本發(fā)明在淋巴細胞分離液上方放置一塊設計的低密度疏水緩沖塊，防止滴加血液時速度過快，造成液體混合；由于緩沖塊密度較低，在加入血液后，血液通過緩沖塊與離心管壁之間的空間流到淋巴細胞分離液上面，使緩沖塊上浮，最終的緩沖塊可以取出，不會對離心分離造成影響；緩沖塊采用疏水性材料制成，不會有血液或者淋巴細胞分離液貼在上面，不影響液體量；緩沖塊為無細胞毒性材料，不會對細胞產(chǎn)生任何影響，不影響后續(xù)培養(yǎng)使用；投入成本低廉，操作簡單。
[0034]對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所涉及的權利要求。
[0035]此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。
【權利要求】
1.一種血液單核細胞分離的輔助部件，其特征在于，是一個起到半隔離作用，用于對加液進行速度限制，防止滴加液體時速度過快的緩沖塊，該緩沖塊由圓柱形緩沖底座，圓錐形操作結構及無菌吊繩孔組成，其中圓柱形緩沖底座、圓錐形操作結構為一個整體，所述圓柱形緩沖底座的直徑比離心管內壁直徑小l-3mm，保證血液能從圓柱形緩沖底座與離心管之間流到下面，圓錐形操作結構的母線與底面夾角為55-65°，無菌吊繩孔上系一根用于移動緩沖塊的無菌吊繩；所述的緩沖塊和無菌吊繩的材料，是任何具有疏水性、無細胞毒性、密度小于淋巴細胞分離液、水及血液的材料。
2.根據(jù)權利要求1所述的血液單核細胞分離的輔助部件，其特征在于，所述的緩沖塊具有以下特征:①、所述圓柱形緩沖底座3的直徑比離心管內壁直徑小2mm，血液可以從中間流到下面、密度小于水，保證密度小于淋巴細胞分離液和血液，從而保證加樣之后能浮在血液樣品之上、是疏水的材料，不會粘上淋巴細胞分離液、血液和水、表面光滑、對生物細胞無毒。
3.根據(jù)權利要求1所述的血液單核細胞分離的輔助部件，其特征在于，圓錐形操作結構的母線與底面夾角為60°。
4.根據(jù)權利要求1所述的血液單核細胞分離的輔助部件，其特征在于，所述無菌吊繩的光滑的直徑為Imm細繩，并具有以下特征:①、光滑、疏水、對細胞無毒、密度與緩沖塊材料一致，或者小于緩沖組件材料的密度；從而保證加樣之后能浮在血液樣品之上。
5.根據(jù)權利要求1所述的血液單核細胞分離的輔助部件，其特征在于，所述離心管為15ml或者50ml標準離心管。
【文檔編號】C12M1/00GK104293644SQ201410300855
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權日:2014年6月24日
【發(fā)明者】易銀沙, 張萬明, 朱海強, 鄒義洲, 許澎, 劉彩云, 袁炳秋, 吳小寧 申請人:長沙贏潤生物技術有限公司