microRNA302s在制備抗腫瘤藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了SEQ ID NO.1～5所示的核苷酸序列，包含該序列的質(zhì)粒和重組慢病毒，以及前述序列、質(zhì)粒、慢病毒制備抗腫瘤藥物的用途。本發(fā)明還公開了一種腫瘤篩查試劑盒，它包括檢測細胞microRNA302a表達水平的試劑。本發(fā)明microRNA302s可以有效誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤增長，有較強的實際應(yīng)用價值。
【專利說明】microRNA302s在制備抗腫瘤藥物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及microRNA302s的新用途。

【背景技術(shù)】
[0002] microRNAs (miRNAs)是人類新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA，廣泛分布于真核細 胞內(nèi)。miRNAs通過與靶基因互補位點配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控靶基因的表達，參 與生長發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化等生命過程。成熟的miRNAs長17?24bp，一 個miRNA分子能夠調(diào)控多種基因。因而有研究發(fā)現(xiàn)，相對于編碼蛋白質(zhì)的mRNA分子來說， 一些基因的表達更依賴于miRNAs的調(diào)控水平。
[0003] microRNA302s，即 miR-302 家族 microRNA，包括 miR-302a、miR-302b、miR-302c、 miR-302d，成簇聚集在人類4號染色體上，是胚胎干細胞特異性表達的miRNAs。目前，關(guān)于 miR-302家族microRNA，研究均集中在于胚胎發(fā)育相關(guān)的基因上，比如，研究發(fā)現(xiàn)，miR-302 家族的每個成員都能同時調(diào)節(jié)大約445個基因，并且他們所調(diào)節(jié)的大部分基因都是相同 的，這些基因的大多涉及早期胚胎發(fā)育相關(guān)的信號分子或影響細胞分化的細胞因子，轉(zhuǎn)入 miR-302s后可以抑制這些基因的作用，進而抑制組織細胞的分化，有可能把細胞重編程為 胚胎干細胞樣的狀態(tài)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了 miR-302家族microRNA在制備抗腫瘤藥物中的新用途。
[0005] 首先，本發(fā)明提供了 SEQ ID NO. 1?5所示的核苷酸序列。
[0006] SEQ ID NO. 1 ?4 所示的核苷酸序列分別為 miR-302a、miR-302b、miR-302c、 miR-302d，SEQ ID 勵.5所示的核苷酸序列為111丨1?-3023、111丨1?-30213、111丨1?-302(3和111丨1?-302(1 串聯(lián)后的基因序列：miR-302s。
[0007] miR-302a: CCACCACUUAAACGUGGAUGUACUUGCUUUGAAACUMAGAAGUAAGUGCUUCCAUGUUU UG⑶GAUGG ;
[0008] miR-302b:GCUCCCUUCAACUUUAACAUGGAAGUGCUUUCUGUGACUUUAAAAGUAAGUGCUUCCAUG UUUUAGUAGGAGU ；
[0009] miR-302c:CCUUUGCUUUAACAUGGGGGUACCUGCUGUGUGAAACAAAAGUAAGUGCUUCCAUGUUUC AGUGGAGG ；
[0010] miR-302d:CCUCUACUUUAACAUGGAGGCACUUGCUGUGACAUGACAAAAAUAAGUGCUUCCAUGUUU GAGUGUGG〇
[0011] miR-302s (SEQ ID NO. 5):
[0012] CCACCACTTAAACGTGGATGTACTTGCTTTGAAACTAAAGAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATGG AGATCTGCTCCCTTCAACTTTAACATGGAAGTGCTTTCTGTGACTTTAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTAGTAGGA GTCATATGCCTTTGCTTTAACATGGGGGTACCTGCTGTGTGAAACAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTCAGTGGAGGT CTAGACCTCTACTTTAACATGGAGGCACTTGCTGTGACATGACAAAAATAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGTGG
[0013] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO. 1?5所示的核苷酸序列中的任意一個或任意多個序 列在制備抗腫瘤藥物中的用途。所述抗腫瘤藥物是抗神經(jīng)瘤藥物。所述抗神經(jīng)瘤藥物是抗 神經(jīng)母細胞瘤藥物。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒,它包括SEQ ID NO. 1?5任意一項所示的核苷酸 序列。優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒是重組GV266質(zhì)粒。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述重組質(zhì)粒在制備治療抗腫瘤藥物中的用途。優(yōu)選地，所述抗 腫瘤藥物是抗神經(jīng)瘤藥物。進一步優(yōu)選地，所述抗神經(jīng)瘤藥物是抗神經(jīng)母細胞瘤藥物。
[0016] 本發(fā)明重組慢病毒，它包括SEQ ID NO. 1?5任意一項所示的核苷酸序列。
[0017] 本發(fā)明重組慢病毒，它包括前述重組質(zhì)粒。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述重組慢病毒在制備治療抗腫瘤藥物中的用途。優(yōu)選地，所述 抗腫瘤藥物是抗神經(jīng)瘤藥物。進一步優(yōu)選地，所述抗神經(jīng)瘤藥物是抗神經(jīng)母細胞瘤藥物。
[0019] 本發(fā)明腫瘤細胞篩查試劑盒，它包括檢測細胞micr〇RNA302a表達水平的試劑。
[0020] 優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物是抗神經(jīng)瘤藥物。進一步優(yōu)選地，所述抗神經(jīng)瘤藥物是抗 神經(jīng)母細胞瘤藥物。
[0021] 本發(fā)明提供的SEQ ID NO. 1?5所示的核苷酸序列，可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制 腫瘤細胞的生長，可用于制備抗腫瘤藥物，本發(fā)明腫瘤細胞篩查試劑盒可以有效篩查待檢 細胞是否為腫瘤細胞，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
[0022] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0023] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖lmiR_302a在293細胞和SK細胞中的表達情況比較
[0025] 圖2目的基因真核表達載體構(gòu)建流程圖
[0026] 圖3載體圖譜
[0027] 圖 4Marker 自上而下依次為：5kb，3kb，2kb，I. 5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp, 100bp，2# :酶切的目的基因質(zhì)粒；
[0028] 圖5電泳圖說明：1# :陰性對照（ddH20) ;2# :陰性對照（空載自連對照組）；3# : 陽性對照（GAPDH) ;4#:Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，1.5kb，lKb，750bp，500bp， 250bp，IOObp ;5#-12# :hsa-mir-302, a, b, c, d 串聯(lián) 1-8 號轉(zhuǎn)化子。
[0029] 圖6測序圖譜，圖6-1為第1?295bp的測序圖譜；圖6-2為第296?601bp的測 序圖譜；圖6-3為第602?807bp的測序圖譜；圖6-4為第808?1081bp的測度圖譜；圖 6-5為第1081?1159bp的測序譜圖。
[0030] 圖7病毒感染圖片（IEIuLIOOx b)
[0031] 圖8病毒感染圖片（IEIuLIOOx g)
[0032] 圖9病毒感染圖片（IEIuLIOOx r)
[0033] 圖10病毒感染圖片（1E1uL200x b)
[0034] 圖11病毒感染圖片（1E1uL400x b)
[0035] 圖12定量PCR實驗結(jié)果
[0036] 圖13Real_time PCR檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后miR_302s表達情況
[0037] 圖14miR_302a在SK-目的病毒轉(zhuǎn)染細胞和SK-目對照細胞的表達情況
[0038] 圖15miR_302b在SK-目的病毒轉(zhuǎn)染細胞和SK-目對照細胞的表達情況
[0039] 圖16miR-302c在SK-目的病毒轉(zhuǎn)染細胞和SK-目對照細胞的表達情況
[0040] 圖17miR-302d在SK-目的病毒轉(zhuǎn)染細胞和SK-目對照細胞的表達情況
[0041] 圖18SK-N-SH細胞感染后48hHoechst33342染色實驗結(jié)果
[0042] 圖19SK-N-SH細胞感染后48hHoechst33342染色檢測凋亡結(jié)果
[0043] 圖20流失細胞技術(shù)檢測miR-302s過表達慢病毒轉(zhuǎn)染后48h時間點SK-N-SH細胞 凋亡率的變化情況
[0044] 圖21流失細胞技術(shù)檢測miR-302s過表達慢病毒轉(zhuǎn)染后72h時間點SK-N-SH細胞 凋亡率的變化情況
[0045] 圖22SK-N-SH細胞感染后48h TUNEL染色實驗結(jié)果
[0046] 圖23SK-N-SH細胞感染后48h TUNEL染色檢測凋亡結(jié)果
[0047] 圖24CASP-3在SK正常細胞和miR-302s轉(zhuǎn)染細胞中的表達情況
[0048] 圖25Bax在SK正常細胞和miR_302s轉(zhuǎn)染細胞中的表達情況
[0049] 圖26MCL-1在SK正常細胞和miR-302s轉(zhuǎn)染細胞中的表達情況
[0050] 圖27CCND-1在SK正常細胞和miR-302s轉(zhuǎn)染細胞中的表達情況
[0051] 圖28BMI-1在SK正常細胞核miR-302s轉(zhuǎn)染細胞中的表達比較
[0052] 圖29pl6Ink4a在SK正常細胞核miR-302s轉(zhuǎn)染細胞中的表達比較
[0053] 圖30p53在SK正常細胞核miR_302s轉(zhuǎn)染細胞中的表達比較
[0054] 圖 31Western Blotting 檢測 BMI-1 的表達情況
[0055] 圖 32Western Blotting 檢測 pl6Ink4a，p53, Bax 的表達情況
[0056] 圖33干擾前兩組裸鼠的體重
[0057] 圖34干擾前兩組裸鼠腫瘤體積
[0058] 圖35處死前稱重圖
[0059] 圖36處死前測得兩組腫瘤體積圖
[0060] 圖37處死前移植瘤活體比較圖
[0061] 圖38處死前移植瘤活體比較圖
[0062] 圖39處死后取得兩組移植瘤瘤重比較圖
[0063] 圖40處死后取得兩組移植瘤比較圖
[0064] 圖41移植瘤生長曲線圖
[0065] 圖42移植瘤生長曲線圖
[0066] 圖43移植瘤增長倍數(shù)圖

【具體實施方式】
[0067] 實施例1腫瘤細胞的microR_302a表達情況
[0068] 1、實驗方法
[0069] (1)細胞復(fù)蘇，培養(yǎng)，傳代（293細胞和SK細胞）；293細胞：轉(zhuǎn)染腺病毒ElA基因 的人腎上皮細胞系；SK細胞：人類神經(jīng)母細胞瘤細胞株；
[0070] ⑵細胞種板（六孔板，每孔3 X IO5個）；
[0071] (3)細胞株總RNA提?。═rizol法）；
[0072] (4)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄stem-loop)，引物為
[0073] 5' -GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCACTGGATACGACTCACCA-3' ；
[0074] (5)實時熒光定量PCR(Taqman)探針PCR技術(shù)，檢測miR_302a的表達量，正常細胞 計為1，使用的探針序列為：
[0075] 5'-FAM-TCGTATCCAGTGCGAATCACTC-TAMRA-3'
[0076] (6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。
[0077] 2、實驗結(jié)果
[0078] 實驗結(jié)果如圖1和表1所示：
[0079] 表I miR_302a在293細胞和SK細胞中的表達情況

【權(quán)利要求】
1. SEQ ID NO. 1?5所示的核苷酸序列。 2. SEQ ID NO. 1?5所示的核苷酸序列中的任意一個或任意多個序列在制備抗腫瘤藥 物中的用途。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：所述抗腫瘤藥物是抗神經(jīng)瘤藥物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于：所述抗神經(jīng)瘤藥物是抗神經(jīng)母細胞瘤藥 物。
5. -種重組質(zhì)粒，其特征在于：它包括SEQ ID NO. 1?5任意一項所示的核苷酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其特征在于：它是重組GV266質(zhì)粒。
7. -種重組慢病毒，其特征在于：它包括SEQ ID NO. 1?5任意一項所示的核苷酸序 列。
8. -種重組慢病毒，其特征在于：它包括權(quán)利要求5或6所述重組質(zhì)粒。
9. 權(quán)利要求5?8所述重組質(zhì)粒或者重組慢病毒在制備抗腫瘤藥物中的用途。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于：所述抗腫瘤藥物是抗神經(jīng)瘤藥物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于：所述抗神經(jīng)瘤藥物是抗神經(jīng)母細胞瘤 藥物。
12. -種腫瘤篩查試劑盒，其特征在于：它包括檢測細胞micr〇RNA302a表達水平的試 劑。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于：所述腫瘤是神經(jīng)瘤。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于：所述神經(jīng)瘤是神經(jīng)母細胞瘤。
【文檔編號】C12N15/113GK104293785SQ201410304621
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】李園, 王奕, 李藝波, 陳珂玲, 周斌, 周總光 申請人:四川大學華西醫(yī)院