人乳頭狀瘤病毒的快速基因型鑒定分析及其裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種用于快速基因型鑒定的方法和裝置，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明被應(yīng)用到人乳頭狀瘤病毒(HPV)的基因型鑒定，包括使用病毒基因型特異性寡核苷酸探針、反向斑點(diǎn)雜交基因型點(diǎn)陣方式和導(dǎo)流雜交過(guò)程，從而提供一種更高效、更快速和更經(jīng)濟(jì)的方法進(jìn)行HPV基因型鑒定。這種基因型鑒定的方法可以兼容通用探針，從而擴(kuò)大了HPV基因型的檢測(cè)范圍。
【專利說(shuō)明】人乳頭狀瘤病毒的快速基因型鑒定分析及其裝置
[0001]本申請(qǐng)要求2010年4月29日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)12/770034的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)是部份接續(xù)2006年4月4日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)11/398433，而后者是部分接續(xù)2002年11月7日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)10/291168，同時(shí)該申請(qǐng)聲明要求2001年11月7日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)60/345948的權(quán)益。美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)11/398433也是部分延續(xù)2002年11月9號(hào)提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)10/293248。前述申請(qǐng)內(nèi)容特此全文并入本申請(qǐng)中作為參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明是關(guān)于鑒定人乳頭狀瘤病毒的多種基因型。
【背景技術(shù)】
鑒定人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)
[0003]在器官或骨髓移植中，通過(guò)準(zhǔn)確的HLA分型使得供體和受體相匹配(4)，是預(yù)防急性移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生的關(guān)鍵。HLA分型通常是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)分型(2)來(lái)完成。最近的研究表明，DNA分型提供的結(jié)果更加準(zhǔn)確和肯定(7，9，8)。將HLA-DQ、HLA-DR和HLA-DP分型檢測(cè)結(jié)果用于高精度匹配，這已是選擇潛在器官捐獻(xiàn)者的必備途徑(3)。先前已有報(bào)道，利用序列特異性引物的聚合酶鏈反應(yīng)(SSP-PCR)擴(kuò)增，可進(jìn)行HLA基因分型。然而，由于HLA-DQ、DR和DP位點(diǎn)的高度多態(tài)性，所需序列特異性引物(SSP)的數(shù)目將會(huì)多達(dá)數(shù)百個(gè)，超出了多重PCR擴(kuò)增極限，從而無(wú)法進(jìn)行有效的PCR擴(kuò)增。要確保HLA基因分型的結(jié)果在臨床上有實(shí)際應(yīng)用，必須設(shè)置多項(xiàng)檢測(cè)，每項(xiàng)各有50至100個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)。如今市場(chǎng)上提供一種試劑盒，其中包括一個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，需要進(jìn)行96個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，然后對(duì)凝膠電泳分離得到的片段大小進(jìn)行分析。這不僅耗費(fèi)時(shí)間和金錢(qián)，而且非常容易出現(xiàn)差錯(cuò)，因?yàn)榉磻?yīng)設(shè)置復(fù)雜，另外判斷凝膠電泳中片段大小也存在不確定性。因此，DNA測(cè)序仍然被認(rèn)為是HLA基因準(zhǔn)確分型的首選方法。遺憾的是，由于在序列上高度同源，假基因也可以在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中被共同擴(kuò)增，使得單獨(dú)通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行高分辨HLA基因分型將會(huì)更加困難并且昂貴。授予JWO Tam先生的美國(guó)專利第5471547和6020187號(hào)，公開(kāi)了一種可以在費(fèi)用低廉的設(shè)備上進(jìn)行的快速退火過(guò)程，用于準(zhǔn)確的突變型檢測(cè)、基因分型和指紋圖譜分析。本發(fā)明公開(kāi)了一種使用改進(jìn)的導(dǎo)流方式，利用ASO寡核苷酸探針對(duì)HLA基因座DP、DR和DQ beta序列進(jìn)行快速分析的方法。
DNA指紋圖譜快速鑒定人類(lèi)和生物體
[0004] 1985年，基于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的DNA指紋圖譜首次應(yīng)用于人類(lèi)身份鑒定(12)，并隨后開(kāi)始應(yīng)用于其他生物體的鑒定。在實(shí)際應(yīng)用中，DNA指紋技術(shù)作為最好的法醫(yī)學(xué)工具已經(jīng)被廣泛接受，可用于在刑事案件中確定犯罪嫌疑人、親子糾紛、建立或證實(shí)一個(gè)人的身份。耗時(shí)的RFLP方法已逐漸被高通量的自動(dòng)化過(guò)程取代。目前，利用PCR擴(kuò)增，分析人類(lèi)基因組10、16、18或更多位點(diǎn)上的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的數(shù)目(1991年發(fā)現(xiàn)(11))，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平的鑒定。但是，不論STR還是可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)，都相對(duì)昂貴，因?yàn)檫@些方法需要使用復(fù)雜的設(shè)備，以及人工密集并且過(guò)程耗時(shí)的方法，比如Southern印跡雜交。自發(fā)突變(10)也可能會(huì)降低準(zhǔn)確性和最終鑒定結(jié)果的確定性。此外，STR數(shù)據(jù)表明，突變的頻率，特別是在癌癥患者中，并不鮮見(jiàn)。因此，需要找到新的替代方法。單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因型鑒定是在法醫(yī)或個(gè)人身份識(shí)別中一種分辨率更高的方法，這種方法基于在不連鎖位點(diǎn)上選擇一定數(shù)量的SNP位點(diǎn)，其中每個(gè)位點(diǎn)的突變頻率均低于VNTR或STR系統(tǒng)。本發(fā)明展示了一種利用SNP基因型鑒定的方法，快速、明確鑒定個(gè)體生物特征，包括人、動(dòng)物、植物或其他生物。
HPV基因型鑒定
[0005]人乳頭狀瘤病毒(HPV)攻擊粘膜細(xì)胞，具有高度多樣性，世界范圍內(nèi)已報(bào)道的有大約200種不同的基因型，在不同種群中患病率各不相同。根據(jù)導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重程度，人乳頭狀瘤病毒分為高風(fēng)險(xiǎn)株(HR)和低風(fēng)險(xiǎn)株(LR)。HR類(lèi)型較常出現(xiàn)在宮頸的癌前病變或惡性病變，而LR類(lèi)型多為良性病例(4)。每年有大約50萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例，死亡病例預(yù)計(jì)超過(guò)25萬(wàn)。因此，HPV感染與宮頸癌仍然是威脅全球女性的主要癌癥(5)?；谶@個(gè)原因，HPV篩查建議用于預(yù)防宮頸癌，因?yàn)樗燃?xì)胞學(xué)方法更敏感(6，7)。
[0006]臨床研究顯示，99.7%的子宮頸癌與HR-HPV感染有關(guān)。盡管在大多數(shù)感染病例中，HPV可能會(huì)被清除，但是持續(xù)的HR-HPV感染，會(huì)導(dǎo)致重度宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(如:CIN
1、CIN II或CIN III)，并發(fā)展成為子宮頸癌(7，8)。因此，針對(duì)HPV病毒DNA的分析方法，已被開(kāi)發(fā)并推向市場(chǎng)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督局已經(jīng)批準(zhǔn)了 Hybrid capture2 (HC2)系統(tǒng)(Digene公司，美國(guó)馬里蘭州Gaithersburg)和AMPLICOR HPV測(cè)試(羅氏分子診斷,美國(guó)新澤西州Branchburg)。這些篩查測(cè)試 確定的是常見(jiàn)的HPV (HR株或LR株)是否存在，而無(wú)法區(qū)分其基因型。雖然這些測(cè)試提供了良好的HPV篩查檢測(cè)，但是無(wú)法進(jìn)行HPV的基因型鑒定限制了它們?cè)谂R床診斷和預(yù)后中的應(yīng)用，因?yàn)椴煌局暌鸺膊〉膰?yán)重程度有很大的不同，其中16型導(dǎo)致病癥最為嚴(yán)重，緊隨其后的是18型、33型、45型和59型等(8)。此外持續(xù)感染相同基因型的HPV，將進(jìn)一步增加子宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)(9)。因此，有效和費(fèi)用可接受的HPV基因型鑒定檢測(cè)方法是最需要的。
[0007]LINEAR ARRAY HPV基因型檢測(cè)(羅氏分子診斷，美國(guó)新澤西州Branchburg，涵蓋37種基因型)和INNO-LIPA HPV基因型鑒定(Innogenetics公司，比利時(shí)，涵蓋28種基因型)，可以作為HC2或AMPLICOR HPV測(cè)試的補(bǔ)充，用于區(qū)分特定HPV基因型，并確定涉及多個(gè)HPV基因型的感染?；谙铝惺聦?shí):1)不同HR-HPV毒株的致癌性不同；2)相同基因型的持續(xù)性感染導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)升高；3)已有的HPV疫苗不能防止所有類(lèi)型的HPV感染，除了確定HPV病毒存在與否的常規(guī)篩查，HPV基因型鑒定仍然是需要的。然而，上述測(cè)試非常昂貴，并且仍然使用傳統(tǒng)的雜交過(guò)程，需要較高的運(yùn)行成本和人工操作時(shí)間。最重要的是，這些基因型鑒定試劑盒不能檢測(cè)超出預(yù)先設(shè)定的基因型譜，因此在HPV篩查中產(chǎn)生較高的假陰性率。因此，HPV基因型檢測(cè)方法需要實(shí)現(xiàn)更快捷、更便宜、覆蓋更多的基因型，并因此更高效，作為目前HPV檢測(cè)的可負(fù)擔(dān)的替代方法。
發(fā)明概要
HLA基因型鑒定
[0008]初步結(jié)果表明，在檢測(cè)特定目標(biāo)HLA的DNA序列時(shí)，等位基因特異性寡核苷酸反相斑點(diǎn)印跡(ASO-RDB)導(dǎo)流雜交是一種更好的選擇。由其獲得的數(shù)據(jù)代表HLA-DP、DR和DQbeta位點(diǎn)上的特征片段，因而能夠準(zhǔn)確地鑒定基因型。使用一對(duì)PCR引物和35個(gè)ASO寡核苷酸探針，可以將世界衛(wèi)生組織(WHO)確定的83個(gè)DPBl等位基因進(jìn)行有效的分類(lèi)。同樣，使用一對(duì)相同的PCR引物和18個(gè)ASO寡核苷酸探針，這個(gè)簡(jiǎn)單的雜交方法可以識(shí)別DR和DQ beta位點(diǎn)特定基因型的頭兩位編碼，足以區(qū)分這些主要人類(lèi)白細(xì)胞抗原。ASO數(shù)據(jù)通過(guò)直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。但是，當(dāng)相同的PCR引物對(duì)用于DR和DQ位點(diǎn)的直接測(cè)序時(shí)，經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生一些無(wú)法解釋的數(shù)據(jù)，這是因?yàn)橄嗤囊飳?duì)也可以同時(shí)擴(kuò)增HLA基因簇內(nèi)高度同源的內(nèi)源性假基因片段。出于這個(gè)原因，DNA測(cè)序(許多人認(rèn)為的金標(biāo)準(zhǔn))可能無(wú)法保證HLA分類(lèi)結(jié)果。在這樣的情況下，為確認(rèn)ASO數(shù)據(jù)，許多套相應(yīng)于每一個(gè)待測(cè)HLA類(lèi)型的PCR引物被創(chuàng)建，并用在獨(dú)立的PCR反應(yīng)中，以得到擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。這是直接測(cè)序法費(fèi)用高和耗時(shí)的一個(gè)主要的原因。相比之下，本發(fā)明提供了一種低成本的HLA識(shí)別程序，通過(guò)使用通用的引物對(duì)，執(zhí)行一個(gè)簡(jiǎn)單的多重PCR，然后將所需數(shù)量的ASO探針，在低密度點(diǎn)陣列平臺(tái)進(jìn)行雜交。擴(kuò)增所得到的HLA片段(包括假基因)，可以在一張包被有ASO探針的膜上進(jìn)行明確的HLA分類(lèi)。因此，這是一個(gè)比當(dāng)前其他DNA或血清學(xué)方法優(yōu)越得多的方法。盡管進(jìn)行進(jìn)一步具體的DR、DQ亞型分類(lèi)，這種直接的導(dǎo)流方法需要額外的寡核苷酸探針，但是其數(shù)量已經(jīng)完全在此平臺(tái)檢測(cè)能力范圍內(nèi)。本發(fā)明提供了一種更快和更簡(jiǎn)單的HLA分型技術(shù)，不需要昂貴的設(shè)備，因此制造和使用成本都低于直接DNA測(cè)序方法和多重PCR凝膠電泳過(guò)程。
[0009]此處公布的HLA基因型鑒定引物和寡核苷酸探針已經(jīng)通過(guò)測(cè)試，并證實(shí)能用于上述相應(yīng)的HLA-DR、DB和DP基因分類(lèi)。依圖1或圖1A中設(shè)計(jì)所示，可以獲得、測(cè)試、驗(yàn)證更多的引物或寡核苷酸探針，從而進(jìn)行更全面的基因型鑒定。雖然在數(shù)據(jù)驗(yàn)證的例子中，PCR反應(yīng)被用于擴(kuò)增，但其它方法也可以使用，只要能夠獲得足夠數(shù)量的特定靶序列用于ASO-RDB導(dǎo)流雜交分析。對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在閱讀本文的教學(xué)后，其他適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法或技術(shù)是顯而易見(jiàn)的。只要能夠獲得足夠數(shù)量的特定靶序列用于ASO-RDB導(dǎo)流雜交分析，擴(kuò)增并非是必需的。檢測(cè)可以通過(guò)對(duì)靶DNA或結(jié)合物進(jìn)行標(biāo)記來(lái)完成。
[0010]盡管在本申請(qǐng)中例示了 HLA基因型鑒定，遵照本應(yīng)用的示教，基于SNP的基因型鑒定技術(shù)也可以應(yīng)用到其他遺傳材料或從任何有機(jī)體得到的序列，如圖1或圖1A中所示程序。類(lèi)似美國(guó)專利第5741547或6020187號(hào)中描述的裝置，或任何新的實(shí)施例，能夠進(jìn)行導(dǎo)流雜交的都可以使用。
SNP基因型鑒定
[0011]人類(lèi)基因組與許多其他生物的基因組已經(jīng)被測(cè)序和繪制圖譜。任何物種內(nèi)部，一般的DNA序列信息是非常相似的。然而，每一個(gè)物種都有它自己獨(dú)特的一套遺傳信息。因此，許多科學(xué)家們?cè)噲D在種群中找到與疾病有聯(lián)系的特征。例如，人類(lèi)學(xué)家采用遺傳變異來(lái)重建人類(lèi)的歷史，試圖了解文化和地理對(duì)人類(lèi)特征群體在全球分布的作用。單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)可以實(shí)現(xiàn)這些目的(12)。Brightwell等報(bào)道了一個(gè)SNP基因型鑒定的應(yīng)用，使用簡(jiǎn)單快速的，在單管中進(jìn)行的，改進(jìn)了的擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)，分析一個(gè)具有FRAXA重復(fù)擴(kuò)張的男性群體中的6個(gè)SNP位點(diǎn)(15)。
[0012]本發(fā)明描述了等位基因特異性寡核苷酸(ASO)陣列的應(yīng)用。在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員按照本應(yīng)用的示教，可以輕易得到足夠鑒定要求所需要的SNP數(shù)目?；谀さ奈㈥嚵蠥SO-RDB導(dǎo)流雜交平臺(tái)(例如，見(jiàn)美國(guó)專利編號(hào)5741647)，可以用于進(jìn)行SNP基因型鑒定。本發(fā)明的微陣列雜交平臺(tái)上所產(chǎn)生的可見(jiàn)斑點(diǎn)，既可以通過(guò)目視檢出，也可以通過(guò)使用成本低廉的圖像分析儀分析。與此相反，目前市場(chǎng)上提供的雜交平臺(tái)需要由高分辨率圖像分析儀進(jìn)行分析。原則上，基因組中的任何位置的單核苷酸多態(tài)性，只要數(shù)量足夠，都可用于識(shí)別目的。然而，這可能會(huì)影響親子鑒定和親緣關(guān)系分析的準(zhǔn)確性，因?yàn)樵诨蚪M不同部分的基因突變率有差異。因此，高度多態(tài)性位點(diǎn)或基因組中突變率相對(duì)較低的位點(diǎn)(包括但不限于編碼區(qū)或任何滿足條件的突變率相對(duì)低的區(qū)域)都可以選作以驗(yàn)證親緣關(guān)系。從9個(gè)高度多態(tài)的染色體位點(diǎn)進(jìn)行的單核苷酸多態(tài)性分析的初步數(shù)據(jù)顯示，這些單核苷酸多態(tài)性已經(jīng)足夠用作SNP基因型鑒定。所需位點(diǎn)的數(shù)目將取決于鑒別要求的準(zhǔn)確率，這對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員在閱讀本文的示教后是顯而易見(jiàn)的。在構(gòu)建每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)頻率數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，對(duì)從50-150個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體取得的DNA樣本進(jìn)行測(cè)序。20個(gè)家庭親緣關(guān)系的分析與STR Profile Plus人類(lèi)身份試劑盒測(cè)試平行進(jìn)行，結(jié)果100%吻合。SNP為基礎(chǔ)的導(dǎo)流平臺(tái)已被證明是人類(lèi)身份識(shí)別的一個(gè)更好的選擇。除了已經(jīng)積累和分析的數(shù)據(jù)，在本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員閱讀本文的示教后，可以容易地實(shí)現(xiàn)多態(tài)頻率數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)展。
SNP基因型鑒定作為診斷工具
[0013]除了建立DNA指紋圖譜，SNP基因型鑒定還可用于鑒定基因片段，或引起基因功能改變或減弱的基因多態(tài)性。出于這個(gè)原因，本發(fā)明可以用于快速、明確的鑒別傳染性病原體、特定DNA序列造成的遺傳性疾病，或者存在或缺失這類(lèi)傳染因子或DNA序列而引起的遺傳性疾病。
HPV基因型鑒定
[0014]本發(fā)明提供了一種基于PCR試驗(yàn)的HPV基因型鑒定方法，包括通過(guò)基于膜的導(dǎo)流雜交技術(shù)(美國(guó)專利編號(hào)5741647)，共擴(kuò)增一種人的基因作為內(nèi)部對(duì)照，來(lái)測(cè)量樣品中是否有靶HPV整合。這種方法確定了 33個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)(HR)和低風(fēng)險(xiǎn)(LR)HPV病毒的基因型(6，11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70，71，72，73，81，82，84)。此外，新型通用探針也被設(shè)計(jì)用來(lái)捕捉具有HPV共有序列的HPV基因型。因此，在除了測(cè)試樣板中包括的33種基因型，在臨床篩查中通用探針還捕獲至少5種其他HPV病毒亞型，敏感度和特異性令人滿意，成本大幅度減少(10)，從而為HPV基因型鑒定提供了一個(gè)更好的選擇。
[0015]雖然在數(shù)據(jù)驗(yàn)證的例子中，PCR反應(yīng)被用于擴(kuò)增，但其它方法也可以使用，只要能夠獲得足夠數(shù)量的特定靶序列用于ASO-RDB導(dǎo)流雜交分析。對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在閱讀本文的教學(xué)后，其他適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法或技術(shù)是顯而易見(jiàn)的。只要能夠獲得足夠數(shù)量的特定靶序列用于ASO-RDB導(dǎo)流雜交分析，擴(kuò)增并非是必需的。檢測(cè)可以通過(guò)對(duì)靶DNA或結(jié)合物進(jìn)行標(biāo)記來(lái)完成。
[0016]類(lèi)似美國(guó)專利第5741547或6020187號(hào)中描述的導(dǎo)流裝置，或任何新的實(shí)施例，能夠?qū)嵤?dǎo)流雜交過(guò)程的裝置都可以使用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1示本發(fā)明用于構(gòu)建ASO探針和PCR引物庫(kù)的方法。
[0018]圖1A示本發(fā)明構(gòu)建HLA基因型鑒定的寡核苷酸探針庫(kù)的方法。[0019]圖2示利用本發(fā)明的方法所獲得的HLA-DQB基因型ASO檢測(cè)結(jié)果。
[0020]圖3示利用本發(fā)明的方法所獲得的HLA-DPBl基因型ASO檢測(cè)結(jié)果。
[0021]圖4示某樣本的HLA-DRB和DQB基因型鑒定結(jié)果。
[0022]圖5示某樣本的HLA-DPB基因型鑒定結(jié)果。
[0023]圖6示本發(fā)明中用于高通量分析的膜。
[0024]圖7示本發(fā)明中雜交裝置的分解視圖，以及連接到中央控制單元的多個(gè)側(cè)向?qū)Я鳈z測(cè)裝置。在一個(gè)實(shí)施例中，雜交裝置包括一個(gè)中央控制單元，和連接到中央控制單元的一個(gè)或多個(gè)側(cè)向液流裝置。中央控制單元提供電源并控制側(cè)向液流裝置，雜交和顯影都在液流裝置中進(jìn)行。多個(gè)反應(yīng)(或多個(gè)樣品或分析物)可以同時(shí)在一個(gè)單一的側(cè)向液流裝置進(jìn)行測(cè)試，也可以同時(shí)在幾個(gè)裝置(每個(gè)單獨(dú)控制在不同的條件下)進(jìn)行。側(cè)向液流裝置可以是nXm的點(diǎn)陣(排列)格式或線性點(diǎn)陣形式(如圖所示)。由于在反應(yīng)過(guò)程中，測(cè)試溶液從點(diǎn)陣的一端流至另一端(即從東到西或者由北向南的方向)，檢測(cè)的靈敏度顯著增加。靈敏度的增加程度取決于膜的面積和含有捕獲探針的斑點(diǎn)或線的區(qū)域面積的比率。例如，假設(shè)的總面積是100平方毫米，斑點(diǎn)大小為I平方毫米。在直接導(dǎo)流過(guò)程中(即與常規(guī)流動(dòng)過(guò)程一樣，溶液從膜的頂部流動(dòng)到膜的底部)，所使用的試驗(yàn)溶液僅有1/100會(huì)流經(jīng)該點(diǎn)，而只有在該點(diǎn)目標(biāo)分子才能與固定于膜上的探針結(jié)合。然而，如果使用側(cè)向?qū)Я鬟^(guò)程，靈敏度僅依賴于點(diǎn)的寬度和膜的寬度的比率(如膜的橫截面)。例如，在一個(gè)側(cè)向?qū)Я鬟^(guò)程中，10毫米X 10毫米的膜上，從I毫米寬的點(diǎn)上流過(guò)的液體體積將是總量的約1/10，這意味著使用相同量的目標(biāo)分析物(含有目標(biāo)分子的試驗(yàn)溶液)，靈敏度有10倍的增加。當(dāng)線性點(diǎn)陣被使用在側(cè)向?qū)Я鬟^(guò)程 中，靈敏度將進(jìn)一步提高，因?yàn)樗械哪繕?biāo)分子都將通過(guò)沿條帶(或膜)分布的線。側(cè)向?qū)Я鬟^(guò)程允許定量測(cè)量，因?yàn)樵陔s交過(guò)程中待分析物的流動(dòng)更加均勻。
[0025]圖8示本發(fā)明用于構(gòu)造SNP數(shù)據(jù)庫(kù)的方法。
[0026]圖9示使用SNP基因型鑒定人或生物體樣本的數(shù)據(jù)。
[0027]圖10示圖8方法中使用的基因位點(diǎn)。
[0028]圖11示一個(gè)中國(guó)人群樣本中HLA-DPBl基因型鑒定結(jié)果(表1)。
[0029]圖12示一個(gè)中國(guó)人群樣本中HLA-DPBl等位基因和基因型頻率(表2)。
[0030]圖13示鑒定HLA各基因型的ASO寡核苷酸探針序列，和擴(kuò)增相應(yīng)片段進(jìn)行分析的PCR引物對(duì)序列。
[0031]圖14示鑒定HPV各基因型的寡核苷酸探針序列，和擴(kuò)增相應(yīng)LI片段進(jìn)行分析的PCR引物對(duì)序列。“+A”表示腺嘌呤鎖核酸，“+T”表示胸腺嘧啶鎖核酸。
[0032]圖15示HPV感染中HPV-33基因型鑒定陣列的典型影像。
[0033]圖16示HPV感染中HR-HPV-14基因型鑒定陣列的典型影像。
[0034]圖17示改進(jìn)的HPV檢測(cè)試劑盒簡(jiǎn)化篩查形式，以降低成本和提高通量。
[0035]圖18示其他改進(jìn)的HPV檢測(cè)試劑盒簡(jiǎn)化篩查形式，以降低成本和提高通量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0036]本發(fā)明使用下列術(shù)語(yǔ)描述。如果未在此處闡述具體定義，描述本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)均為本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員所理解的通用意思。[0037]本處所用“等位基因特異性寡核苷酸反相斑點(diǎn)印跡(ASO-RDB) ”是指將等位基因特異的寡核苷酸探針固定在固體基質(zhì)表面，在雜交過(guò)程中捕獲待檢測(cè)的目標(biāo)分子。
[0038]本處所用“導(dǎo)流雜交”是指利用美國(guó)專利編號(hào)5741647中所描述技術(shù)進(jìn)行的雜交過(guò)程。
[0039]本處所用“導(dǎo)流雜交裝置”或“導(dǎo)流裝置”指的是在美國(guó)專利編號(hào)6020187中所描述的設(shè)備和/或圖5中所示的側(cè)向液流裝置，或隨后設(shè)計(jì)的任何導(dǎo)流裝置。
HLA基因型鑒定
[0040]下列文字描述了本發(fā)明從基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得HLA分型的ASO探針和PCR引物，并用于HLA基因型鑒定分析的方法。
選擇合適的基因片段并確定適當(dāng)?shù)腜CR引物和ASO位點(diǎn)
[0041]通過(guò)從GenBank中篩選，或?qū)Π谢蚧駾NA片段測(cè)序進(jìn)行人群篩選，得到適合HLA基因型鑒定的SNP或ASO。
[0042]本發(fā)明中用于選擇適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)序列的方法詳述如下:
[0043](a)按各自的分類(lèi)(I類(lèi)、II類(lèi))和亞型(如DR、DQ和DP等)從GenBank中找出所有HLA DNA序列的數(shù)據(jù)。根據(jù)個(gè)自的分類(lèi)和亞型對(duì)HLA DNA序列進(jìn)行比對(duì)，以確定最具多態(tài)性的區(qū)域，用于HLA基因型鑒定。
[0044](b)在多態(tài)性區(qū)域內(nèi)，確定PCR引物對(duì)能夠匹配所感興趣的亞型中的保守序列，從而當(dāng)使用這些引物時(shí)，所有感興趣的亞型都可以擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，用于進(jìn)一步的導(dǎo)流雜交分析。
[0045](C)為驗(yàn)證這些引物的適用性，大量隨機(jī)樣本被用于PCR擴(kuò)增，以獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上該待查區(qū)域陽(yáng)性擴(kuò)增的滿意結(jié)果，并確保沒(méi)有由于假陰性擴(kuò)增結(jié)果排除任何等位基因。除了統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)，驗(yàn)證時(shí)也包含內(nèi)部對(duì)照(IC)，以確保測(cè)試樣品中不存在任何PCR抑制劑，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增反應(yīng)失敗。內(nèi)部對(duì)照的設(shè)計(jì)(可以是I個(gè)或多個(gè))將取決于測(cè)試需要。利用HLA和SNP指紋圖譜以及基因型鑒定確定遺傳性疾病時(shí)，內(nèi)部對(duì)照的序列不能和待查的人基因組存在同源性，也就是說(shuō)，使用一個(gè)和待查序列完全無(wú)關(guān)的序列。由于人體細(xì)胞大多是二倍體的基因組(胚系細(xì)胞除外)，濃度問(wèn)題相對(duì)非常簡(jiǎn)單，因?yàn)槔碚撋蠝y(cè)試位點(diǎn)的濃度或者是1(純合子)或者是0.5(雜合子)。因此，兩個(gè)序列不同而兩側(cè)具有相同PCR引物序列的片段即可作為內(nèi)部對(duì)照。這是指，使用不同于待分析靶片段的片段作為內(nèi)部對(duì)照時(shí)，可以選擇該片段內(nèi)部位點(diǎn)已知為純合或雜合的序列作為探針，即該片段中有兩個(gè)不同的探針(純和探針和雜合探針)，這樣使得這些內(nèi)部對(duì)照的濃度比可以計(jì)算出來(lái)。由于PCR擴(kuò)增不影響相對(duì)濃度，理論上信號(hào)的比值為2:1。比例上如果發(fā)生任何波動(dòng)將被視作雜交效率的變化。以這兩個(gè)比例為2:1的內(nèi)部對(duì)照作為標(biāo)準(zhǔn)，分別指示待查位點(diǎn)為純合子和雜合子。如果所觀察到的結(jié)果表明只有一個(gè)等位基因，但待查濃度等于或小于0.5倍純合子內(nèi)部對(duì)照，或與雜合子內(nèi)部對(duì)照比例接近1，此時(shí)應(yīng)調(diào)查雜合性丟失的可能性:可能是兩個(gè)染色體其中之一丟失或不能擴(kuò)增。純合子由于兩個(gè)染色體是相同的，其印記點(diǎn)的預(yù)期結(jié)果應(yīng)該是濃度接近純合子內(nèi)部對(duì)照，而不是雜合子內(nèi)部對(duì)照。因此，內(nèi)部對(duì)照對(duì)于獲得精確的結(jié)果非常重要，因?yàn)榕R床上可靠的結(jié)果對(duì)任何診斷測(cè)試都至關(guān)重要。
[0046] 關(guān)于DNA數(shù)據(jù)庫(kù)和序列比對(duì)的進(jìn)一步信息可以在本申請(qǐng)的參考資料部分找到(見(jiàn)參考文獻(xiàn)5和6)。[0047]這里所描述HLA基因型鑒定的程序，均可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在學(xué)習(xí)閱讀本申請(qǐng)材料后，用于其他基因或感興趣的DNA序列的基因型鑒定，或用于結(jié)合導(dǎo)流雜交過(guò)程來(lái)確定DNA指紋/識(shí)別的SNP檢測(cè)。
[0048]為最大限度地提高PCR擴(kuò)增的效率，通常選擇的ASO探針的片段長(zhǎng)度保持盡可能短，最好不超過(guò)幾百個(gè)堿基對(duì)。
[0049]在開(kāi)發(fā)基因型鑒定測(cè)試的過(guò)程中，如果找不到合適的引物對(duì)，可對(duì)PCR反應(yīng)組分以及PCR擴(kuò)增過(guò)程，即PCR程序進(jìn)行調(diào)整，通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化來(lái)確保產(chǎn)物得到擴(kuò)增。這樣的改進(jìn)對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在學(xué)習(xí)閱讀本申請(qǐng)材料后是顯而易見(jiàn)的。在某些情況下，如果無(wú)法使用序列完全保守的PCR引物，可以使用具有相同識(shí)別位點(diǎn)的簡(jiǎn)并引物或多個(gè)引物。在這樣的情況下，應(yīng)該對(duì)PCR條件作出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以確保不會(huì)錯(cuò)過(guò)任何位點(diǎn)。
[0050]如果不能找到成功區(qū)分亞型的獨(dú)特區(qū)域時(shí)，可以使用多重PCR。設(shè)計(jì)引物時(shí)，引物的Tm值要保證擴(kuò)增過(guò)程中的退火溫度在可操作范圍內(nèi)。此處所述“Tm值”是指，例如，雙鏈和單鏈的DNA分子濃度相等時(shí)的反應(yīng)溫度。因此，在較高的溫度下更多的雙鏈DNA解離成為單鏈，與此相反，在較低溫度下，更多的單鏈分子將退火形成雙鏈。對(duì)于一個(gè)序列數(shù)據(jù)未知的人群，通常通過(guò)直接DNA測(cè)序進(jìn)行人群篩查。例如，對(duì)一個(gè)中國(guó)人群樣本的篩查進(jìn)行如下:(a)從超過(guò)一百個(gè)受試者隨機(jī)取樣，使用2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后使用ASO探針進(jìn)行雜交，探針設(shè)計(jì)在下面章節(jié)描述；(b)DNA測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果。
[0051]使用上述得到的數(shù)據(jù)，確定和選擇被用于基因型鑒定的ASO位點(diǎn)。從GenBank或隨機(jī)樣本測(cè)序得到的數(shù)據(jù)中，判斷用于抽樣人群的HLA分型的位點(diǎn)選擇是否的確為獨(dú)特的。ASO探針的設(shè)計(jì)和獨(dú)特性驗(yàn)證方法如下:
[0052](a)從亞型的序列比對(duì)中選擇滿意的多態(tài)性區(qū)域，進(jìn)一步搜索得到具有獨(dú)特性的20-30的核苷酸序列或片段。這樣的獨(dú)特性序列或片段將被用作等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針，通過(guò)雜交過(guò)程捕獲已擴(kuò)增的靶片段，從而檢測(cè)到各獨(dú)特的HLA亞型的存在。此處“獨(dú)特的序列或片段”是指，例如，在這些亞型序列中，與該序列或片段完全同源的亞型序列只有一個(gè)。
[0053](b)為了驗(yàn)證ASO探針是獨(dú)特的，將序列與GenBank中或歐洲的類(lèi)似數(shù)據(jù)庫(kù)中所有人類(lèi)的DNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，以確定ASO探針是否的確是只100%匹配感興趣的HLA亞型。這將確保至少在現(xiàn)有的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上一直到新的序列發(fā)現(xiàn)前一ASO探針是該區(qū)域內(nèi)特有的。
[0054](c)由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度要短，以提高擴(kuò)增效率，單一 ASO探針可能不足以提供明確的結(jié)論以區(qū)分各獨(dú)特亞型。因此，在同一 PCR片段和/或使用多重PCR生成的不同片段中，有必要運(yùn)用多個(gè)ASO探針給出一個(gè)明確的基因型分類(lèi)。在這種情況下，每一個(gè)給定的HLA亞型，將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)特的雜交譜圖。經(jīng)過(guò)深入的數(shù)據(jù)分析之后,ASO序列使用隨機(jī)的人類(lèi)DNA樣本進(jìn)行驗(yàn)證。
[0055]最終決定了使用的ASO捕獲探針數(shù)量后，各基因型的點(diǎn)陣圖譜將被確定。圖2和圖3顯示的是特異性點(diǎn)陣圖譜的例子。圖2和圖3所示的點(diǎn)陣圖譜是用于測(cè)定HLA DRB、DQB和DPB亞型，分別使用了 18個(gè)ASO探針和35個(gè)ASO探針。
[0056]類(lèi)似的步驟可以用于其他的基因和來(lái)自其它有機(jī)體的遺傳物質(zhì)。針對(duì)不同基因和不同應(yīng)用，引物序列和ASO探針數(shù)目會(huì)有所變化。例如，人類(lèi)身份識(shí)別可能需要50個(gè)或更多的ASO點(diǎn)陣以獲得明確的識(shí)別(參見(jiàn)圖3和圖4)。檢測(cè)形式可以包括一列點(diǎn)或線，取決于導(dǎo)流雜交裝置的構(gòu)造。
講行ASO-RDB檢測(cè)
[0057]ASO寡核苷酸被固定在膜或任何合適的基質(zhì)上，用于捕獲目標(biāo)位點(diǎn)。此處“膜”是指，例如，任何合適的基質(zhì)材料，能夠固定ASO寡核苷酸探針，并且多孔以利于含有靶核酸分子的溶液自由通過(guò)。在一個(gè)實(shí)施例中，膜或基質(zhì)可以是尼龍、硝酸纖維素、Biodyne、Porex、多孔金屬或耐用凝膠基質(zhì)。
[0058]靶序列(或位點(diǎn))的固定可以通過(guò)共價(jià)鍵、非共價(jià)鍵(即靜電吸引、疏水作用或其他的相互作用包括紫外線交聯(lián))，或通過(guò)介導(dǎo)物，如受體或抗體)的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。圖2和3中顯示的是Biodyne C膜，利用EDC在膜的羧基端和修飾后ASO探針的氨基端之間形成共價(jià)鍵。親和素-生物素連接或ASO的多聚T尾部紫外交聯(lián)也同樣有效。
[0059]使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，以生成足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)滿足分析需要。目標(biāo)分子可以根據(jù)最終的信號(hào)檢測(cè)方法，進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記以產(chǎn)生足夠的信號(hào)。標(biāo)記過(guò)程可以通過(guò)引物進(jìn)行，在一個(gè)或兩個(gè)引物5’末端共價(jià)結(jié)合上標(biāo)記分子，或者在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，用標(biāo)記的核苷酸代替四種dNTP核苷酸中的其中一種，使新延伸得到的擴(kuò)增產(chǎn)物被標(biāo)記。標(biāo)記物可以是任何信號(hào)可以被檢測(cè)到并顯色的分子。生物素聯(lián)合親和素標(biāo)記的酶可用于顏色檢測(cè)。其它合適的標(biāo)記系統(tǒng)包括(但不僅限于)膠體金和熒光標(biāo)記、磁珠結(jié)合物、量子點(diǎn)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記分子，或其它已經(jīng)開(kāi)發(fā)的或待開(kāi)發(fā)的適合的系統(tǒng)也可以被應(yīng)用。
[0060]ASO分析使用美國(guó)專利編號(hào)5741647描述的導(dǎo)流雜交方法進(jìn)行。雜交在雜交室中進(jìn)行，ASO捕獲探針交聯(lián)在膜上。ASO分析方法如下所述: [0061 ] (a)將含有靶DNA或序列的溶液變性并與膜接觸；
[0062](b)用洗滌溶液(或者SSC，或封閉溶液)洗滌膜，最好三次；
[0063](c)顯色，并目視檢測(cè)或光譜測(cè)量。對(duì)于定量測(cè)量，可以使用掃描儀和圖像處理軟件來(lái)分析。另外，目標(biāo)DNA或序列可以用熒光染料標(biāo)記，并在洗滌步驟之后立即使用光譜成像儀分析。
[0064]結(jié)果與已知序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以確保基因型檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
[0065]探針和測(cè)試條件進(jìn)一步優(yōu)化，以提高基因型鑒定的準(zhǔn)確性，并通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證RDB-ASO 數(shù)據(jù)。
駘證
[0066]使用隨機(jī)樣本進(jìn)行驗(yàn)證。本發(fā)明的一個(gè)驗(yàn)證步驟描述如下:
[0067]如上文所述，一旦ASO的捕獲探針被固定在膜上，足夠數(shù)量的隨機(jī)DNA樣品被用來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。靶序列或擴(kuò)增并標(biāo)記的DNA產(chǎn)物/分子被雜交以生成一個(gè)ASO點(diǎn)陣圖譜。
[0068]HLA亞型和相應(yīng)的DNA序列由ASO探針確定。相應(yīng)的PCR樣品被制備用于DNA直接測(cè)序。HLA基因型檢測(cè)的驗(yàn)證，需要DNA測(cè)序的結(jié)果和導(dǎo)流陣列的結(jié)果相符。用于基因型檢測(cè)驗(yàn)證的樣品可以從任何隨機(jī)選擇的個(gè)體獲得。一旦獲得樣品，真正的基因型鑒定可以如第3.5節(jié)中所述，經(jīng)DNA測(cè)序進(jìn)行。如果測(cè)序數(shù)據(jù)與從導(dǎo)流陣列得到的數(shù)據(jù)一致，數(shù)據(jù)的有效性即被確認(rèn)?；蛐蜋z測(cè)的進(jìn)一步驗(yàn)證可以通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試進(jìn)行，如隨機(jī)抽樣測(cè)試，數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，如靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值或陰性預(yù)測(cè)值，以上均由獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，以評(píng)估基因型檢測(cè)的準(zhǔn)確性。SNP基因型鑒定
[0069]下面是本發(fā)明用于構(gòu)建SNP數(shù)據(jù)庫(kù)和開(kāi)發(fā)SNP基因型檢測(cè)的方法。
選擇SNP位點(diǎn)并確定排除概率
[0070]此處“排除概率”是指，比如區(qū)分人或有機(jī)體方法的準(zhǔn)確性。例如，排除概率為100億或1000億分之一是指:當(dāng)使用選定數(shù)目的SNP位點(diǎn)，分別需要篩查100億或1000億個(gè)體才可以找到兩個(gè)完全相同的個(gè)體。
[0071]選擇SNP位點(diǎn)并確定排除概率。此處“排除概率”是指，比如區(qū)分人或有機(jī)體方法的準(zhǔn)確性。例如，排除概率為100億或1000億分之一是指:當(dāng)使用選定數(shù)目的SNP位點(diǎn)，分別需要篩查100億或1000億個(gè)體才可以找到兩個(gè)完全相同的個(gè)體。
[0072]選擇適當(dāng)?shù)腟NP寡核苷酸探針，以捕獲特定的待分析靶序列，既可以通過(guò)從GenBank中篩選數(shù)據(jù)得到，也可以進(jìn)行群體篩查，比如:靶基因或靶DNA片段的DNA直接測(cè)序，從而獲得SNP /[目息和在群體中的頻率。
[0073]從這些數(shù)據(jù)中，按照多態(tài)性頻率，確定要用于指紋檢測(cè)的SNP位點(diǎn)，并確定所選位點(diǎn)在這個(gè)群體中是否為突變熱點(diǎn)，這可以通過(guò)群體中隨機(jī)樣本的測(cè)序來(lái)確定。確定所需要的SNP探針的數(shù)量，并計(jì)算總的雜合率以確定分析所用SNP位點(diǎn)的排除概率(即圖9所示SNP點(diǎn)陣列)。
[0074]排除概率取決于在該位點(diǎn)上的SNP數(shù)量。例如,在一個(gè)指定的位點(diǎn),如果有2個(gè)不同的堿基，例如G和A，發(fā)現(xiàn)在某個(gè)取樣群體中各占50%。這樣的概率是1/2。如果可以找到50個(gè)這樣的位點(diǎn)(這些位點(diǎn)是隨機(jī)分布的，在染色體上不相互連鎖)，那么區(qū)分概率將是1/2的50次方。
進(jìn)行SNP圖譜檢測(cè)(SNP點(diǎn)陣組合顯示個(gè)體各位點(diǎn)相應(yīng)的基因型組成)
[0075]設(shè)計(jì)合適的引物進(jìn)行擴(kuò)增，如上所述，篩查并確定位點(diǎn)后，再選擇適當(dāng)?shù)腟NP探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。
[0076]擴(kuò)增靶序列，通過(guò)導(dǎo)流雜交過(guò)程分析SNP圖譜，方法如美國(guó)專利編號(hào)5741647所描述。
[0077]將上述獲得的數(shù)據(jù)與已知序列數(shù)據(jù)比較，來(lái)評(píng)估SNP基因型鑒定分析的準(zhǔn)確性。
[0078]優(yōu)化SNP探針和測(cè)試條件，以提高SNP基因型鑒定分析的精確性。RDB SNP數(shù)據(jù)通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。
[0079]用隨機(jī)樣本進(jìn)行方法驗(yàn)證。
HPV基因型鑒定
[0080]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種快速鑒定人乳頭狀瘤病毒(HPV)基因型的方法。此處公開(kāi)的發(fā)明也可以應(yīng)用于篩查和檢測(cè)其他的病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)或其它病原體。例如，本發(fā)明可用于結(jié)核病、乙型肝炎、丙型肝炎、傳染性非典型肺炎和呼吸道感染病毒(單獨(dú)的或組合的)的基因型鑒定。
[0081]在一個(gè)實(shí)施例中，快速檢測(cè)人乳頭狀瘤病毒(HPV)的方法包括以下步驟:(a)獲得含有核酸模板的樣品；(b)用序列號(hào)116-118的引物擴(kuò)增模板核酸，得到HPV LI的擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)HPV LI擴(kuò)增產(chǎn)物與固定的寡核苷酸探針雜交，探針選自序列號(hào)121-173組成的探針組，雜交結(jié)果將提示HPV病毒是否存在，其中包括高風(fēng)險(xiǎn)(HR) HPV病毒和低風(fēng)險(xiǎn)(LR) HPV病毒。在一個(gè)實(shí)施例中，引物含有一個(gè)信號(hào)標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施例中，引物中進(jìn)一步包括了與內(nèi)部對(duì)照互補(bǔ)的引物(例如，含有序列號(hào)為119-120的引物)。在又一個(gè)實(shí)施例中，寡核苷酸探針進(jìn)一步包括能夠捕獲通用HPV病毒DNA的探針(例如，探針具有序列號(hào)為170-173的序列)，其中所述的探針包括鎖核酸(LNA+iil)。在本發(fā)明中，使用LNA+?.-修飾的核苷酸能夠增加用于HPV檢測(cè)的寡核苷酸探針的熱穩(wěn)定性和靶特異性。
[0082]在一個(gè)實(shí)施例中，HPVLl的擴(kuò)增產(chǎn)物與多個(gè)固定的寡核苷酸探針雜交是在一個(gè)導(dǎo)流過(guò)程或側(cè)向?qū)Я鬟^(guò)程中進(jìn)行。在一個(gè)導(dǎo)流過(guò)程的實(shí)施例中，雜交的靈敏度取決于探針?biāo)嫉拿娣e與點(diǎn)陣所用膜的總面積的比率。在側(cè)向?qū)Я鬟^(guò)程的一個(gè)實(shí)施例中，雜交的靈敏度取決于流動(dòng)方向上探針?biāo)嫉臋M截面積與膜的總橫截面積的比率。
[0083]在一個(gè)實(shí)施例中，上述方法可以檢測(cè)下列的一個(gè)或多個(gè)HPV基因型:HPV6，11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70，71，72，73，81，82和8LHPV基因型可被單獨(dú)檢測(cè)，或者集合到一個(gè)或多個(gè)組中進(jìn)行檢測(cè)(例如，參見(jiàn)圖15-18)。在一個(gè)實(shí)施例中，HPV16和18可被分別檢測(cè)，而HPV31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，73，82可被集合到一個(gè)或多個(gè)組中進(jìn)行檢測(cè)(參見(jiàn)圖16-18)，例如:HPV31,33，35，39可作為一組被檢測(cè)，HPV45，51，52，56作為第二組，HPV58，59，73，82作為第三組。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法可以進(jìn)一步在一個(gè)或多個(gè)組中檢測(cè)HPV6，11，26，40，42，43，44，53，54，55，57，61，66，70，71，72，73，81 和 84 (參見(jiàn)圖 18 中的示例)。
[0084]本發(fā)明還提供了進(jìn)行人乳頭狀瘤病毒(HPV)基因型鑒定的試劑盒，其中包括序列號(hào)為116-118的引物和選自序列121-173的寡核苷酸探針。在一個(gè)實(shí)施例中，引物進(jìn)一步包括信號(hào)標(biāo)記。在另一實(shí)施例中，引物中更進(jìn)一步包括了與內(nèi)部對(duì)照互補(bǔ)的引物(例如，含有序列號(hào)為119-120的引物)。在又一實(shí)施例中，寡核苷酸探針還進(jìn)一步包括能夠捕獲通用HPV病毒DNA的探針(例如，探針具有序列號(hào)為170-173的序列)。在一個(gè)實(shí)施例中，該試劑盒可以檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)下列的HPV基因型:HPV6,11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70，71，72，73，81，82，和 84。HPV 基因型可被分別檢測(cè)，或者集合到一個(gè)或多個(gè)組中進(jìn)行檢測(cè)(參見(jiàn)圖15-18中示例)。
[0085]通過(guò)參考下面的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，本發(fā)明將會(huì)更容易被理解。本領(lǐng)域的專業(yè)人員將容易理解，具體的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)只是用作說(shuō)明的，并不意味著本發(fā)明只是局限于如下所示，這在后面的聲明中會(huì)有準(zhǔn)確解釋。
[0086]本申請(qǐng)中引用了多種參考文獻(xiàn)或出版物。這些參考文獻(xiàn)或出版物的完整公開(kāi)內(nèi)容作為參考并入本申請(qǐng)中，以更加充分地描述本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的狀態(tài)。需要注意的是，過(guò)渡詞“包含”與“包括”、“含有”或“特點(diǎn)在于”是同義詞，是包羅廣泛，沒(méi)有固定限度的，并不排除額外的，沒(méi)有被引用的原理或方法步驟。
實(shí)施例1 測(cè)試程序 DNA提取
[0087]推薦如下的實(shí)驗(yàn)方案，但也可以采用對(duì)在本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的并同樣有效的替 代方案。取有核細(xì)胞如白血細(xì)胞或組織，用PBS洗滌，離心，棄去上清。將細(xì)胞沉淀重新懸浮在200微升的PBS中。用QIAamp DNA mini試劑盒(QIAGEN)，按生產(chǎn)商推薦的“血液和體液離心實(shí)驗(yàn)方案”抽提DNA。其他市售用于分離DNA的試劑盒，也可以使用。但是，DNA的提取過(guò)程不能在最后提純的DNA中摻雜有DNA聚合酶抑制劑，這對(duì)于確保有效的擴(kuò)增至關(guān)重要。將DNA洗脫在50-200微升AE緩沖液中，并存儲(chǔ)于_20°C備用。
PCR擴(kuò)增
[0088]由于PCR擴(kuò)增是極度敏感的過(guò)程，必須特別小心以防止交叉污染或假陽(yáng)性結(jié)果。因此，必須遵守以下準(zhǔn)則:PCR過(guò)程中須一直戴手術(shù)手套，最好在“前PCR”區(qū)域或干凈的沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR準(zhǔn)備臺(tái)，制備PCR反應(yīng)混合物；PCR反應(yīng)和雜交應(yīng)在不同的區(qū)域進(jìn)行，例如，雜交應(yīng)在“后PCR”區(qū)域進(jìn)行。
[0089]使用70%乙醇和紙巾清潔工作臺(tái)或工作區(qū)域。在開(kāi)始PCR擴(kuò)增前，用70%乙醇和紙巾清潔所有的移液器。所有移液步驟均使用過(guò)濾/無(wú)菌槍頭，不重復(fù)使用槍頭。
[0090]PCR只是許多可用于擴(kuò)增的技術(shù)之一。其他對(duì)在本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的擴(kuò)增技術(shù)也可以使用，如多種等溫?cái)U(kuò)增的方法，使用適當(dāng)?shù)囊飻U(kuò)增靶序列，以獲得足夠量的靶序列(或DNA分子)，用于導(dǎo)流點(diǎn)陣檢測(cè)。
[0091]PCR反應(yīng)使用市場(chǎng)上可買(mǎi)到的聚合酶，例如:AmpliTaq?:'Gold聚合酶(Applied Biosystem)。五對(duì)引物(I對(duì)用于擴(kuò)增DR基因，即:正向引物DRB-Fl:5’-ATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3’ [序列號(hào) 97]和反向引物 DRB-Rl:5’ -GCCGCTGCACTGTGAAGCTCTC-3’ [序列號(hào)98] ;1對(duì)用于擴(kuò)增DQ基因，即:正向引物 DQB-E2-F2:5’CGGTGATTCCCCGCAGAGGAT-3’ [序列號(hào) 99]和反向引物 DQB-E2-R2:5’ -CCACCTCGTAGTTGTGTCTGC-3’ [序列號(hào)100] ；3對(duì)用于擴(kuò)增DP基因，正向引物[序列號(hào)101-103]和反向引物[序列號(hào)[序列號(hào)104-106]在各自的5’-末端分別標(biāo)記有生物素。前面描述的其他合適的標(biāo)記方法也可以使用。在25微升的反應(yīng)體系中，PCR預(yù)制混合試劑制備如下(這個(gè)例子是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的一個(gè)特定程序。如果使用其他SNP的引物序列，必須優(yōu)化PCR和雜交的條件):
【權(quán)利要求】
1.一種用于人乳頭狀瘤病毒(HPV)基因型鑒定的試劑盒，其特征在于，包括序列號(hào)為 116-118 的引物和序列號(hào)為 123-125、127-133、140-145、148-149、151-153、156-158、170-173 的寡核苷酸探針，其中序列號(hào)為 123-125、127-133、140-145、148-149、151-153 和156-158 的探針對(duì)應(yīng)基因型為 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66 和 68 的HPV LI核酸序列，序列號(hào)為170-173的探針對(duì)應(yīng)HPV LI核酸的共有序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括一個(gè)與內(nèi)部對(duì)照互補(bǔ)的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述與內(nèi)部對(duì)照互補(bǔ)的引物的序列號(hào)為 119-120。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述引物包括信號(hào)生成標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒可以檢測(cè)出不同的HPV基因型，所述HPV基因型包含與序列號(hào)為170-173的探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的HPV LI核酸共有序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒可以檢測(cè)出的HPV基因型為HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66 和 68。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于，所述HPV基因型是分別檢測(cè)，或者集合到一個(gè)或多個(gè)組中檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，HPV基因型為16和18的HPV基因型是分別檢測(cè)，HPV基因型為31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68的HPV基因型集合到一個(gè)或多個(gè)組中進(jìn)行檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，HPV基因型為31、33、45、52和58的HPV基因型集合到一個(gè)組中進(jìn)行檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，HPV基因型為53、59、66和68的HPV基因型集合到一個(gè)組中進(jìn)行檢測(cè)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，HPV基因型為35、39、51和56的HPV基因型集合到一個(gè)組中進(jìn)行檢測(cè)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒是在一個(gè)導(dǎo)流過(guò)程或側(cè)向?qū)Я鬟^(guò)程中使用。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒是在一個(gè)導(dǎo)流過(guò)程中進(jìn)行，導(dǎo)流過(guò)程中含有不斷循環(huán)的目標(biāo)分析物溶液，從而增加檢測(cè)的敏感度。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104017908SQ201410305257
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2010年4月29日
【發(fā)明者】譚約瑟夫榮安, 周約瑟夫國(guó)輝, 陳里斯卓宇 申請(qǐng)人:達(dá)雅高生物科技有限公司