雜色曲霉sd-3及其在制備甲殼素脫乙酰酶中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株雜色曲霉(Aspergillus?versicolor)SD-3及其在制備甲殼素脫乙酰酶中的應用；本發(fā)明的雜色曲霉SD-3營養(yǎng)要求簡單、抗雜菌污染能力強、容易培養(yǎng)；雜色曲霉SD-3產(chǎn)生的甲殼素脫乙酰酶為胞外酶，分離除去菌體，即可獲得甲殼素脫乙酰酶粗酶液，粗酶液可以直接應用，制備工藝簡單；雜色曲霉SD-3產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶活性高，在優(yōu)選的條件下，未經(jīng)分離純化的粗酶液活力可達142.3U/mL；生產(chǎn)工藝不使用有毒有害原料，環(huán)保無污染。
【專利說明】雜色曲霉SD-3及其在制備甲殼素脫乙酰酶中的應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的雜色曲霉（Aspergillus versicolor) SD-3 及其制備甲殼素脫乙酰酶中的應用。 (二）

【背景技術】
[0002] 甲殼素，又稱幾丁質(zhì)（chitin)，是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖單體通過β -1，4-糖 苷鍵連接而成的多糖，廣泛存在于許多無脊椎動物（如蝦、蟹、昆蟲等）的外殼或角質(zhì)層，是 自然界中僅次于纖維素的天然多糖。甲殼素分子結(jié)構(gòu)因其分子內(nèi)部的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和很強的氫 鍵作用，很難溶于稀酸堿及一般的有機溶劑，因此應用范圍不廣。當甲殼素分子中的乙酰基 部分或全部脫除后，則形成殼聚糖（chitosan)，由于具有無毒、可被生物降解、良好的生物 相容性和成膜性等優(yōu)良特性，在醫(yī)藥、食品、化工、化妝品和生物醫(yī)學工程等諸多領域有著 廣泛的應用。
[0003] 甲殼素脫乙酰化生產(chǎn)殼聚糖的方法常見的有化學法和酶法，目前基本都是采用濃 堿熱解法生產(chǎn)。濃堿法反應過程不易控制，常常會影響到產(chǎn)品的粘度和分子量，且其排放的 污水對環(huán)境造成嚴重污染，殼聚糖產(chǎn)品的特性也存在不足，如脫乙酰度不均勻、分子量分布 范圍寬、乙?；诘奈恢貌荒芄潭ǖ?，使得產(chǎn)品的實際應用范圍有限。相比之下，利用酶 解法生產(chǎn)殼聚糖，既可以解決目前殼聚糖生產(chǎn)中的環(huán)境污染問題，又可以生產(chǎn)出高質(zhì)量的 殼聚糖產(chǎn)品，如乙酰化程度均勻、分子量分布范圍窄，以及具有特定乙?；恢玫臍ぞ酃烟?等，是一條既經(jīng)濟又行之有效的殼聚糖制備方法。
[0004] 酶法生產(chǎn)殼聚糖需要的酶是甲殼素脫乙酰酶（chitin deacetylase， E. C. 3. 5. 1. 41)，它是一種催化甲殼素中N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺的乙酰氨基水解的酶。甲 殼素脫乙酰酶來源廣泛，包括部分真菌、植物病原體和一些昆蟲等，其中以真菌最多，也是 獲得該酶的最佳來源。雖然目前國內(nèi)外對甲殼素脫乙酰酶的研究已經(jīng)相當廣泛和深入，甚 至已經(jīng)發(fā)展到了分子水平，但仍未見將其工業(yè)化生產(chǎn)并應用于殼聚糖生產(chǎn)的報道，工業(yè)化 應用研究亟待加強。
[0005] 我國沿海地區(qū)蝦蟹類加工業(yè)發(fā)達，現(xiàn)有數(shù)十家甲殼素的生產(chǎn)企業(yè)，目前對甲殼素 的進一步加工利用主要是通過高溫強堿脫乙酰生產(chǎn)殼聚糖，以及對殼聚糖進一步高溫強酸 水解生產(chǎn)殼寡糖和氨基葡萄糖。但是由于生產(chǎn)過程耗能大且產(chǎn)生大量廢液，導致產(chǎn)品能耗 高，環(huán)境污染嚴重，許多甲殼素加工企業(yè)也因污染嚴重，無力治污而面臨關閉。
[0006] 因此，摒棄污染大的生產(chǎn)工藝，利用綠色環(huán)保的酶解法來生產(chǎn)殼聚糖，是甲殼素生 產(chǎn)企業(yè)的必行之道。酶解法生產(chǎn)殼聚糖工藝過程并不復雜，但關鍵是要有酶活力高、活性穩(wěn) 定、價格低的甲殼素脫乙酰酶作保證。國內(nèi)外有不少報道關于采用微生物制備甲殼素脫乙 酰酶，但仍然存在微生物發(fā)酵周期長、酶活力低或發(fā)酵成本高等問題，至今未見產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn) 甲殼素脫乙酰酶的報道。即使有報道采用基因工程方法將甲殼素脫乙酰酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿 菌中表達，也未能產(chǎn)業(yè)化應用。因此，獲得產(chǎn)酶活力高、生長繁殖快、營養(yǎng)要求低的產(chǎn)甲殼素 脫乙酰酶微生物菌株，以及發(fā)酵工藝簡單、原料成本低等仍是該酶工業(yè)化應用的關鍵。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是提供一株甲殼素脫乙酰酶產(chǎn)生菌--雜色曲霉（Aspergillus versicolor) SD-3,及其在制備甲殼素脫乙酰酶中的應用，較好地克服現(xiàn)有微生物發(fā)酵生產(chǎn) 甲殼素脫乙酰酶的培養(yǎng)基成本高、發(fā)酵周期長和酶活性低的缺點，生產(chǎn)工藝具有成本低、工 藝簡單、效率高等優(yōu)點。
[0008] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0009] 本發(fā)明涉及一株甲殼素脫乙酰酶產(chǎn)生菌一雜色曲霉（Aspergillus versicolor) SD-3,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，430072,保藏編號： CCTCC NO :M 2013328 ;保藏日期：2013 年 7 月 11 日。
[0010] 本發(fā)明所述雜色曲霉SD-3,是由甲殼素混入土壤經(jīng)過自然富集和人工富集培養(yǎng)， 從富集培養(yǎng)物中分離和篩選得到的優(yōu)良野生菌株，再經(jīng)紫外線照射誘變處理和篩選獲得。
[0011] 所述雜色曲霉SD-3的形態(tài)學特征如下：涂布或劃線接種于馬鈴薯平板培養(yǎng)基上， 生長迅速，28°C下培養(yǎng)3?4天菌絲便長滿平板，并產(chǎn)生大量分生孢子。菌落呈絮狀，正面 灰綠色，反面黃褐色。分生孢子穗疏松放射狀，頂囊近球形或梨形；分生孢子梗雙層，無色， 表面光滑；分生孢子球形或近球形，褐色，表面粗糙。
[0012] 所述雜色曲霉SD-3的18s rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示：
[0013] GTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGGAG GGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCCTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGG CCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGC AACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCA GGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTA ATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATT CCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCC GCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAATCCCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGTGGAAC CAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAAT AGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTC AGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAA TCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGA TCGGGCGGCGTTTCTATGATGACCCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGT CGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACAC GGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATCTTTTGGATGGTGGTGC ATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCC GGTCCGCGTCCGCGGGCCGCTGGCTTCTTAGGGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTGCGAGGCAATAACAGGT CTGTGATGC
[0014] 本發(fā)明還涉及所述的雜色曲霉SD-3在微生物發(fā)酵制備甲殼素脫乙酰酶中的應 用，具體所述應用為：將雜色曲霉SD-3菌種孢子或經(jīng)過擴大培養(yǎng)的種子液接種至產(chǎn)酶培 養(yǎng)基中，28?32°C培養(yǎng)3?5天，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液經(jīng)過離心或過濾除去菌絲體，所得 上清液或濾液即為甲殼素脫乙酰酶粗酶液，將粗酶液分離提取，獲得甲殼素脫乙酰酶；所 述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成為：蔗糖5?10g/L，酵母浸出粉2?6g/L，（NH4)2S0 42?4g/L， K2HP041?2g/L，KH2P04l?2g/L，乙酸鈉1?3g/L，玉米漿（玉米漿是玉米淀粉生產(chǎn)中的一 種副產(chǎn)物，是配制微生物培養(yǎng)基的常用原料，市購）4?6mL/L，溶劑為自來水，pH4. 5?6. 5。
[0015] 進一步，所述種子液的體積接種量為5?10%。
[0016] 所述菌株在產(chǎn)酶培養(yǎng)前，通常需要先經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，或經(jīng)過種子擴大培 養(yǎng)，然后用孢子或種子液接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶發(fā)酵。
[0017] 具體的，所述活化、種子擴大培養(yǎng)、產(chǎn)酶培養(yǎng)和粗酶液的獲得步驟如下：
[0018] (1)將保藏的雜色曲霉SD-3菌種孢子接種于斜面或平板培養(yǎng)基，于28?32°C培 養(yǎng)2?3天，得到活化后的雜色曲霉菌種（即獲得雜色曲霉SD-3菌種孢子）。所述的每升 斜面或平板培養(yǎng)基制備方法為：馬鈴薯150?200g(馬鈴薯去皮切成小塊，加4?5倍質(zhì)量 體積的自來水煮沸20?30min，紗布過濾留汁液）、蔗糖10?20g、瓊脂15?20g，自來水 補足至1000mL，pH5. 0?6. 0,高壓蒸汽121°C滅菌20?30min。每升斜面或平板培養(yǎng)基組 成優(yōu)選：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，自來水1000mL，pH6. 0。
[0019] (2)將步驟（1)活化培養(yǎng)后雜色曲霉SD-3孢子接種至種子培養(yǎng)基中，于28? 32°C、150?250r/min振蕩條件下培養(yǎng)2?3天，得到種子液；所述每升種子培養(yǎng)基制備方 法為：鹿糖5?10g，酵母浸出粉2?6g，（NH 4)2S042?4g，K2HP041?2g，KH 2P041?2g，乙 酸鈉1?3g，玉米楽4?6mL，加自來水至1000mL，pH4. 5?6. 5,高壓蒸汽121°C滅菌20? 30min。種子培養(yǎng)基組成優(yōu)選為：蔗糖10g，酵母浸出粉6g，（NH4) 2S044g，K2HP042g，KH2P0 42g， 乙酸鈉3g，玉米楽6mL，加自來水至lOOOmL，pH6. 0。
[0020] (3)將步驟（1)的雜色曲霉SD-3孢子，或步驟⑵制備的種子液以5%?10%的 體積比移種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于28?32°C、150?250r/min振蕩培養(yǎng)3?4天，得到含甲 殼素脫乙酰酶的發(fā)酵液；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成同步驟（2)中的種子培養(yǎng)基。
[0021] 將步驟（3)含甲殼素脫乙酰酶的發(fā)酵液用4層紗布過濾，或者4000?6000r/min 離心5?10min，分離除去菌絲體，所得濾液或上清液即為甲殼素脫乙酰酶的粗酶液。所制 備的甲殼素脫乙酰酶粗酶液，可以直接應用于水解甲殼素制備殼聚糖，也可以保存于4°C冰 箱20天內(nèi)使用；也可以經(jīng)過冷凍干燥（_50°C )，制成粗酶粉保存于4°C冰箱長期使用。
[0022] 本發(fā)明以甲殼素為唯一碳源，經(jīng)過天然富集和人工富集培養(yǎng)，篩選獲得一株產(chǎn)甲 殼素脫乙酰酶活力較高的雜色曲霉野生菌株，經(jīng)過紫外誘變和篩選后，獲得一株產(chǎn)甲殼素 脫乙酰酶活性高、傳代穩(wěn)定的突變株，經(jīng)過產(chǎn)酶發(fā)酵工藝優(yōu)化后，在最優(yōu)的條件下，粗酶液 活力達到了 142. 3U/mL，較現(xiàn)有的技術相比，技術優(yōu)勢顯著，能夠大幅度降低酶的生產(chǎn)成本。
[0023] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：（1)本發(fā)明的雜色曲霉SD-3營養(yǎng)要求簡單、抗 雜菌污染能力強、容易培養(yǎng)；（2)雜色曲霉SD-3產(chǎn)生的甲殼素脫乙酰酶為胞外酶，分離除 去菌體，即可獲得甲殼素脫乙酰酶粗酶液，粗酶液可以直接應用，制備工藝簡單；（3)雜色 曲霉SD-3產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶活性高，在優(yōu)選的條件下，未經(jīng)分離純化的粗酶液活力可達 142. 3U/mL ; (4)生產(chǎn)工藝不使用有毒有害原料，環(huán)保無污染。 (四）【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶菌株平板篩選具變色圈的菌落照片；
[0025] 圖2雜色曲霉SD-3在平板培養(yǎng)基上的菌落照片。 (五）【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0027] 實施例1 :產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶微生物的富集、分離和篩選
[0028] 為了獲得產(chǎn)酶活力較高的菌株，首先對產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶微生物進行自然富集。 方法是：初夏季節(jié)，在花壇土壤中埋入粉碎的蟹殼，灑水保持土壤濕潤，2個月后采集此處 土壤樣品，作為甲殼素脫乙酰酶微生物的分離源。
[0029] 采集自然富集的土壤，再進行產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶微生物的人工培養(yǎng)富集，方法是： 250mL三角瓶中加入45mL富集培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌后加入5g上述土樣，三角瓶于28°C、200r/ min振蕩培養(yǎng)5天，取富集培養(yǎng)液5mL接種于另一只裝有45mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，重復 上述培養(yǎng)過程一次，使得能以甲殼素為唯一碳源生長的微生物數(shù)量增加。
[0030] 將上述富集培養(yǎng)液用無菌水稀釋后涂布于平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿于28°C的生化培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)至有變色圈的菌落出現(xiàn)。挑取顏色和形態(tài)不同的菌落用劃線法接種到另一塊篩 選平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)3天后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)3天，作進一步搖 瓶篩選。
[0031] 用接種環(huán)分別刮取各個菌株的新鮮斜面菌種孢子2環(huán)，接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C、 200r/min振蕩條件下發(fā)酵培養(yǎng)5天。發(fā)酵液于4500r/min、4°C條件下離心lOmin后，上清 液即為甲殼素脫乙酰酶粗酶液。
[0032] 測定不同菌株發(fā)酵所得粗酶液的甲殼素脫乙酰酶的活力，經(jīng)過比較，一株編號為 CR-3的菌株產(chǎn)酶活力最高，為41. 6U/mL。
[0033] 菌株CR-3形態(tài)學特征如下：涂布或劃線接種于馬鈴薯平板培養(yǎng)基上，生長迅速， 28°C下培養(yǎng)3?4天菌絲便長滿平板，并產(chǎn)生大量分生孢子。菌落呈絮狀，正面灰綠色，反 面黃褐色。分生孢子穗疏松放射狀，頂囊近球形或梨形；分生孢子梗雙層，無色，表面光滑； 分生孢子球形或近球形，褐色，表面粗糙。
[0034] 依據(jù)菌株CR-3菌落形態(tài)、菌絲大小和孢子形態(tài)初步判斷為曲霉（Aspergillus)， 采用18S rDNA序列分析方法對菌株CR-3進行鑒定，確定其為一株雜色曲霉（Aspergillus versicolor)，命名為雜色曲霉（Aspergillus versicolor)CR_3。
[0035] 所述的富集培養(yǎng)基組成為：甲殼素 2. 5g，K2HP040. 7g，KH2P040. 3g，MgS040. 5g， NaClO. 5g，加自來水至1000mL，pH6. 0,高壓蒸汽121°C滅菌20min。
[0036] 所述的篩選平板培養(yǎng)基組成為：甲殼素200g，Κ2ΗΡ040· 7g，ΚΗ2Ρ040· 3g，MgS040. 5g， NaClO. 5g，對硝基-N-乙酰苯胺0. 2g，瓊脂20g，加自來水至1000mL，pH6. 0,高壓蒸汽121°C 滅菌20min。
[0037] 所述的斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA)，組成為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂 2〇g，自來水l〇〇〇mL。制備方法為：將200g馬鈴薯去皮切碎，加自來水1000mL，煮沸30min 后用紗布過濾留汁，再加入20g蔗糖和20g瓊脂，補水至1000mL，pH6.0,高壓蒸汽121°C滅 菌 20min。
[0038] 所述的初始搖瓶篩選產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為：蔗糖5g，蛋白胨2. 5g，（NH4)2S042. 5g， K2HP04lg，KH2P04lg，乙酸鈉3g，玉米漿5mL，加自來水至1000mL，pH6.0,高壓蒸汽121°C滅菌 20min〇
[0039] 本發(fā)明中，測定甲殼素脫乙酰酶活力的方法是：比色管中加入50°C預保溫、濃度 為0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8. 0)3mL、200mg/L的對硝基-N-乙酰苯胺水溶液lmL 和用Tris-HCl緩沖液（ρΗ8· 0、0· 05mol/L)稀釋1?4倍的粗酶液lmL (依據(jù)酶的活力大小 情況，稀釋1-4倍，酶活低時不需要稀釋，酶活達到140U/mL以上是稀釋4倍），于50°C水浴 反應15min，沸水浴終止酶促反應，用蒸饋水定容至lOmL，搖勻，4000r/min離心lOmin ;以經(jīng) 沸水滅活相應粗酶液的相同處理作為參比，測定上清液在波長400nm處的吸光度。由測定 的吸光值，依據(jù)對硝基苯胺的濃度一吸光度標準曲線方程（Y = 〇. 0657X+0. 003，Y為400nm 處的吸光度，X為硝基苯胺的濃度）計算出反應體系中對硝基苯胺濃度，再按酶活力單位定 義計算出甲殼素脫乙酰酶的活力。
[0040] 甲殼素脫乙酰酶的酶活單位定義：在上述反應條件下每小時產(chǎn)生1 μ g對硝基苯 胺所需要的酶量（mL)定義為一個酶活力單位（U)。
[0041] 實施例2 :甲殼素脫乙酰酶高產(chǎn)菌株的誘變育種
[0042] 對實施例1篩選得到的野生雜色曲霉CR-3菌株用紫外線照射誘變，篩選產(chǎn)甲殼素 脫乙酰酶活力有所提高的突變菌株。
[0043] 紫外線照射誘變方法：將菌株CR-3斜面菌種活化培養(yǎng)后，刮取孢子到含50mL無 菌生理鹽水的三角瓶中，室溫振蕩30min，漏斗頸部放一棉花團過濾孢子懸液。在顯微鏡 下用血球計數(shù)板對懸液中的孢子計數(shù)，用無菌生理鹽水做適當倍數(shù)稀釋，控制孢子數(shù)量在 1 X 108個/mL左右。在紅光下，取2mL上述孢子懸液和一枚無菌回形針至直徑6cm的培養(yǎng) 皿中，將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，在預熱20min的紫外燈下分別照射1?5min。取0. 5mL 上述照射處理后的孢子液，作適當倍數(shù)稀釋后分別移取0. 2mL涂布平板。以同樣操作，做未 經(jīng)紫外線照射的孢子液稀釋涂平板作為對照，以計算致死率。用黑布包裹所有培養(yǎng)皿，28°C 培養(yǎng)3天，對平板上的菌落進行計數(shù)，計算致死率。挑取致死率在90%以上經(jīng)紫外線照射處 理后長出的菌落轉(zhuǎn)接斜面，按實施例1所述的方法，對突變菌株進行篩選。
[0044] 對野生雜色曲霉CR-3菌株進行了紫外照射誘變后，經(jīng)過篩選，獲得產(chǎn)酶活力顯著 提高的菌株SD-3,酶活達到78. 3U/mL，較用野生菌株提高了 88. 2%。SD-3菌株經(jīng)過轉(zhuǎn)接傳 代5次，酶活力波動范圍小于10%，說明該菌株產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶遺傳穩(wěn)定性良好。將菌株 SD-3命名為雜色曲霉（Aspergillus versicolor) SD-3,并提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保 藏，編號：CCTCC No :M2013328,保藏日期：2013年7月11日。
[0045] 紫外線照射野生菌株誘變育種的條件為：紫外照射功率為15W，照射距離為30cm， 照射時間為3?4min。
[0046] 所述的平板培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成均與實施例1相同。
[0047] 實施例3 :雜色曲霉SD-3發(fā)酵制備甲殼素脫乙酰酶的方法1
[0048] 以雜色曲霉SD-3為菌種，不經(jīng)種子擴大培養(yǎng)，在50mL搖瓶規(guī)模下制備甲殼素脫乙 酰酶的方法如下：
[0049] (1)將試管斜面保藏的雜色曲霉SD-3菌種接種于斜面培養(yǎng)基，斜面于28°C生化培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。所述的斜面培養(yǎng)基組成及制備方法同實施例1。
[0050] (2)用接種環(huán)刮取步驟⑴活化培養(yǎng)后雜色曲霉SD-3孢子接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基， 28°C、150r/min振蕩條件下培養(yǎng)5天，得到含甲殼素脫乙酰酶的發(fā)酵液；所述的產(chǎn)酶培養(yǎng) 基組成為：鹿糖5g，酵母浸出粉2. 5g，（NH4)2S042. 5g，K2HP04lg，KH2P04lg，乙酸鈉 lg，玉米漿 4mL，加自來水至lOOOmL，pH5. 0。250mL的三角瓶裝50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，八層紗布扎口，高壓 蒸汽121°C滅菌30min。
[0051] (3)將步驟⑵的含甲殼素脫乙酰酶發(fā)酵液于5000r/min、4°C條件下離心5min，傾 倒出上層清液，棄去沉淀物，所得清液即為甲殼素脫乙酰酶粗酶液，酶活力達到81. 2U/mL。
[0052] 實施例4 :雜色曲霉SD-3發(fā)酵制備甲殼素脫乙酰酶的方法2
[0053] 以雜色曲霉SD-3為菌種，經(jīng)過種子制備方法、產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件優(yōu)化 后，在50mL搖瓶規(guī)模下制備甲殼素脫乙酰酶的方法如下：
[0054] (1)將試管斜面保藏的雜色曲霉SD-3菌種接種于斜面培養(yǎng)基，斜面于28°C生化培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。所述的斜面培養(yǎng)基組成和制備方法同實施例1。
[0055] (2)用接種環(huán)挑取步驟（1)活化培養(yǎng)后雜色曲霉SD-3孢子至種子培養(yǎng)基中，于 32°C、250r/min振蕩條件下培養(yǎng)2天，得到種子液；所述種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖10g，酵 母浸出粉 6g，（NH4)2S044g，K2HP0 42g，KH2P042g，乙酸鈉 3g，玉米漿 6mL，加自來水至 1000mL， pH6. 0, 250mL的三角瓶裝50mL種子培養(yǎng)基，八層紗布扎口，高壓蒸汽121°C滅菌20min。
[0056] (3)步驟（2)種子液以5%的體積比接種量接至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，3〇1：、20〇17/1^11振蕩 條件下培養(yǎng)4天，得到含甲殼素脫乙酰酶的發(fā)酵液；所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為：蔗糖10g，酵 母浸出粉 6g，（NH4)2S044g，K2HP0 42g，KH2P042g，乙酸鈉 3g，玉米漿 6mL，加自來水至 1000mL， pH6. 0, 250-mL的三角瓶裝50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，八層紗布扎口，高壓蒸汽121°C滅菌20min。
[0057] (4)將步驟⑶的含甲殼素脫乙酰酶發(fā)酵液用4層紗布過濾，所得濾液即為甲殼素 脫乙酰酶粗酶液，酶活力達到147. 4U/mL。
[0058] 實施例5 :雜色曲霉SD-3發(fā)酵制備甲殼素脫乙酰酶的方法3
[0059] 以雜色曲霉SD-3為菌種，經(jīng)過種子制備方法、產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件優(yōu)化 后，在500mL搖瓶制備甲殼素脫乙酰酶的方法如下：
[0060] (1)將試管斜面保藏的雜色曲霉SD-3菌種接種于斜面培養(yǎng)基，斜面于28°C生化培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。所述的斜面培養(yǎng)基組成和制備方法同實施例1。
[0061] (2)用接種環(huán)挑取步驟（1)活化培養(yǎng)后雜色曲霉SD-3孢子至種子培養(yǎng)基中，于 32°C、200r/min振蕩條件下培養(yǎng)2天，得到種子液；所述種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖5g，酵母 浸出粉 2g，（NH4)2S042g，K2HP0 4lg，KH2P04lg，乙酸鈉 lg，玉米漿 4mL，加自來水至 1000mL， pH6. 0,250mL的三角瓶裝50mL種子培養(yǎng)基，八層紗布扎口，高壓蒸汽121 °C滅菌20? 30min〇
[0062] (3)步驟（2)種子液以10%的體積比接種量接至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，28°C、200r/min振蕩 條件下培養(yǎng)3天，得到含甲殼素脫乙酰酶的發(fā)酵液；所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為：蔗糖10g，酵 母浸出粉 6g，（NH4)2S044g，K2HP0 42g，KH2P042g，乙酸鈉 3g，玉米漿 6mL，加自來水至 1000mL， pH6. 0, 2L的三角瓶裝500mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，八層紗布扎口，高壓蒸汽121°C滅菌30min。
[0063] (4)將步驟（3)的含甲殼素脫乙酰酶發(fā)酵液用4層紗布過濾，所得濾液即為甲殼素 脫乙酰酶粗酶液，酶活力達到142. 3U/mL。
[0064] 實施例6 :甲殼素脫乙酰酶的保存與凍干
[0065] 實施例3?5制備的甲殼素脫乙酰酶粗酶液可應用于酶解甲殼素制備殼聚糖，可 以立即使用，也可以密封保存于4°C冰箱中。由實施例5制備的酶活為142. 3U/mL的甲殼素 脫乙酰酶粗酶液，在4°C冰箱中密封保存20天后，酶活為121. 4U/mL，活力損失為14. 7%，可 以用于酶解甲殼素制備殼聚糖。
[〇〇66] 實施例3?5制備的甲殼素脫乙酰酶粗酶液經(jīng)-50°C冷凍干燥，制得干燥酶粉，可 保存于4°C冰箱長期使用。由實施例5制備的酶活為142. 3U/mL的甲殼素脫乙酰酶粗酶液， 在-50°C的條件下冷凍干燥，制得干燥的酶粉，加等同原酶液體積的蒸餾水溶解，酶活力為 115. 8U/mL，活力損失為18. 6%，可以用于酶解甲殼素制備殼聚糖。
【權利要求】
1. 雜色曲霉（Aspergillus versicolor)SD-3,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址： 中國，武漢，武漢大學，430072,保藏編號：CCTCC NO :M 2013328;保藏日期：2013年7月11 曰。
2. -種權利要求1所述雜色曲霉SD-3在微生物發(fā)酵制備甲殼素脫乙酰酶中的應用。
3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述應用為：將雜色曲霉SD-3菌種孢子或經(jīng) 過擴大培養(yǎng)的種子液接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28?32°C培養(yǎng)3?5天，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液 經(jīng)過離心或過濾除去菌絲體，所得上清液或濾液即為甲殼素脫乙酰酶粗酶液，將粗酶液分 離提取，獲得甲殼素脫乙酰酶；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成為：蔗糖5?10g/L，酵母浸出粉 2 ?6g/L，（NH4)2S042 ?4g/L，K2HP041 ?2g/L，KH2P041 ?2g/L，乙酸鈉 1 ?3g/L，玉米漿 4?6mL/L，溶劑為自來水，ρΗ5· 0?6· 0。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述雜色曲霉SD-3菌種孢子按如下方法制 備：將雜色曲霉SD-3接種于斜面或平板培養(yǎng)基，于28?32°C培養(yǎng)2?3天，得到雜色曲霉 SD-3菌種孢子；所述每升斜面或平板培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯150?200g、蔗糖10?20g、瓊 脂15?20g，自來水補足至1000mL，ρΗ5· 0?6. 0。
5. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述雜色曲霉SD-3種子液按如下步驟制備： (1)將雜色曲霉SD-3接種于斜面或平板培養(yǎng)基，于28?32°C培養(yǎng)2?3天，得到雜色曲霉 SD-3菌種孢子；所述每升斜面或平板培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯150?200g、蔗糖10?20g、 瓊脂15?20g，自來水補足至lOOOmL，pH5. 0?6. 0 ; (2)將步驟⑴雜色曲霉SD-3菌種 孢子接種至種子培養(yǎng)基中，于28?32°C、150?250r/min振蕩條件下培養(yǎng)2?3天，得到 種子液；所述每升種子培養(yǎng)基組成為：鹿糖5?10g，酵母浸出粉2?6g，（NH 4)2S042?4g， K2HP041?2g，KH2P041?2g，乙酸鈉1?3g，玉米漿4?6mL，力口自來水至1000mL，ρΗ4· 5? 6. 5〇
6. 如權利要求3或5所述的應用，其特征在于所述種子液的體積接種量為5?10%。
【文檔編號】C12N1/14GK104109636SQ201410305365
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權日:2014年6月30日
【發(fā)明者】陳虹, 張建芬, 柯薇, 活潑 申請人:浙江樹人大學