冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶b、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種來自冬蟲夏草中國被毛孢參與生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲基-2-氧代戊酸的3-異丙基蘋果酸脫氫酶B、編碼基因及其應(yīng)用，所述3-異丙基蘋果酸脫氫酶B氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，編碼基因如SEQ?ID?No.1所示；本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過調(diào)節(jié)3-異丙基蘋果酸脫氫酶B基因的表達，賦予宿主3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的高表達性，為擴大3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的生物應(yīng)用提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
【專利說明】冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶B、編碼基因及其應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及來自"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢的3-異丙基蘋果酸脫氫酶 B(3_isopropylmalate dehydrogenase)、編碼基因及其應(yīng)用。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草（Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目 (Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲（Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸 體上的復(fù)合體（包括子座和蟲體）。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn) 物和生物活性多樣的特點，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其 多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認為，冬蟲夏草入肺腎 二經(jīng)，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳 痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥。現(xiàn)代藥理學(xué)已證實，冬蟲夏 草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物 活性。
[0003] 冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段（無性型）和子囊孢 子階段（有性型）。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草 菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內(nèi)外學(xué)者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無性型確證、 活性成分分離分析和作用機理、開發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證 明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。
[0004] 但是，對冬蟲夏草中國被毛孢中3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的研究幾乎為空白， 以及對3-異丙基蘋果酸脫氫酶B在中國被毛孢中生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲 基-2-氧代戊酸的作用的研究。
[0005] 3-異丙基蘋果酸脫氫酶（IPMDH，EC:1. 1. 1.85)是生物合成亮氨酸中的一個 關(guān)鍵酶，是一種以NAD+或NADP+為受體、作用于供體CH-0H基團上的氧化還原酶。這 種酶能催化以下酶促反應(yīng)：（2Λ，35)-3- ?丙基蘋果酸+ NAD+ # 4-甲基-2-氣代戊 酸+.C()r十NADH +ΙΓ，此反應(yīng)實際上由兩步組成：（2i?,3S)-3-異丙基蘋杲_十 NAD' # (25)-2-汁丙坫-3- %代琥珀酸+ NADH + ΙΓ和(251-2- 丙』I-3-奴代琥珀 酸P4-甲基-2-氧代戊酸+C02,亦即上述第一步反應(yīng)的產(chǎn)物可通過第二步反應(yīng)自發(fā)脫羧 產(chǎn)生4-甲基-2-氧代戊酸。
[0006] 1981年，Tanaka等人從極端嗜熱菌Thermus thermophilus HB8中克隆到了一個 3_異丙基蘋果酸脫氫酶，并且用PBR322作為載體克隆到大腸桿菌中。攜帶重組質(zhì)粒的大腸 桿菌的3-異丙基蘋果酸脫氫酶酶活是野生型菌株的7倍。
[0007] 1986年，Kazuhiro Hamasawa等人從產(chǎn)朊假絲的基因文庫中克隆到一個3-異丙基 蘋果酸脫氫酶基因，利用質(zhì)粒PYKL30克隆到大腸桿菌和釀酒酵母中。這個基因的開放讀碼 框大小為l〇89bp，編碼363個氨基酸殘基。Southern雜交證實，該片段是從三產(chǎn)朊假絲而 得。
[0008] 1991年，H Kirino等人從極端嗜熱菌Thermus aquaticus YT-1中克隆到了一個 3_異丙基蘋果酸脫氫酶leuB，并且在大腸桿菌中進行了表達，它包含1035bp，編碼344個氨 基酸殘基的開放閱讀框。和嗜熱菌T. thermophilus HB8的3-異丙基蘋果酸脫氫酶的核苷 酸序列具有87. 0 %同源性，氨基酸序列具有91. 3 %同源性。
[0009] 1992年，Mats EllcMrdm等人從互補的酵母突變株leu2中克隆到了一個3-異丙 基蘋果酸脫氫酶基因，這個基因編碼一個52kDa大小的蛋白，其具有推定的葉綠體轉(zhuǎn)運肽。 在體外由蛋白質(zhì)導(dǎo)入到葉綠體中，與之同時蛋白裂解。
[0010] 2011年，Sikdar等人從水稻的基因組中克隆得到了一個3-異丙基蘋果酸脫氫酶 基因，該基因的開放讀碼框能編碼389個氨基酸，對應(yīng)于約41. 2kD的蛋白質(zhì)。這個水稻來 源的3-異丙基蘋果酸脫氫酶的氨基酸序列與植物和細菌來源的3-異丙基蘋果酸脫氫酶氨 基酸序列高度同源。
[0011] 但是，目前NCBI數(shù)據(jù)庫中目前還檢索不到中國被毛孢中3-異丙基蘋果酸脫氫酶 B的基因相關(guān)信息。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明目的是針對以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問題，對"百令"生產(chǎn)菌冬蟲 夏草中國被毛孢3-異丙基蘋果酸脫氫酶B在生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲基-2-氧 代戊酸進行深入研究，提供了"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢的一種3-異丙基蘋果酸 脫氫酶B、編碼基因及其應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0014] 本發(fā)明提供一種來自冬蟲夏草中國被毛孢參與生物催化3-異丙基蘋果酸制備 4-甲基-2-氧代戊酸的3-異丙基蘋果酸脫氫酶B，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示（記 為isoB蛋白）。
[0015] SEQ ID No. 1 序列如下：MATVQSDLFK PAKFGGKYTV TLIP⑶GIGA EVAESVKTVF KADNVPVEWE QIAVSGLDEA GSGRTDEAFR ESVASLKRNK LGLKGILHTP ISRSGHQSFN VAMRQELDIY ASISLIKNMP GYETRHRGVD LCIIRENTEG EYSGLEHQSV PGVVESLKII TRAKSERIAR FAFAFALANG RQKVTCIHKA NIMKLADGLF RNTFHAVAKE YPTLEVNDMI VDNASMQAVS RPQQFDVMVM PNLYGGILSN IGAALVGGPG IVPGCNRARD MPVFEPACRH VGLDIKGKDQ ANPTAMVLSG SMLLRHLGLD DPANRISKAM Y氺
[0016] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的肽蛋白的片 段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體 與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。具體的所述改變可包 括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基 酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保 守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0017] 本發(fā)明還涉及所述的3-異丙基蘋果酸脫氫酶B在生物催化3-異丙基蘋果酸制備 4_甲基-2-氧代戊酸中的應(yīng)用。由3-異丙基蘋果酸經(jīng)過3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的催化 獲得對應(yīng)4-甲基-2-氧代戊酸的路徑如下所示：
[0018]
[0019] 具體，所述3-異丙基蘋果酸脫氫酶B在生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲 基-2-氧代戊酸中的應(yīng)用為 ：以含冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶B重組工程菌經(jīng)誘 導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體用磷酸鹽緩沖液（50mM、pH8.0)懸浮，超聲破碎后，將破碎混合液離 心，取上清液為催化劑，以3-異丙基蘋果酸水溶液為底物，以輔酶I (即NADH)為輔助底 物，于pH自然的Tris-HCl緩沖液中，37°C、150rpm條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離 心，取上清液即獲得含有4-甲基-2-氧代戊酸的混合液，將混合液分離純化即獲得4-甲 基-2-氧代戊酸；所述分離純化的方法為本領(lǐng)域公知操作，通常采用親和層析方法；所述混 合液采用高效液相色譜檢測混合液中產(chǎn)物，流動相：V(乙腈）：V[pH3. 0(0. 86% )磷酸三乙 胺]=55:45，波長23711111，柱溫：251：，流量1111171^11;進樣體積 ：2()此，溶劑：乙腈，色譜柱： Diamonsul250mmX 4. 6mm C18柱，儀器：島津LC-20AT高效液相色譜儀。
[0020] 所述催化劑的制備方法為：將含3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的重組工程菌接種于含 有Kan抗性（終濃度50 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)過夜。取lmL培 養(yǎng)物，將其轉(zhuǎn)接（體積濃度接種量為2% )于50mL含有Kan抗性（終濃度50 μ g/ml)的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)至菌體濃度0D600約為0. 6?0. 8左右，向培養(yǎng)物中加 入一定濃度（終濃度0.05臟〇1/1)的1?16誘導(dǎo)培養(yǎng)811，收集濕菌體，將濕菌體在功率40%、 破Is停Is條件下超聲破碎3次，每次5min，取細胞破碎混合液離心，取上清液即為催化劑。
[0021] 一個酶活性單位（U)定義為：3_異丙基蘋果酸脫氫酶B在37°C條件下，lmin催化 3_異丙基蘋果酸生成1 μ mol的4-甲基-2-氧代戊酸所需的酶量。
[0022] 所述底物3-異丙基蘋果酸水溶液的濃度為0. 1M，所述底物的初始濃度為0. 02M， 所述催化劑的體積用量以超聲破碎前濕菌體質(zhì)量計為l〇g/L(終濃度），所述輔酶I的終濃 度為 0.01g/L。
[0023] 本發(fā)明還涉及編碼所述3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的基因。具體的，所述基因的核 苷酸序列如SEQ ID No. 2所示（記為isoB基因，isoB基因編碼isoB蛋白）。
[0024] 由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID N0. 2所示多核苷酸的變體，只要其與該多 核苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種 具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或 非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體 是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上 改變其編碼的肽蛋白的功能。
[0025] 所述的編碼3-異丙基蘋果酸脫氫酶B基因在構(gòu)建能夠生物催化3-異丙基蘋果酸 制備4-甲基-2-氧代戊酸的基因工程菌中的應(yīng)用，以擴大3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的應(yīng) 用，具體為：構(gòu)建含有所述3-異丙基蘋果酸脫氫酶B基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化 至大腸桿菌（優(yōu)選E.coli BL21(DE3))中，獲得的重組基因工程菌進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分 離純化獲得含有3-異丙基蘋果酸脫氫酶B基因的菌體細胞。
[0026] 本發(fā)明的要點在于提供了 SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO. 2所示的 核苷酸序列，在已知該氨基酸序列和核苷酸序列的情況下，該氨基酸序列和核苷酸序列的 獲得，以及相關(guān)載體、宿主細胞的獲得，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說均是顯而易見的。
[0027] 能夠提供本發(fā)明所述冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶B及其編碼基因的菌株為 中國被毛孢（Hirsutella sinensis) L0106,該菌種保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號為CCTCC No :M2011278,已在先前申請的專利CN102373190A中披露。
[0028] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明從原理上對3-異丙基蘋果酸脫氫酶B在中 國被毛孢中生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲基-2-氧代戊酸的過程進行了詳細研究， 提供了"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢的3-異丙基蘋果酸脫氫酶B及其編碼基因，本 發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程 菌中，通過調(diào)節(jié)蛋白水解酶基因的表達，賦予宿主3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的高表達性，為 擴大3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的生物應(yīng)用提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢總RNA的甲醛變性凝膠電泳圖；
[0030] 圖2為亮氨酸代謝途徑及3-異丙基蘋果酸脫氫酶所在的催化過程注釋圖；
[0031] 圖3為3-異丙基蘋果酸脫氫酶B基因 PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖；
[0032] 圖4為克隆載體pMD18-T Vector與表達載體pET_28a物理圖譜；
[0033] 圖5為重組克隆質(zhì)粒pMD18_T/isoB物理圖譜；
[0034] 圖6為重組表達質(zhì)粒pET_28a/isoB構(gòu)建過程示意圖；
[0035] 圖7為重組表達質(zhì)粒pET_28a/isoB物理圖譜；
[0036] 圖8為3-異丙基蘋果酸脫氫酶B蛋白的SDS-PAGE圖。 (五）

【具體實施方式】
[0037] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0038] 實施例1 :"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢的培養(yǎng)
[0039] 菌株來源：首先從青海采集天然冬蟲夏草，并將其帶回杭州進行分離篩選，得到 了 L0106菌株，并經(jīng)菌種鑒定該菌株為中國被毛孢（Hirsutella sinensis)，該菌種保 藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No :M2011278,已在先前申請的專利 CN102373190A 中披露。
[0040] 將該菌種接種于斜面，培養(yǎng)基配方（此為固化之前的液體配方，按下述比例配制 好之后再制成斜面）為：葡萄糖2.0% (w/v，l%表示100mL培養(yǎng)基中含有l(wèi)g，下同）、玉米粉 1.0%、土豆汁0.5%、糊精0.5%、酵母粉0.5%、麩皮1.0%、蠶蛹粉2.0%、蛋白胨1.0%、 硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、瓊脂粉1.0%，余量為水；在12?16°C培養(yǎng)25天；然 后將菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為葡萄糖1.0%、糖蜜1.0%、蠶蛹粉0.5%、黃豆 餅粉1. 〇%、酵母膏〇. 5%、硫酸鎂0. 01 %、磷酸二氫鉀0. 02%，余量為水；置于搖床上，溫度 12?16°C培養(yǎng)25天，培養(yǎng)結(jié)束后在無菌條件下，進行固液分離，并將固體置于無菌器具，備 用。
[0041] 實施例2 :"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢總RNA的提取
[0042] 用TRIzol試劑提取總RNA，步驟具體為：
[0043] 1)液氮研磨：取lg新鮮菌體放入研缽中，反復(fù)加入液氮充分研磨至粉末狀，分裝 到預(yù)冷的1. 5mL離心管中，加入lmL TRIzol試劑，混勻，冰上靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物 完全分離。
[0044] 2) RNA分離：加入0· 2mL氯仿，用力震蕩混勻15s，冰上靜置2?3min，4 °C、 12000rpm離心15min，分層，取上層水相，約600 μ L。
[0045] 3) RNA沉淀：加入500 μ L異丙醇，在冰上靜置lOmin，4°C、12000rpm離心lOmin，棄 上清。
[0046] 4) RNA洗滌：加入lmL75% (v/v)乙醇，將沉淀懸起，冰上靜置lOmin，4°C、7500rpm 離心15min ;重復(fù)上面洗漆步驟，再洗一遍。
[0047] 5)溶解RNA :將離心管置于冰上敞開干燥5?10min，加適量DEPC水溶解。
[0048] 實施例3 :"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢RNA樣品測序
[0049] 提取樣品總RNA后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段（200?700bp)，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers)合成第一條cDNA鏈，然后合成第二條cDNA鏈，再經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化 并加 EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加 polyA并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進 行片段大小選擇，最后進行PCR擴增，建好的測序文庫用Illumina GA IIx進行測序。測序 得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，即raw data或raw reads。除去原 始測序reads中只含adaptor序列的reads，備以后續(xù)分析。
[0050] 實施例4 :"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢RNA短讀序列組裝
[0051] 使用短 reads 組裝軟件 SOAPdenovo (Li, Zhu et al. De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing[J]·Genome Res, 2010, 20:265-272.)做轉(zhuǎn)錄組從頭組裝。SOAPdenovo首先將具有一定長度overlap的 reads連成更長的不含N的Contig片段。然后將reads比對回Contig，通過paired-end reads確定來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig以及這些Contig之間的距離，SOAPdenovo 將這些Contig連在一起，中間未知序列用N表示，這樣就得到Scaffold。進一步利用 paired-end reads對Scaffold做補洞處理，最后得到含N最少，兩端不能再延長的Unigene 序列。最后，將Unigene序列與蛋白數(shù)據(jù)庫nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比對 (evalue〈0. 00001)，取比對結(jié)果最好的蛋白確定Unigene的序列方向。如果不同庫之間的 比對結(jié)果有矛盾，貝丨』按nr、Swiss-Prot、KEGG和C0G的優(yōu)先級確定Unigene的序列方向，跟 以上四個庫皆對比不上的 Unigene 用軟件 ESTScan (Iseli, Jongeneel et al. ESTScan:a program for detecting, evaluating, and reconstructing potential coding regions in EST sequences[J]. In Proceedings of9th International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. AAAIPress, Menlo Park, CA，pp. 1999, 138-148.)預(yù)測其 編碼區(qū)并確定序列的方向。對于能確定序列方向的Unigene給出其從5'到3'方向的序列， 對于無法確定序列方向的Unigene給出組裝軟件得到的序列。
[0052] 實施例5 :"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢Unigene功能注釋
[0053] 功能注釋信息給出Unigene的蛋白功能注釋、Pathway注釋、C0G功能注釋和 Gene Ontology(GO)功能注釋。首先，通過blastx將Unigene序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫nr、 Swiss_Prot、KEGG和COG (evalue〈0. 00001)，得到跟給定Unigene具有最高序列相似性的蛋 白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。根據(jù)KEGG注釋信息能進一步得到Unigene 的Pathway注釋。將Unigene和COG數(shù)據(jù)庫進行比對，預(yù)測Unigene可能的功能并對其做 功能分類統(tǒng)計。根據(jù)nr注釋信息，使用Blast2G0軟件（Conesa，Gotz et al.Blast2G0:a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research [J] · Bioinformatics, 2005, 21 (18) : 3674-3676.)得到 Unigene 的 GO注釋信息。得 到每個Unigene 的GO注釋后，用 WEGO軟件（Ye, Fang et al.WEG0:a web tool for plotting GO annotations[J].Nucleic Acids Research, 2006, 34:293-297.)對所有 Unigene 做 GO 功能分類統(tǒng)計，從宏觀上認識該物種的基因功能分布特征。
[0054] 實施例6 :亮氨酸代謝途徑及3-異丙基蘋果酸脫氫酶B作用的分析
[0055] 圖2是亮氨酸代謝途徑及3-異丙基蘋果酸脫氫酶B所在的催化步驟和過程 注釋圖，首先，丙酮酸在乙酰乳酸合酶的催化作用下合成（S)-2_乙酰乳酸，然后在酮醇 酸還原異構(gòu)酶的作用下合成3-羥基-3甲基-2-氧代丁酸，經(jīng)過5步催化反應(yīng)后生成 (2R，3S) -3-異丙基蘋果酸，在3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的催化作用下生成4-甲基-2-氧 代戊酸，最后在亮氨酸脫氫酶的作用下催化生成L-亮氨酸。從中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組測序以及 注釋信息中檢測到了 3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的Unigene。通過NCBI中的0RF Finder 軟件在線檢測，找出了這個基因的開放閱讀框（SEQ ID No. 2)并得到了相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列 (SEQ ID No. 1)。
[0056] 實施例7:"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢3-異丙基蘋果酸脫氫酶B基因引物 設(shè)計
[0057] 運用GENE RUNNER引物設(shè)計軟件根據(jù)預(yù)測得到的各基因開放閱讀框DNA序列設(shè)計 引物，用于克隆"百令"生產(chǎn)菌中國被毛孢合成代謝亮氨酸的3-異丙基蘋果酸脫氫酶B基 因，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所列：
[0058] isoB 基因：正向引物 5' AGAGAATTCATGGCGACGGTGCAGTCGGA3'
[0059] 反向引物 5 ' ATAGCGGCCGCTTAGTACATGGCCTTGGAG3 '
[0060] isoB 基因長度為 966bp。
[0061] 實施例8 :"百令"生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢cDNA第一鏈的制備
[0062] 先按照實施例1提供的方法培養(yǎng)出中國被毛孢發(fā)酵菌絲體后，再按照實施例2所 提供的方法對中國被毛孢進行總RNA的提取，得到總RNA后按下述進行"百令"生產(chǎn)菌冬蟲 夏草中國被毛孢cDNA第一鏈的合成，用于后續(xù)各基因克隆實驗。
[0063] 米用PrimeScriptlst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（TaKaRa)從Total RNA 中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，實驗步驟如下：
[0064] 1)在Microtube管中配制下列混合液。
[0065]

【權(quán)利要求】
1. 一種冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶B，其特征在于所述脫氫酶B的氨基酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草3-異丙基蘋果酸脫氫酶B在生物催化3-異丙基蘋果 酸制備4-甲基-2-氧代戊酸中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以冬蟲夏草含3-異丙基蘋果 酸脫氫酶B重組工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體用pH8. 0磷酸鹽緩沖液懸浮，超聲破碎后， 將破碎混合液離心，取上清液為催化劑，以3-異丙基蘋果酸水溶液為底物，以輔酶I為輔 助底物，于Tris-HCl緩沖液中，37°C、150rpm條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，取上 清液即獲得含4-甲基-2-氧代戊酸的混合液，將混合液分離純化，獲得4-甲基-2-氧代戊 酸。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述底物3-異丙基蘋果酸水溶液濃度為 〇. 1M，所述反應(yīng)體系中底物的初始濃度為0. 02M，所述催化劑的體積用量以超聲破碎前濕菌 體質(zhì)量計為〇. 〇lg/L，所述輔酶I的終濃度為10g/L。
5. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備：將含3-異丙基 蘋果酸脫氫酶B的重組工程菌接種于含終濃度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、250r/min培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)物，以體積濃度2%的接種量轉(zhuǎn)接于含有終濃度50μ g/ml Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)至菌體濃度0D600為0. 6?0. 8,向培養(yǎng) 物中加入終濃度〇. 〇5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集濕菌體，將濕菌體在功率40%、破Is 停Is條件下超聲破碎，取細胞破碎混合液離心，取上清液即為催化劑。
6. -種編碼權(quán)利要求1所述3-異丙基蘋果酸脫氫酶B的基因。
7. 如權(quán)利要求6所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的編碼基因在構(gòu)建能夠生物催化3-異丙基蘋果酸制備4-甲 基-2-氧代戊酸的基因工程菌中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：構(gòu)建含有所述3-異丙基蘋果 酸脫氫酶B基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌 進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離純化獲得含有3-異丙基蘋果酸脫氫酶B基因的菌體細胞。
【文檔編號】C12N1/21GK104120112SQ201410305802
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】柳志強, 鄭裕國, 林善, 薛亞平, 吳暉, 李邦良, 許靜, 許峰, 王鴻艷 申請人:浙江工業(yè)大學(xué), 杭州中美華東制藥有限公司