來(lái)自冬蟲夏草的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種來(lái)自冬蟲夏草中國(guó)被毛孢參與水解大分子蛋白質(zhì)生成小分子蛋白質(zhì)的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應(yīng)用。所述絲氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，編碼基因如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明從原理上對(duì)絲氨酸蛋白酶在中國(guó)被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲的過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢參與侵染機(jī)制機(jī)理的絲氨酸蛋白酶及其編碼基因，本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來(lái)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白水解酶基因的表達(dá)，賦予宿主絲氨酸蛋白酶的高表達(dá)性，為擴(kuò)大絲氨酸蛋白酶的生物應(yīng)用提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】來(lái)自冬蟲夏草的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應(yīng)用
(—)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應(yīng)用。
(二)

【背景技術(shù)】
[0002]冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲夏草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽(yáng)，主治腎虛，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)，冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。
[0003]冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無(wú)性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實(shí)際生產(chǎn)中使用的是無(wú)性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無(wú)性型的鑒定非常重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無(wú)性型確證、活性成分分離分析和作用機(jī)理、開發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國(guó)被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無(wú)性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。
[0004]但是，對(duì)冬蟲夏草中國(guó)被毛孢機(jī)制機(jī)理的研究幾乎為空白，尤其在中國(guó)被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲的機(jī)制機(jī)理上，以及對(duì)絲氨酸蛋白酶在中國(guó)被毛孢侵染機(jī)制中的作用的研究。
[0005]絲氨酸蛋白酶廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒、真菌中，并且參與生命的各種反應(yīng)，比如蛋白質(zhì)翻譯后后加工、細(xì)胞分裂、病原體感染、組織降解、細(xì)胞凋亡等，可見(jiàn)絲氨酸蛋白酶具有廣泛的研究和應(yīng)用價(jià)值。
[0006]絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有機(jī)體中起著重要而廣泛的生理作用，還在胚胎發(fā)育、組織重建、細(xì)胞分化、血管形成和病原侵入等過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用。絲氨酸蛋白酶超家族的成員多而廣，它們的活性部位都含Ser> His、Asp,并具有相同的催化機(jī)制,但是它們與底物結(jié)合部位的差異決定了各自對(duì)底物的專一性。
[0007]絲氨酸蛋白酶在結(jié)構(gòu)上為全β蛋白，核心結(jié)構(gòu)由兩個(gè)非常相似的結(jié)構(gòu)域(N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域)構(gòu)成。由于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上存在著差異，它們?cè)诠δ芎瓦M(jìn)化上的作用也就不同。
[0008]1986年，Gershenfeld HK等人在《Science》上發(fā)表論文,他們通過(guò)RNA雜交競(jìng)爭(zhēng)協(xié)議從小鼠的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞互補(bǔ)DNA文庫(kù)中分離出的克隆可以編碼一個(gè)新的絲氨酸蛋白酶，并且對(duì)它進(jìn)行了克隆，該基因的堿基序列編碼約為25700道爾頓的氨基酸序列，25%至35%屬于絲氨酸蛋白酶家族，保守的活性位點(diǎn)殘基為His57，Aspl02和Serl95的胰凝乳蛋白酶。Southern雜交分析表明，這個(gè)基因在人類，小鼠和雞種保守。此絲氨酸蛋白酶可能在淋巴細(xì)胞的裂解和溶解級(jí)聯(lián)有作用。
[0009]1999年,Kyoko Yamashiroa等人從人結(jié)腸腺癌細(xì)胞中克隆到了一個(gè)新的絲氨酸蛋白酶，該序列包括155bp的5’非編碼區(qū)和一個(gè)位于551bp的3’非編碼區(qū)后的732bp長(zhǎng)的開放閱讀框非編碼區(qū)，預(yù)測(cè)的蛋白由244個(gè)氨基酸組成，和絲氨酸蛋白酶家族的其他成員顯示一定的相似性，和發(fā)現(xiàn)的其他類似胰蛋白酶一樣，這種酶含有作為必要的氨基酸殘基的活性的催化三聯(lián)體。
[0010]2003年，李文輝等人利用逆轉(zhuǎn)錄酶與聚合酶鏈反應(yīng)相結(jié)合的RT-PCR法，擴(kuò)增出5個(gè)竹葉青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒絲氨酸蛋白酶的cDNAs,將擴(kuò)增的cDNA片段克隆入pGEM-T載體中，再經(jīng)末端終止法測(cè)定核苷酸序列，推導(dǎo)出5個(gè)絲氨酸蛋白酶的全序列。5個(gè)絲氨酸蛋白酶分別含有1-6個(gè)N-型糖基結(jié)合位點(diǎn)，表明它們的計(jì)算分子量與純化蛋白表觀分子量之間的差異是由糖含量的不同造成，而其氨基酸序列相似度在60% -90%。
[0011]2004年，儲(chǔ)衛(wèi)華等人根據(jù)已發(fā)表的氣單胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)和合成了一對(duì)引物，以嗜水氣單胞菌AhJ-1的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)，擴(kuò)增到約900bp的絲氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到質(zhì)粒載體pGEM-T中進(jìn)行測(cè)序和分析，結(jié)果表明擴(kuò)增的絲氨酸蛋白酶基因片段與已發(fā)表的嗜水氣單胞菌絲氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87%，擴(kuò)增片段編碼343個(gè)氨基酸，推測(cè)的分子量為35700，計(jì)算機(jī)軟件分析表明編碼的氨基酸有較高的抗原性，可作為核酸疫苗的侯選基因片段。
[0012]2005年，李江等人從一株具有極強(qiáng)的降解羽毛能力的弗氏鏈霉菌菌株(Streptomyces fradiae var.kll)中純化得到了一種絲氨酸蛋白酶SFP2。經(jīng)蛋白測(cè)序,得到部分氨基酸序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，PCR擴(kuò)增得到部分基因序列，通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)，獲得了包括信號(hào)肽序列在內(nèi)的完整的基因sfp2 (EMBL收錄號(hào)AJ784940)，開放閱讀框全長(zhǎng)924bp，包括114bp的信號(hào)肽編碼序列和810bp的酶原編碼序列，其中成熟蛋白編碼基因長(zhǎng)576bp，編碼191個(gè)氨基酸，理論分子量為19.112kD。酶原編碼基因和成熟蛋白編碼基因均在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中得到了表達(dá)，酶原編碼基因表達(dá)產(chǎn)物具有正常的生物學(xué)活性，證明了克隆基因的生物學(xué)功能。
[0013]2008年，雷迎峰等人在大腸桿菌中進(jìn)行了 HCVNS3/4A絲氨酸蛋白酶的表達(dá)并進(jìn)行純化。根據(jù)NS3與NS4A兩者形成異源二聚體的結(jié)構(gòu)要求，通過(guò)基因拼接的方法設(shè)計(jì)了單鏈NS3/4A絲氨酸蛋白酶的基因。合成相應(yīng)引物，利用反轉(zhuǎn)錄PCR從HCV患者血液中擴(kuò)增出該蛋白酶的編碼基因，克隆入原核表達(dá)載體pRSET-A，將重組表達(dá)質(zhì)粒pRSET-A-ns3/4a轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)大腸桿菌，并誘導(dǎo)表達(dá)與純化。成功地構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pRSET-A-ns3/4a，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western_blot證實(shí)為NS3/4A絲氨酸蛋白酶，并用鎳離子親和層析方法獲得純化蛋白酶。獲得的純化NS3/4A絲氨酸蛋白酶為建立其酶活性測(cè)定系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。
[0014]2011年，王俊偉等人根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的少孢節(jié)叢孢菌絲氨酸蛋白酶基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株(XJ-XA)絲氨酸蛋白酶(命名為Aozl)基因序列進(jìn)行了擴(kuò)增，并與國(guó)內(nèi)外少孢節(jié)叢孢菌不同地域分離株相應(yīng)序列進(jìn)行了同源性分析，構(gòu)建該基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，XJ-XA Aozl基因全長(zhǎng)為1344bp，包含2個(gè)外顯子和I個(gè)63bp的內(nèi)含子(第517~579位核苷酸)，編碼426個(gè)氨基酸。系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，少孢節(jié)叢孢菌不同地域分離株Aozl基因序列具有較高的親緣性，與其他捕食線蟲性真菌Aozl基因親緣性較遠(yuǎn)。此項(xiàng)研究為研發(fā)家畜線蟲病生物防控制劑奠定了前期基礎(chǔ)。
[0015]2012年，劉海明等人利用粉紋夜蛾Trichoplusia ni圍食膜蛋白多克隆抗體篩選華北大黑觸金龜Holotrichia oblita中腸cDNA表達(dá)文庫(kù),首次得到編碼華北大黑觸金龜絲氨酸蛋白酶cDNA序列，命名為HoSPl (GenBank登錄號(hào)為FJ573146)。序列分析表明，該基因長(zhǎng)902bp，開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)783bp，編碼260個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量和pi值分別為26.7kDa和4.19，不含有N-糖基化位點(diǎn)，但在Thrl57處有一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，組成3對(duì)二硫鍵，對(duì)于維持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)起著重要的作用。通過(guò)與幾種絲氨酸蛋白酶的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該酶具有組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)催化中心,與褐新西蘭肋翅觸金龜Costelytra zealandica的14種絲氨酸蛋白酶有明顯的相似性，其中與CzSP3的序列一致性最高，為52.47%。把該基因與pET21b載體重組后，進(jìn)行體外表達(dá)，以BTEE為底物，測(cè)得該酶的活力為0.0378 μ mol/mg.min。
[0016]2010年，Xiaoqing Zhang等人從食用菌真姬燕的新鮮子實(shí)體中分離到了一個(gè)28kDa的絲氨酸蛋白酶。根據(jù)N-末端測(cè)序序列，結(jié)合使用RACE和TAIL-PCR方法，成功克隆到了這個(gè)絲氨酸蛋白酶了基因。這個(gè)蛋白酶的序列含有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，一個(gè)82個(gè)氨基酸的前區(qū)序列，誘導(dǎo)后的蛋白酶具有285個(gè)氨基酸和28.07kDa的分子量，并且擁有枯草桿菌蛋白酶家族(S8A)的三個(gè)活性位點(diǎn)特征。
[0017]2013年,Ying Huang等人從中華絨螯蟹中克隆到了一個(gè)域?yàn)樘卣鞯陌l(fā)夾狀絲氨酸蛋白酶，并且對(duì)它進(jìn)行了特性研究。
[0018]但是，目前NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中目前還檢索不到中國(guó)被毛孢中絲氨酸蛋白酶的基因相關(guān)信息。
(三)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本發(fā)明目的是針對(duì)以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問(wèn)題，對(duì)“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢侵染機(jī)制中的酶及其編碼基因進(jìn)行深入研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢侵染機(jī)制的一種絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0021]來(lái)自冬蟲夏草中國(guó)被毛孢參與水解大分子蛋白質(zhì)生成小分子蛋白質(zhì)的絲氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(記為serA蛋白)。該酶可催化斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)。
[0022]SEQ ID N0.1 序列如下:PDLSPATVKI TNDDSPNKME NSffLLVffKNALADDAIKARRDDFAATLRKR NLGKRDVNGN TIPMEAIHYD IGSLRMTVCNADAKTMNLMV SNAIDAVDYVEANEffIDMFR TENETEAPPA VNATAVADGAEASPGEDGEG TVVYIVDTGI NVNHVAFEDR ATMIANLVRGESEQDLNGHGTHCAGSAAGK EIGVATKALI RGVKVLNAKG SGG⑶SIIGG FRAACNDVKKNGFEGKCVVSMSLGTGRSNA INNAAKQMGQ CGCAIWAAG NDGKDASTVSPASSDDVITV GATDARTNQL AAFSNTGPLVDISTNGVNVI SADANDITGTKELTGTSMSA PQIAGIALVA LNDVDLDCTI DCTDRMRDFLQKKAQQEKPIAISS⑶SDTT PLQIDATDKA PTDPDGPTPI SKKGQQGKQG KKQTGQKGR*
[0023]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對(duì)于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0024]本發(fā)明還涉及所述的絲氨酸蛋白酶在生物催化水解大分子蛋白質(zhì)制備小分子蛋白質(zhì)中的應(yīng)用，優(yōu)選所述絲氨酸蛋白酶能夠斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)。由于昆蟲幼蟲的表皮主要由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)組成，蟲生真菌在侵染昆蟲幼蟲的時(shí)候會(huì)分泌絲氨酸蛋白酶來(lái)降解蟲體表皮的蛋白質(zhì)，從而增加蟲生真菌侵染力，可應(yīng)用于生物防治害蟲。所述的應(yīng)用為:將含絲氨酸蛋白酶基因的重組工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體用磷酸鹽緩沖液(50mM、pH8.0)懸浮，超聲細(xì)胞破碎后，取破碎混合液離心，取上清液作為催化劑，以10.00mg/mL酪素溶液為底物，40°C下水浴反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液離心，取上清液即獲得含酪氨酸的混合液，將混合液分離純化，獲得酪氨酸，所述分離純化的方法為本領(lǐng)域公知，通常采用親和層析的方法；所述10.00mg/mL酪素溶液按如下步驟制備:取1.0OOg酪素用0.5mol/L的氫氧化鈉水溶液潤(rùn)濕，加入pH值為8.0的PBS緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，用緩沖液稀釋至刻度；所述氫氧化鈉水溶液的體積用量以酪素質(zhì)量計(jì)為5ml/g。
[0025]所述底物的用量以酪素質(zhì)量計(jì)，所述酪素的初始濃度為5mg/mL (終濃度)，所述催化劑的體積用量以破碎前濕菌體的質(zhì)量計(jì)為20g/L(終濃度)。
[0026]所述催化劑按如下方法制備:將含絲氨酸蛋白酶基因的重組工程菌接種于含終濃度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)過(guò)夜，取ImL培養(yǎng)物，將其轉(zhuǎn)接(體積接種量2% )于50mL含有50 μ g/ml Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)至菌體濃度0D600為0.6~0.8，向培養(yǎng)物中加入終濃度0.05mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集濕菌體，將濕菌體在功率40%、破Is停Is條件下超聲破碎(優(yōu)選3次，每次5min)，取破碎混合液離心，取上清液即為催化劑。
[0027]本發(fā)明還涉及編碼所述絲氨酸蛋白酶的基因。具體的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所不(記為serA基因，serA基因編碼serA蛋白)。
[0028]由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID N0.2所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的肽蛋白的功能。
[0029]所述的絲氨酸蛋白酶編碼基因在構(gòu)建能夠生物催化水解大分子蛋白質(zhì)制備小分子蛋白質(zhì)的基因工程菌中的應(yīng)用。所述的基因可用于構(gòu)建能夠生物催化斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)的基因工程菌，以擴(kuò)大絲氨酸蛋白酶的應(yīng)用。所述催化水解優(yōu)選在40°C下進(jìn)行。具體為:構(gòu)建含有所述絲氨酸蛋白酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(優(yōu)選E.coli BL2KDE3))中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離純化獲得含有絲氨酸蛋白酶基因的菌體細(xì)胞。
[0030]本發(fā)明的要點(diǎn)在于提供了 SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，在已知該氨基酸序列和核苷酸序列的情況下，該氨基酸序列和核苷酸序列的獲得，以及相關(guān)載體、宿主細(xì)胞的獲得，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)均是顯而易見(jiàn)的。
[0031]能夠提供本發(fā)明所述冬蟲夏草絲氨酸蛋白酶及其編碼基因的菌株為中國(guó)被毛孢(Hirsutella sinensis) L0106,該菌種保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為CCTCCNo:M2011278,已在先前申請(qǐng)的專利CN102373190A中披露。
[0032]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明從原理上對(duì)絲氨酸蛋白酶在中國(guó)被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲的過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢參與侵染機(jī)制機(jī)理的絲氨酸蛋白酶及其編碼基因，本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來(lái)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白水解酶基因的表達(dá)，賦予宿主絲氨酸蛋白酶的高表達(dá)性，為擴(kuò)大絲氨酸蛋白酶的生物應(yīng)用提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
(四)

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢總RNA的甲醛變性凝膠電泳圖；
[0034]圖2為中國(guó)被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲機(jī)制和過(guò)程注釋圖；
[0035]圖3為絲氨酸蛋白酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖；
[0036]圖4為克隆載體pMD18-T Vector與表達(dá)載體pET_28a物理圖譜；
[0037]圖5為重組克隆質(zhì)粒pMD18_T/serA物理圖譜；
[0038]圖6為重組表達(dá)質(zhì)粒pET_28a/serA構(gòu)建過(guò)程示意圖；
[0039]圖7為重組表達(dá)質(zhì)粒pET_28a/serA物理圖譜；
[0040]圖8為絲氨酸蛋白酶蛋白的SDS-PAGE圖。
(五)

【具體實(shí)施方式】
[0041]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0042]實(shí)施例1 百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢的培養(yǎng)
[0043]菌株來(lái)源:首先從青海采集天然冬蟲夏草，并將其帶回杭州進(jìn)行分離篩選，得到了 L0106菌株，并經(jīng)菌種鑒定該菌株為中國(guó)被毛孢(Hirsutella sinensis),該菌種保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No:M2011278,已在先前申請(qǐng)的專利CN102373190A 中披露。
[0044]將該菌種接種于斜面，培養(yǎng)基配方(此為固化之前的液體配方，按下述比例配制好之后再制成斜面)為:葡萄糖2.0% (w/v，l%表示10mL培養(yǎng)基中含有l(wèi)g，下同)、玉米粉
1.0%、土豆汁0.5%、糊精0.5%、酵母粉0.5%、麩皮1.0%、蠶蛹粉2.0%、蛋白胨1.0%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、瓊脂粉1.0%，余量為水；在12~16°C培養(yǎng)25天；然后將菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為葡萄糖1.0 %、糖蜜1.0 %、蠶蛹粉0.5 %、黃豆餅粉1.0%、酵母膏0.5%、硫酸鎂0.01 %、磷酸二氫鉀0.02%，余量為水；置于搖床上，溫度12~16°C培養(yǎng)25天，培養(yǎng)結(jié)束后在無(wú)菌條件下，進(jìn)行固液分離，并將固體置于無(wú)菌器具，備用。
[0045]實(shí)施例2 百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢總RNA的提取
[0046]用TRIzol試劑提取總RNA，步驟具體為:
[0047]I)液氮研磨:取Ig新鮮菌體放入研缽中，反復(fù)加入液氮充分研磨至粉末狀，分裝到預(yù)冷的1.5mL離心管中，加入ImL TRIzol試劑，混勻，冰上靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
[0048]2) RNA分離:加入0.2mL氯仿，用力震蕩混勻15s，冰上靜置2~3min，4 V、12000rpm離心15min,分層,取上層水相,約600 μ L。
[0049]3) RNA沉淀:加入500 μ L異丙醇，在冰上靜置lOmin，4°C、12000rpm離心10min，棄上清。
[0050]4) RNA洗滌:加入lmL75% (v/v)乙醇，將沉淀懸起，冰上靜置lOmin，4°C、7500rpm離心15min ;重復(fù)上面洗漆步驟,再洗一遍。
[0051]5)溶解RNA:將離心管置于冰上敞開干燥5~lOmin，加適量DEPC水溶解。
[0052]實(shí)施例3 百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢RNA樣品測(cè)序
[0053]提取樣品總RNA后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentat1nbuffer將mRNA打斷成短片段(200~700bp)，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(randomhexamers)合成第一條cDNA鏈,然后合成第二條cDNA鏈,再經(jīng)過(guò)QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加polyA并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測(cè)序文庫(kù)用Illumina GA IIx進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，即raw data或raw reads。除去原始測(cè)序reads中只含adaptor序列的reads,備以后續(xù)分析。
[0054]實(shí)施例4 百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢RNA短讀序列組裝
[0055]使用短reads 組裝軟件 SOAPdenovo (Li, Zhu et al.De novo assembly ofhuman genomes with massively parallel short read sequencing[J].GenomeRes, 2010, 20:265-272.)做轉(zhuǎn)錄組從頭組裝。SOAPdenovo首先將具有一定長(zhǎng)度overlap的reads連成更長(zhǎng)的不含N的Contig片段。然后將reads比對(duì)回Contig,通過(guò)paired-endreads確定來(lái)自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig以及這些Contig之間的距離，SOAPdenovo將這些Contig連在一起，中間未知序列用N表示，這樣就得到Scaffold。進(jìn)一步利用paired-end reads對(duì)Scaffold做補(bǔ)洞處理,最后得到含N最少,兩端不能再延長(zhǎng)的Unigene序列。最后，將Unigene序列與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比對(duì)(evalue〈0.00001),取比對(duì)結(jié)果最好的蛋白確定Unigene的序列方向。如果不同庫(kù)之間的比對(duì)結(jié)果有矛盾，貝丨』按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的優(yōu)先級(jí)確定Unigene的序列方向，跟以上四個(gè)庫(kù)皆對(duì)比不上的 Unigene 用軟件 ESTScan (Iseli, Jongeneel et al.ESTScan:aprogram for detecting, evaluating, and reconstructing potential coding reg1ns inEST sequences[J].1n Proceedings of9th Internat1nal Conference on IntelligentSystems for Molecular B1logy.AAAIPress, Menlo Park, CA, pp.1999, 138-148.)預(yù)測(cè)其編碼區(qū)并確定序列的方向。對(duì)于能確定序列方向的Unigene給出其從5’到3’方向的序列，對(duì)于無(wú)法確定序列方向的Unigene給出組裝軟件得到的序列。
[0056]實(shí)施例5 百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢Unigene功能注釋
[0057]功能注釋信息給出Unigene的蛋白功能注釋、Pathway注釋、COG功能注釋和Gene Ontology(GO)功能注釋。首先,通過(guò)blastx將Unigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)nr、Swiss-Prot、KEGG和COG (evalue〈0.00001),得到跟給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。根據(jù)KEGG注釋信息能進(jìn)一步得到Unigene的Pathway注釋。將Unigene和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),預(yù)測(cè)Unigene可能的功能并對(duì)其做功能分類統(tǒng)計(jì)。根據(jù)nr注釋信息,使用Blast2G0軟件(Conesa, Gotz et al.Blast2G0:auniversal tool for annotat1n, visualizat1n and analysis in funct1nal genomicsresearch [J].B1informatics, 2005, 21 (18): 3674-3676.)得到 Unigene 的 GO 注釋信息。得到每個(gè)Unigene 的GO注釋后，用 WEGO軟件(Ye, Fang et al.WEGO: a web tool for plottingGO annotat1ns [J].Nucleic Acids Research, 2006，34:293-297.)對(duì)所有 Unigene 做 GO功能分類統(tǒng)計(jì)，從宏觀上認(rèn)識(shí)該物種的基因功能分布特征。
[0058]實(shí)施例6 百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢侵染機(jī)制和過(guò)程的分析
[0059]圖2是中國(guó)被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲機(jī)制和過(guò)程注釋圖，每年7-8月冬蟲夏草子實(shí)體成熟后，子囊孢子彈出隨雨水滲入土中，經(jīng)過(guò)發(fā)育變化形成分生孢子。此時(shí)如附在蝙蝠蛾幼蟲表，經(jīng)2-3天后即開始萌發(fā)伸出芽管，通過(guò)酶和機(jī)械力的協(xié)同作用侵入幼蟲體內(nèi)。吸收體液養(yǎng)分生長(zhǎng)并斷裂成菌絲段，以酵母狀出芽發(fā)迅速增值不斷擴(kuò)大體積。前期其代謝產(chǎn)物在血液中不斷積累，造成血液酸堿度變化，使血液失去原有的透明性而變渾濁。但不產(chǎn)生毒素與寄主幼蟲共生。后期，由于菌體增多，彌漫于幼蟲血腔，腸道亦受機(jī)械封阻，血液梨花性質(zhì)發(fā)生改變?cè)斐刹±韨Γ霈F(xiàn)代謝紊亂，幼蟲行動(dòng)癡呆，不取食。這時(shí)菌絲體迅速向體表蔓延，在幼蟲體表上出現(xiàn)細(xì)線稀疏的白色菌絲，菌絲體大量吸收幼蟲體內(nèi)水分，致使幼蟲干硬僵死形成僵蟲(即菌核)。通常，中國(guó)被毛孢會(huì)產(chǎn)生一些降解寄主昆蟲的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的酶，如幾丁質(zhì)酶、絲氨酸蛋白酶、脂酶等，以降解體壁含有的幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)、類脂等成份，從而有利于侵襲。從中國(guó)被毛孢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及注釋信息中檢測(cè)到了絲氨酸蛋白酶的Unigene。通過(guò)NCBI中的ORF Finder軟件在線檢測(cè)，找出了這個(gè)基因的開放閱讀框(SEQ ID N0.2)并得到了相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0.1)。
[0060]實(shí)施例7 百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢絲氨酸蛋白酶基因引物設(shè)計(jì)
[0061]運(yùn)用GENE RUNNER引物設(shè)計(jì)軟件根據(jù)預(yù)測(cè)得到的各基因開放閱讀框DNA序列設(shè)計(jì)引物，用于克隆“百令”生產(chǎn)菌中國(guó)被毛孢合成代謝侵染機(jī)制的絲氨酸蛋白酶基因，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所列:
[0062]serA 基因:正向引物 5’ AGAGAATTCCCGGACCTGTCGCCGGCCAC3’
[0063]反向引物 5 ’ ATAGCGGCCGCTTACCGTCCTTTTTGCCC3，
[0064]serA 基因長(zhǎng)度為 l290bp。
[0065]實(shí)施例8 百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢cDNA第一鏈的制備
[0066]先按照實(shí)施例1提供的方法培養(yǎng)出中國(guó)被毛孢發(fā)酵菌絲體后，再按照實(shí)施例2所提供的方法對(duì)中國(guó)被毛孢進(jìn)行總RNA的提取，得到總RNA后按下述進(jìn)行“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢cDNA第一鏈的合成，用于后續(xù)各基因克隆實(shí)驗(yàn)。
[0067]米用PrimeScriptlstStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)從Total RNA中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，實(shí)驗(yàn)步驟如下:
[0068]I)在Microtube管中配制下列混合液。
[0069]

【權(quán)利要求】
1.一種來(lái)自冬蟲夏草的絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述絲氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID N0.1 所示。
2.如權(quán)利要求1所述的絲氨酸蛋白酶在生物催化酪素制備酪氨酸中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為:將含絲氨酸蛋白酶基因的重組工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體用pH8.0磷酸鹽緩沖液懸浮，超聲破碎后，取破碎混合液離心，取上清液作為催化劑，以10.00mg/mL酪素溶液為底物，40°C下水浴反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，取上清液即獲得含酪氨酸的混合液；所述10.00mg/mL酪素溶液按如下步驟制備:取1.0OOg酪素用0.5mol/L的氫氧化鈉水溶液潤(rùn)濕，加入pH值為8.0的PBS緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，用緩沖液稀釋至刻度；所述氫氧化鈉水溶液的體積用量以酪素質(zhì)量計(jì)為5ml/g。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述底物的用量以酪素質(zhì)量計(jì)，所述酪素的初始濃度為5mg/mL，所述催化劑的體積用量以破碎前濕菌體的質(zhì)量計(jì)，終濃度為20g/L。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備:將含絲氨酸蛋白酶的重組工程菌接種于含終濃度50μ g/ml的Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)過(guò)夜，取培養(yǎng)物，以體積濃度2 %接種量轉(zhuǎn)接于含有50 μ g/ml Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)至菌體濃度0D600為0.6~0.8，向培養(yǎng)物中加入終濃度.0.05mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集濕菌體，將濕菌體在功率40%、破Is停Is條件下超聲破碎，取破碎混合液即為催化劑。
6.一種編碼權(quán)利要求1所述絲氨酸蛋白酶的基因。
7.如權(quán)利要求6所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
8.如權(quán)利要求6或7所述的編碼基因在構(gòu)建能夠生物催化酪素制備酪氨酸的基因工程菌中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為:構(gòu)建含有所述絲氨酸蛋白酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離純化獲得含有絲氨酸蛋白酶基因的菌體細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104130994SQ201410308921
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】柳志強(qiáng), 鄭裕國(guó), 林善, 薛亞平, 吳暉, 李邦良, 許靜, 許峰, 王鴻艷 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué), 杭州中美華東制藥有限公司