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一種嗜酸乳酸足球菌及定向生產(chǎn)瓜氨酸和鳥氨酸的方法

文檔序號(hào):480916閱讀:239來源:國知局
一種嗜酸乳酸足球菌及定向生產(chǎn)瓜氨酸和鳥氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種嗜酸乳酸足球菌及定向生產(chǎn)瓜氨酸和鳥氨酸的方法,屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述嗜酸乳酸足球菌(Pediococcus?acidilactici)BBE1120,已于2013年12月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),中國武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為CCTCC?NO:M2013732。以該菌全細(xì)胞為催化劑轉(zhuǎn)化精氨酸產(chǎn)瓜氨酸或鳥氨酸,凈轉(zhuǎn)化率可達(dá)80-90%。
【專利說明】一種嗜酸乳酸足球菌及定向生產(chǎn)瓜氨酸和鳥氨酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種嗜酸乳酸足球菌及定向生產(chǎn)瓜氨酸和鳥氨酸的方法,屬于食品生 物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 瓜氨酸能夠提高機(jī)體免疫力,平衡血糖水平,幫助保持膽固醇的正常水平。也可以 保持血管松弛,增強(qiáng)男性性功能,以及治療性功能障礙。還可以維護(hù)健康的肺功能以及提高 腦力清晰度,降低壓力和克服沮喪情緒。瓜氨酸作為抗氧化劑,可廣泛的用于化妝品,保健 食品,食品添加劑以及營養(yǎng)強(qiáng)化劑,同時(shí)還可對(duì)厭氧物質(zhì)提供保護(hù)。目前,瓜氨酸的生產(chǎn)方 法主要有化學(xué)法、酶法和發(fā)酵法?;瘜W(xué)法存在一定安全性隱患,而酶法生產(chǎn)成本較高。發(fā)酵 法是直接利用發(fā)酵所得微生物進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng),此方法成本低,產(chǎn)量高,可直接獲得產(chǎn) 物,易操作,但是產(chǎn)品純度較低,可能存在其他代謝產(chǎn)物。
[0003] 鳥氨酸能夠提高機(jī)體激素水平,因此,對(duì)于機(jī)體抗衰老是非常必要的。它有助于維 持肌肉和身體組織營養(yǎng)需求。鳥氨酸的作用包括機(jī)體的創(chuàng)傷,燒傷快速恢復(fù),能夠有效預(yù)防 感染甚至對(duì)癌癥等疾病的康復(fù)治療有著非常重要的作用。它對(duì)于治療肝硬化造成的大腦異 常(肝性腦?。┯蟹浅A己玫男Ч?。在臨床試驗(yàn)中,每天使用10_30g鳥氨酸的燒傷病人可 以更快愈合。此外,癌癥和外傷患者通過服用鳥氨酸可以加快愈合,縮短住院時(shí)間。鳥氨酸 也可以增加胰島素和激素水平。有助于減少衰老過程中的肌肉損失。鳥氨酸的生產(chǎn)主要有 合成法、酶法和發(fā)酵法3種方法。合成法是早期研究鳥氨酸時(shí)的制備方法,其過程復(fù)雜,成 本較高,而且產(chǎn)生的鳥氨酸同時(shí)有L型和D型兩種。酶法生產(chǎn)主要存在酶制劑的制取困難 以及生產(chǎn)成本較高的問題。發(fā)酵法的優(yōu)勢在于具有極低的生產(chǎn)成本,但菌種的精氨酸利用 能力是制約其產(chǎn)能的重要因素。
[0004] 乳酸菌可以把精氨酸通過精氨酸脫亞氨基途徑(ADI途徑)轉(zhuǎn)化成瓜氨酸。ADI途 徑主要由三個(gè)關(guān)鍵酶(圖1),ADI,0TC和CK。不同的培養(yǎng)條件將導(dǎo)致精氨酸代謝流向不同 的方向,可積累中間產(chǎn)物瓜氨酸或終產(chǎn)物鳥氨酸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一株嗜酸乳酸足球菌(Pediococcus acidilactici)BBE1120,已于 2013年12月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏地址是中國武漢,武漢大 學(xué),保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2013732。
[0006] 所述嗜酸乳酸足球菌分離自傳統(tǒng)醬油工藝的成曲,能夠耐受18-20% NaCl。其保 藏條件如下:從生長良好的平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接入MRS培養(yǎng)基中,在37°C靜置培養(yǎng)四天, 取500 μ L培養(yǎng)液移入含有500 μ L40%甘油的保藏管中,置于-80°C冰箱保存。所述MRS培 養(yǎng)基為培養(yǎng)乳酸桿菌專用,購于0XI0D公司。
[0007] 所述P.acidilactici BBE1120在高鹽、弱堿性以及添加 CTAB (十六烷基三甲基溴 化銨)的條件下消耗精氨酸積累瓜氨酸。
[0008] 所述高鹽條件優(yōu)選含10% -15% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的環(huán)境。
[0009] 所述弱堿性條件優(yōu)選ρΗ7· 5-8. 5。
[0010] 所述CATB的用量范圍優(yōu)選0· 5-1. Og/L。
[0011] 所述P.acidilactici BBE1120在酸性和/或添加 DNP(2,4-二硝基苯酚)的條件 下消耗精氨酸積累鳥氨酸。
[0012] 所述酸性條件優(yōu)選ρΗ3· 5-4. 5。
[0013] 所述DNP的用量范圍優(yōu)選2. 5mmol/L-5mmol/L。
[0014] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用所述嗜酸乳酸足球菌全細(xì)胞轉(zhuǎn) 化生產(chǎn)瓜氨酸的方法。
[0015] 所述方法優(yōu)選將菌體在高鹽弱堿性或添加 CTAB的條件下消耗精氨酸積累瓜氨 酸。
[0016] 所述方法進(jìn)一步優(yōu)選將菌體按l-5g/L添加到含50-100g/L精氨酸、0.5-lg/L CTAB、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L檸檬酸三胺的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在37°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化 反應(yīng)48h。
[0017] 所述方法進(jìn)一步優(yōu)選將菌體按lg/L添加到含100g/L精氨酸、0. 5g/L CTAB、20g/L 葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L檸檬酸三胺的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在37°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48h。
[0018] 所述方法還優(yōu)選菌體按l_5g/L添加到含50-100g/L精氨酸和150g/L NaCl、20g/ L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L檸檬酸三胺的pH7. 5-8. 5的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在37°C下進(jìn)行轉(zhuǎn) 化反應(yīng)120h。
[0019] 所述方法還進(jìn)一步優(yōu)選菌體按lg/L添加到含100g/L精氨酸和150g/L NaCl、20g/ L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L檸檬酸三胺的pH為8. 0全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在37°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化 反應(yīng)120h。
[0020] 所述全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液優(yōu)選檸檬酸磷酸鹽緩沖液,通過檸檬酸磷酸鹽緩沖液來調(diào)控反 應(yīng)體系的pH。
[0021] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用所述嗜酸乳酸足球菌全細(xì)胞轉(zhuǎn) 化生產(chǎn)鳥氨酸的方法。
[0022] 所述方法優(yōu)選將菌體按l_5g/L添加到含100g/L精氨酸、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白 胨、2g/L檸檬酸三胺的pH為3. 5-4. 5的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在30°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48h。
[0023] 所述方法將菌體按lg/L添加到含100g/L精氨酸、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/ L檸檬酸三胺的pH3. 5的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在30°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48h。
[0024] 所述方法進(jìn)一步優(yōu)選向反應(yīng)體系中添加 DNP以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率,DNP的用量范 圍優(yōu)選 2. 5mmol/L-5mmol/L〇
[0025] 所述全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液優(yōu)選檸檬酸磷酸鹽緩沖液,通過檸檬酸磷酸鹽緩沖液來調(diào)控反 應(yīng)體系的pH。
[0026] 用于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)瓜氨酸或鳥氨酸的細(xì)胞優(yōu)選通過以下步驟獲得:將保藏的所述 嗜酸乳酸足球菌在MRS固體培養(yǎng)基上劃線,于37°C靜置培養(yǎng)48h,挑取單菌落接入MRS液體 培養(yǎng)基,37°C靜置培養(yǎng)16h。將獲得的培養(yǎng)液以10%的接種比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,37°C 靜置培養(yǎng)1611,101^11(8000印111,4°〇低溫離心后去上清并取菌體沉淀,使用0.85%的生理 鹽水沖洗兩次后,加入到全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中用于催化反應(yīng)。
[0027] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為含有l(wèi)Og/L精氨酸的MRS培養(yǎng)基,pH5. 5。
[0028] 本發(fā)明的有益效果是找到一株可以通過改變生產(chǎn)條件而能夠同時(shí)用于生產(chǎn)瓜氨 酸和鳥氨酸的具有高精氨酸利用率的嗜酸乳酸足球菌。本發(fā)明的菌株,以精氨酸為底物、 全細(xì)胞為催化劑,在高鹽、弱堿性以及添加 CTAB條件下消耗精氨酸積累瓜氨酸,凈轉(zhuǎn)化率 90%左右;在酸性以及添加 DNP(2,4_二硝基苯酚)的條件下消耗精氨酸積累鳥氨酸,凈轉(zhuǎn) 化率80%以上。
[0029] 生物材料保藏
[0030] 嗜酸乳酸足球菌(Pediococcus acidilactici)BBE1120,已于 2013 年 12 月 31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),中國武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2013732〇

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1精氨酸脫亞氨基途徑

【具體實(shí)施方式】
[0032] 樣品中精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量的測定:
[0033] (1)樣品預(yù)處理:取200 μ L轉(zhuǎn)化上清液,加入lmL EP管中。加入800 μ L5%的三 氯乙酸,靜置5min。lmL樣品經(jīng)過0. 22 μ m水性濾頭過濾后lOOOOrpm離心lOmin,處理后的 樣品通過HPLC檢測樣品中氨基酸含量。
[0034] (2)檢測條件:安捷倫液相色譜儀Agilentl200 (美國安捷倫公司);分 析方法:采用鄰二甲苯(〇PA)、9-芴甲基氯甲酰酯(FM0C)進(jìn)行柱前衍生;色譜柱: 0DS-2Hypersil(250mmX4. 6mmX5ym);柱溫:40°C ;流速:1. OmL/min ;紫外檢測器:激發(fā)波 長 338nm。
[0035] ⑶流動(dòng)相A相:稱取5. 0g無水乙酸鈉于1000mL燒杯中,加入1000mL水?dāng)嚢柚脸?分溶解,再加入200 μ L三乙胺,攪拌并滴加5%的醋酸,將pH調(diào)到7. 20±0. 05 ;加入5 μ L四 氫呋喃,混合后備用。流動(dòng)相Β液:稱取5. 0g結(jié)晶乙酸鈉于1000mL燒杯中,加入200mL攪 拌至所有結(jié)晶溶解,滴加5 %醋酸將pH調(diào)到7. 20 ± 0. 05,將此溶液加入400mL乙腈和400mL 甲醇,混合后備用。梯度洗脫程序見表1。
[0036] 表1氨基酸分析梯度洗脫表
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一株嗜酸乳酸足球菌(Pediococcus acidilactici)BBE1120,于 2013 年 12 月 31 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址是中國武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2013732〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜酸乳酸足球菌BBE1120,其特征在于,在高鹽、弱堿性以及 添加十六烷基三甲基溴化銨的條件下消耗精氨酸積累瓜氨酸;在酸性以及添加2,4_二硝 基苯酚的條件下消耗精氨酸積累鳥氨酸;所述高鹽條件是含100-150g/L NaCl,所述弱堿性 條件是ρΗ7· 5-8. 5,所述酸性條件是ρΗ3· 5-4. 5。
3. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述嗜酸乳酸足球菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)瓜氨酸的方法,其特征在 于,是將菌體在高鹽弱堿性或添加CTAB的條件下消耗精氨酸積累瓜氨酸,所述高鹽條件是 含100-150g/L NaCl,所述弱堿性條件是ρΗ7· 5-8. 5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,將菌體按l-5g/L添加到含50-100g/L精 氨酸、0. 5-lg/L CTAB、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L檸檬酸三胺的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在 37°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法,其特征在于,將菌體按lg/L添加到含100g/L精氨 酸、0. 5g/L CTAB、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L檸檬酸三胺的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在37 °C 下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,將菌體按l-5g/L添加到含50-100g/L精 氨酸和100-150g/L NaCl、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L檸檬酸三胺的pH7. 5-8. 5的全 細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在37°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)120h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的方法,其特征在于,菌體按lg/L添加到含100g/L精氨 酸和150g/L NaCl、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L檸檬酸三胺的pH為8. 0全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液 中,在37°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)120h。
8. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述嗜酸乳酸足球菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)鳥氨酸的方法,其特征在 于,將菌體按l_5g/L添加到含100g/L精氨酸、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨,2g/L檸檬酸三胺 的pH為3. 5-4. 5的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在30°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)48h。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,將菌體按lg/L添加到含100g/L精氨酸、 20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L檸檬酸三胺的pH3. 5的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,在30°C下進(jìn)行轉(zhuǎn) 化反應(yīng)48h。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法,其特征在于,還包括向反應(yīng)體系中添加 DNP以進(jìn) 一步提高轉(zhuǎn)化率。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104099270SQ201410308979
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 方芳, 張繼冉, 劉曉慧, 張麗梅, 堵國成 申請(qǐng)人:江南大學(xué)
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