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一種酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球及其制備方法

文檔序號(hào):480918閱讀:166來(lái)源:國(guó)知局
一種酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球及其制備方法。本發(fā)明提供的酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球的制備方法,包括如下步驟:金屬離子和酶均溶解于磷酸鹽緩沖液中,即得到所述酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球;所述金屬離子為鈣離子、鎂離子、鐵離子、亞鐵離子、銅離子、二價(jià)鎳離子或鋅離子中任一種;所述磷酸鹽緩沖液中包括磷酸氫二根和磷酸二氫根。本發(fā)明提供的酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球的制備方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供的酶-無(wú)晶體復(fù)合微球中酶的穩(wěn)定性提高,酶的活性基本保持不變甚至有所提高。
【專利說(shuō)明】—種酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球及其制備方法,屬于固定化酶【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]酶作為一種生物催化劑,因其具有高選擇性、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品加工及精細(xì)化學(xué)品合成等領(lǐng)域。而多酶由兩種或以上不同的酶聯(lián)合組成,能夠進(jìn)行連續(xù)的催化反應(yīng)。多酶體系在催化過(guò)程中表現(xiàn)出高效率與協(xié)調(diào)性。然而工業(yè)催化使用中的單酶或多酶在實(shí)際工業(yè)操作條件下表現(xiàn)出穩(wěn)定性低、耐受性差、不可回收利用等缺陷,很大程度上限制了其工業(yè)應(yīng)用。固定化酶技術(shù)為解決上述問(wèn)題提供了一條途徑。
[0003]目前,固定化酶技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于工業(yè)酶催化生產(chǎn)過(guò)程,取得了一定效果。但現(xiàn)有的單酶和多酶的固定化方法存在局限性,例如制備方法復(fù)雜、固定化酶的活性收率較低以及制備成本較高等,因此探求一種操作簡(jiǎn)單、固定化酶活收率高、成本低廉的方法十分重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球及其制備方法,具體采用沉淀法制備酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球,該方法操作簡(jiǎn)單、條件溫和、成本低廉、酶活性收率高。
[0005]本發(fā)明提供的一種酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球的制備方法,包括如下步驟:
[0006]金屬離子和酶均溶解于磷酸鹽緩沖液中,即得到所述酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球;
[0007]所述金屬離子為鈣離子、鎂離子、鐵離子、亞鐵離子、銅離子、二價(jià)鎳離子或鋅離子中任一種;
[0008]所述磷酸鹽緩沖液中包括磷酸氫根和磷酸二氫根。
[0009]上述制備方法中,所述酶的分子量為5~500kD。
[0010]上述制備方法中,所述酶為南極假絲酵母脂肪酶B (Candida antarctica LipaseB)、葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase)、辣根過(guò)氧化物酶(Horse radish peroxidase)、乙醇脫氫酶(Ethanol dehydrogenase)、鹿糖酶(Invertase)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)、過(guò)氧化氫酶(Catalase)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutath1n peroxidase) >漆酶(Laccase)、葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase)、纖維二糖脫氫酶(Cellob1sedehydrogenase)、尿酸酶(Uricase)、南極假絲酵母脂肪酶 A (Candida antarctica LipaseA)、裙皺假絲酵母脂肪酶(Candida rugosa Lipase)、豬胰脂肪酶(Porcine pancreasLipase)、米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase)和疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus Lipase)中至少一種。
[0011]上述制備方法中,所述酶與所述磷酸鹽緩沖液組成的混合液中,所述酶的濃度為
0.01 ~10mg/mL,具體可為 0.5mg/mL ;
[0012]所述磷酸緩沖液中,所述磷酸氫根和所述磷酸二氫根的濃度均為I~100mM ;
[0013] 所述磷酸氫根具體可來(lái)自磷酸氫二鈉;所述磷酸二氫根具體可來(lái)自磷酸二氫鉀;
[0014]所述磷酸氫根的濃度具體可為1mM ;所述磷酸二氫根的濃度具體可為2mM ;
[0015]所述磷酸緩沖液的pH為5.0~9.0,具體可為7.4。
[0016]上述制備方法中,所述金屬離子以其水溶液的形式添加至所述磷酸鹽緩沖液中;
[0017]所述水溶液中金屬離子的濃度為10~100mM,具體可為200mM。
[0018]上述制備方法中,所述金屬離子與所述酶的質(zhì)量比為0.1~5:1,具體可為0.256:
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[0019]上述制備方法中,在靜置條件下,于O~50°C的溫度下得到所述酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球,具體可為25°C或4°C ;
[0020]所述靜置的時(shí)間為I~100小時(shí),具體可為24小時(shí)。
[0021 ] 上述制備方法中,所述混合方式為滴加混合和微反應(yīng)器混合中的任一種。
[0022]上述制備方法還包括如下步驟:干燥所述酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球;
[0023]所述干燥方式為真空常溫干燥、噴霧干燥和冷凍干燥中任一種。
[0024]本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述制備方法所制備的酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球,其中,酶的質(zhì)量含量為5%~20%,具體可為 5%~10%、5%或10%。
[0025]本發(fā)明提供的一種單酶或者多酶固定化的方法,該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明制備得到的酶-無(wú)晶體復(fù)合微球中酶的穩(wěn)定性得到極大提高,酶活性基本保持不變甚至有所提高。以上特點(diǎn)使得該種酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球在酶催化合成、生物傳感等領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為實(shí)施例6中磷酸銅晶體與酶-磷酸銅晶體復(fù)合微球的XRD及標(biāo)準(zhǔn)卡片對(duì)比圖。
[0027]圖2為實(shí)施例1所制備的酶-磷酸銅晶體復(fù)合微球的掃描電鏡圖。
[0028]圖3為實(shí)施例2所制備的酶-磷酸銅晶體復(fù)合微球的掃描電鏡圖。
[0029]圖4為實(shí)施例3所制備的酶-磷酸銅晶體復(fù)合微球的掃描電鏡圖。
[0030]圖5為實(shí)施例4所制備的酶-磷酸銅晶體復(fù)合微球的掃描電鏡圖。
[0031]圖6為實(shí)施例5所制備的酶-磷酸銅晶體復(fù)合微球的掃描電鏡圖。
[0032]圖7為實(shí)施例6所制備的酶-磷酸銅晶體復(fù)合微球的掃描電鏡圖。
[0033]圖8為實(shí)施例6所制備的酶-磷酸銅晶體復(fù)合微球和酶粉末的吸光度與葡萄糖濃度的關(guān)系曲線的對(duì)比圖。
[0034]圖9為實(shí)施例6所制備的酶-磷酸銅晶體復(fù)合微球與酶粉末的相對(duì)酶活隨時(shí)間的變化曲線。
[0035]圖10為實(shí)施例7中吸光度與不同葡萄糖濃度的關(guān)系曲線,內(nèi)嵌圖為葡萄糖濃度在O~20 μ M內(nèi)吸光度與濃度的線性關(guān)系圖。

【具體實(shí)施方式】
[0036]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明,均為常規(guī)方法。
[0037]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無(wú)特殊說(shuō)明,均可從商業(yè)途徑得到。
[0038]PBS 緩沖液(pH = 7.4)的配方:10mM HPO廣,2mM H2PO4' 137mM NaCl 和 2.7mM KCl。
[0039]下述實(shí)施例中酶的活性:南極假絲酵母脂肪酶B(約為9U/mg),葡萄糖脫氫酶(100-200U/mg),纖維二糖脫氫酶(0.25-0.40U/mg),尿酸酶(15-30U/mg),葡萄糖氧化酶(約為15U/mg),辣根過(guò)氧化物酶(約為150U/mg),如無(wú)特殊說(shuō)明所有酶購(gòu)自Sigma公司。
[0040]下述實(shí)施例中酶的負(fù)載量L由以下公式得到:

【權(quán)利要求】
1.一種酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球的制備方法,包括如下步驟: 金屬離子和酶均溶解于磷酸鹽緩沖液中,即得到所述酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球; 所述金屬離子為鈣離子、鎂離子、鐵離子、亞鐵離子、銅離子、二價(jià)鎳離子或鋅離子中任一種; 所述磷酸鹽緩沖液中包括磷酸氫二根和磷酸二氫根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法,其特征在于:所述酶的分子量為5~500kD。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備方法,其特征在于:所述酶為南極假絲酵母脂肪酶B、葡萄糖氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶、乙醇脫氫酶、蔗糖酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、漆酶、葡萄糖脫氫酶、纖維二糖脫氫酶、尿酸酶、南極假絲酵母脂肪酶A、褶皺假絲酵母脂肪酶、豬胰脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、和疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶中至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述制備方法,其特征在于:所述酶與所述磷酸鹽緩沖液組成的混合液中,所述酶的濃度為0.01~10mg/mL ; 所述磷酸緩沖液中,所述磷酸氫二根和所述磷酸二氫根的濃度均為I~100mM ; 所述磷酸緩沖液的pH為5.0~9.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述制備方法,其特征在于:所述金屬離子以其水溶液的形式添加至所述磷酸鹽緩沖液中; 所述水溶液中金屬離子的濃度為10~lOOOmM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述制備方法,其特征在于:所述金屬離子與所述酶的質(zhì)量比為0.1~5:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述制備方法,其特征在于:在靜置條件下,于O~50°C的溫度下得到所述酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球; 所述靜置的時(shí)間為1~100小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述制備方法,其特征在于:所述混合方式為滴加混合和微反應(yīng)器混合中的任一種。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述制備方法所制備的酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合微球。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK104073483SQ201410309010
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】李致賢, 戈鈞, 劉錚 申請(qǐng)人:清華大學(xué)
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