用于對番茄斑萎病毒進(jìn)行特異性檢測及絕對定量的引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于對番茄斑萎病毒進(jìn)行特異性檢測及絕對定量的引物和方法，屬于植物病毒檢測領(lǐng)域。本發(fā)明以番茄斑萎病毒為研究對象，建立了更加快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的植物病毒定量檢測方法，包括如下步驟：(1)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)獲得待測樣品cDNA；反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；并以cDNA為模板、TSWV-113F/TSWV-113R引物進(jìn)行熒光定量PCR，得到待測樣品的Ct值；(3)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品中番茄斑萎病毒的拷貝數(shù)。該方法能夠在4-5小時(shí)內(nèi)對樣品中的番茄斑萎病毒進(jìn)行準(zhǔn)確定量，不僅節(jié)約了時(shí)間、簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，還有利于在植物發(fā)病之前采取相應(yīng)的補(bǔ)救措施，防止該病毒在作物間廣泛傳播所帶來的巨大經(jīng)濟(jì)損失。
【專利說明】用于對番茄斑萎病毒進(jìn)行特異性檢測及絕對定量的引物和 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病毒檢測領(lǐng)域，具體地涉及一種用于對番茄斑萎病毒進(jìn)行特異性 檢測及絕對定量的引物和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 番爺斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV)是布尼亞病毒科 (Bunyaviridae)番爺斑萎病毒屬（Tospovirus)代表性成員之一，該病毒粒子近似球形，直 徑大約為80-110nm，其中外膜為20?25nm，核殼體直徑為60nm，具有膜包被的三分體單鏈 RNA(L RNA，M RNA，S RNA)基因組，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，三個(gè)片段的5'和3'末端共有8個(gè) 保守互補(bǔ)堿基，可形成假環(huán)狀結(jié)構(gòu)。L RNA(?8. 9kb)含有一個(gè)開放閱讀框（open reading frame，0RF)，編碼病毒RNA依賴性聚合酶蛋白（RdRp) oM RNA (?4. 8kb)和S RNA (?2. 9kb) 為雙義RNA，其中M RNA病毒鏈編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSm，互補(bǔ)鏈編碼糖蛋白G1，G2的前體蛋白； S RNA病毒鏈編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs，互補(bǔ)鏈編碼核殼體蛋白（nucleocapsid protein，N)。在 自然界中，TSWV從植物到植物的傳播幾乎完全由西花薊馬通過持久的繁殖方式傳播。
[0003] TSWV于1915年由Brittlebank在澳大利亞首次發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已廣泛分布在世界上多個(gè) 國家和地區(qū)，侵染煙草、花生、辣椒、番茄、大豆、萵苣、菊花等900多種植物。它能夠?qū)Σ煌?的花卉和蔬菜作物造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，以其廣泛的寄主范圍和造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失已被 列為世界性危害最大的十種植物病毒之一。目前，植物病毒病害的防控最為主要的環(huán)節(jié)就 是植物病毒的檢測監(jiān)控。
[0004] 從最初的直接觀察到現(xiàn)在眾多技術(shù)被應(yīng)用于植物病毒的檢測，如血清學(xué)技術(shù)，電 子顯微鏡技術(shù)，分子生物學(xué)技術(shù)等。但隨著檢測要求和標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，這些常規(guī)技術(shù)越來 越難以滿足研究的要求，如傳統(tǒng)血清學(xué)ELISA方法檢測樣品通常需要1?2天，傳統(tǒng)PCR需 要耗時(shí)7?8個(gè)小時(shí)。而實(shí)時(shí)熒光定量RT-QPCR是一種相比于常規(guī)PCR靈敏度更高，更特 異的定量工具，該方法從樣品的提取到結(jié)果分析時(shí)間僅為4?5個(gè)小時(shí)，不失為一種快速的 檢測手段，且獲得的定量數(shù)據(jù)是可高度重復(fù)的。此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)或調(diào)控，以 及定量特定的核酸在不同寄主或病原體中的相對和絕對拷貝數(shù)，該技術(shù)在植物組織的病毒 檢測中已顯示出絕對的優(yōu)勢。
[0005] 熒光定量的檢測方法分為相對定量和絕對定量，相對定量是分別測定目的基因和 參比基因的量，再求出對于參比基因的目的基因的相對量，最后再進(jìn)行樣品間相對量的比 較，是對目的基因定性的一種方法。而絕對定量是對未知樣品的絕對量（拷貝數(shù)）進(jìn)行測 定的方法，不僅能對目的基因進(jìn)行定性，更主要的是能定量，對病毒的檢測更靈敏準(zhǔn)確。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種番茄斑萎病毒檢測及絕對定量的引物和方法，以番茄斑萎病毒為 研究對象，建立了更加快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的植物病毒定量檢測方法。
[0007] 本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案如下：
[0008] -種對疑似感染番茄斑萎病毒的待測植物樣品進(jìn)行斑萎病毒絕對定量的方法，包 括如下步驟：
[0009] (1)制備斑萎病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，步驟如下：
[0010] 以確定感染番茄斑萎病毒的植物為陽性樣品，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成陽性樣品 cDNA ;以陽性樣品cDNA為模板、以番茄斑萎病毒特異性引物TSWV-482F/TSWV-482R擴(kuò)增番 茄斑萎病毒特異性片段；回收該特異性片段并克隆到常用骨架載體中得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；
[0011] 測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)（copies/uL) = 6· 02X 1023(copies/ mol) X質(zhì)粒濃度（g/uL)/質(zhì)粒分子質(zhì)量（g/mol)，得出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的病毒拷貝數(shù)；
[0012] 梯度地稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，以熒光定量引物TSWV-113F/TSWV-113R對不同濃度的質(zhì) 粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR，得出各濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值；
[0013] 以各濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的病毒拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建 立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0014] 所述番茄斑萎病毒特異性引物TSWV-482F/TSWV-482R，序列為：
[0015] 5 ' -TCTGGTAGCATTCAACTTCA-3 '，
[0016] 5' -CTTCTCTGGTGTCATACTTCT-3' ；
[0017] 所述熒光定量引物TSWV-113F/TSWV-113R的序列為：
[0018] 5' -CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAG-3' /5' -TCCCGAGGTCTTTGTATTTTGC-3' ；
[0019] ⑵提取所述待測植物樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;并以cDNA為模板、 TSWV-113F/TSWV-113R引物進(jìn)行熒光定量PCR，得到待測植物樣品的Ct值；將所述Ct帶入 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算待測植物樣品中番茄斑萎病毒的拷貝數(shù)。
[0020] 所述突光定量 PCR 的體系為：模板 luL，2 X SuperReal PreMix PluslOuL，lOumol/ L 熒光定量引物 TSWV-113F/TSWV-113R 各 0.5uL，50XR0X Reference Dye5uL，RNase-free ddH203uL，總體積 20uL。
[0021] 所述熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性15min，95°C變性10s，60°C退火 32s，72°C延伸32s，40個(gè)循環(huán)。
[0022] 所述測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度采用Nano Drop2000c。
[0023] 所述常用骨架載體指pMD?18-T。
[0024] 上述任一方法在番茄斑萎病毒絕對定量中的應(yīng)用。
[0025] 用于檢測番茄斑萎病毒的特異性PCR引物，其核苷酸序列為：
[0026] TSWV-482F 5, -TCTGGTAGCATTCAACTTCA-3,；
[0027] TSWV-482R 5' -CTTCTCTGGTGTCATACTTCT-3'。
[0028] 用于檢測待測樣品是否攜帶番茄斑萎病毒的方法，包括如下步驟：
[0029] (1)提取待測樣品的RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(定量到lng/ul);
[0030] (2)以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR反應(yīng)的引物為 TSWV-482F/TSWV-482R ：
[0031] 5' -TCTGGTAGCATTCAACTTCA-3' /5' -CTTCTCTGGTGTCATACTTCT-3' ；
[0032] (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為482bp，則待測樣品中攜 帶番茄斑萎病毒；若擴(kuò)增產(chǎn)物的大小不是482bp，則待測樣品中未攜帶番茄斑萎病毒；
[0033] 所述 PCR 反應(yīng)的體系為：cDNA 模板 2uL、TSWV-482R). 5uL、TSWV-482R0. 5uL、2XES Tap MasterMixlOuL、ddH207uL，總體積 20uL ;
[0034] 所述PCR反應(yīng)的條件為：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、58°C退火45s、72°C延伸 45s，40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。
[0035] 本發(fā)明建立了一種用于待測樣品中番茄斑萎病毒絕對定量方法，包括如下步驟： (1)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；（2)獲得待測樣品cDNA ;反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;并以cDNA為 模板、TSWV-113F/TSWV-113R引物進(jìn)行熒光定量PCR，得到待測樣品的Ct值；（3)利用標(biāo)準(zhǔn) 曲線計(jì)算待測樣品中番茄斑萎病毒的拷貝數(shù)。方法準(zhǔn)確性好，靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性 好，能夠在4-5小時(shí)內(nèi)對樣品中的番茄斑萎病毒進(jìn)行準(zhǔn)確定量，不僅節(jié)約了時(shí)間、簡化了實(shí) 驗(yàn)步驟，還有利于在植物發(fā)病之前采取相應(yīng)的補(bǔ)救措施，防止該病毒在作物間廣泛傳播所 帶來的巨大經(jīng)濟(jì)損失。
[0036] 在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施例中，還提供了熒光定量PCR的優(yōu)選反應(yīng)體系和條件：弓丨 物TSWV-113F和TSWV-113R以等摩爾比配置（10umol/L) ;PCR反應(yīng)條件優(yōu)選：95°C預(yù)變性 15min，95°C變性10s，60°C退火32s，72°C延伸32s，40個(gè)循環(huán)。在此條件下進(jìn)行PCR，擴(kuò)增效 率最高，特異性最好。在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，也可以采用其它的合適的PCR反應(yīng)條件 進(jìn)行檢測。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物，本發(fā)明還提供了定性檢測番茄斑萎病毒的PCR方 法。并提供了適合該引物的PCR反應(yīng)體系和程序。經(jīng)驗(yàn)證，該方法可用于定性檢測番茄斑 萎病毒，具有良好的特異性，如圖1所示。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1. TSWV目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果及特異性檢測，
[0039] 其中Μ為50bp ladder, 1為陽性樣品（人工制備的帶TSWV的曼陀羅葉片），2_4 分別為帶TSWV的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所溫室辣椒葉片、濟(jì)寧環(huán)紋辣椒葉片、濟(jì)寧 皺縮辣椒葉片，5-7分別為帶西瓜花葉病毒W(wǎng)MV的西瓜葉片、帶煙草花葉病毒TMV的煙草葉 片、帶瓜類退綠黃化病毒病CCYV的黃瓜葉片，8為健康辣椒葉片；
[0040] 圖2.利用梯度PCR驗(yàn)證熒光定量引物的特異性，其中Μ表示Marker I，點(diǎn)樣孔1-8 為熒光定量PCR產(chǎn)物（退火溫度：54-62°C )，點(diǎn)樣孔9為陰性對照；
[0041] 圖3.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0042] 圖4. TSWV熒光定量PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0043] 圖5. TSWV熒光定量PCR檢測方法的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0044] 圖6. TSWV熒光定量PCR檢測方法的溶解曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 病毒株系：番茄斑萎病毒TSWV-YN，由浙江省農(nóng)科院植保所與微生物研究所張治 車提供。
[0046] 本實(shí)驗(yàn)室也有保存， 申請人:聲明自申請日起二十年內(nèi)，可向公眾發(fā)放用于必要的 驗(yàn)證試驗(yàn)。
[0047] 植物材料：
[0048] 帶TSWV的曼陀羅葉片：通過摩擦接種的方法將番茄斑萎病毒TSWV-YN保存在曼陀 羅植株上，經(jīng)DAS-ELISA檢測確認(rèn)發(fā)病，備用。
[0049] 疑似帶TSWV的植物葉片：取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所溫室大棚，通過判 斷葉片表現(xiàn)出斑塊狀褪綠、黃化、壞死及灼燒狀等癥狀來確定是否是疑似帶TSWV。
[0050] 主要儀器和試劑：
[0051] S-1000Thermal Cycler PCR 儀，Bio-Rad 公司；
[0052] Molecular Imager ChemiDoc XRS System.:美國 Bio-Rad 公司；
[0053] 熒光定量PCR儀7500型，美國ABI公司；
[0054] 冷凍離心機(jī)3K15,美國Sigma公司；
[0055] TRIzol Reagent RNA 提取試劑盒，Invitrogen 公司；
[0056] 質(zhì)粒小型提取試劑盒，SuperReal PreMix Plus (SYBR Green),自天根生化科技 (北京）有限公司；
[0057] DNA純化回收試劑盒，購自上海捷瑞生物工程有限公司；
[0058] cDNA 第一鏈合成試劑盒、pMD?18_T Vector Cloning Kit、Takara PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒，寶生物工程（大連）有 限公司。
[0059] 實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)與合成
[0060] 步驟1 :引物設(shè)計(jì)
[0061] 根據(jù)GENBANK數(shù)據(jù)庫已報(bào)道TSWV基因序列，將盡可能多的TSWV序列（如 JN601525. 1)下載后，使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對分析；尋找不同株系的病毒特異性和 保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物（表1)，引物由上海生工有限公司合成。
[0062]目的片段引物為：
[0063] TSWV-482F :5, -TCTGGTAGCATTCAACTTCA-3,，
[0064] TSWV-482R : 5 ' -CTTCTCTGGTGTCATACTTCT-3 '。
[0065] 熒光定量引物為：TSWV-113F :CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAG，TSWV-113R : TCCCGAGGTCTTTGTATTTTGC。
[0066] 表1本實(shí)驗(yàn)所用引物
[0067]

【權(quán)利要求】
1. 一種對疑似感染番茄斑萎病毒的待測植物樣品進(jìn)行斑萎病毒絕對定量的方法，包括 如下步驟： (1) 制備斑萎病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，步驟如下： 以確定感染番茄斑萎病毒的植物為陽性樣品，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成陽性樣品CDNA ;以 陽性樣品cDNA為模板、以番茄斑萎病毒特異性引物TSWV-482F/TSWV-482R擴(kuò)增番茄斑萎病 毒特異性片段；回收該特異性片段并克隆到常用骨架載體中得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品； 測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)（copies/uL) = 6.02X 1023(copies/mol)X 質(zhì)粒濃度（g/uL)/質(zhì)粒分子質(zhì)量（g/mol)，得出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的病毒拷貝數(shù)； 梯度地稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，以熒光定量引物TSWV-113F/TSWV-113R對不同濃度的質(zhì)粒標(biāo) 準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR，得出各濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值； 以各濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的病毒拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo) 準(zhǔn)曲線； 所述番茄斑萎病毒特異性引物TSWV-482F/TSWV-482R，序列為： 5' -TCTGGTAGCATTCAACTTCA-3'， 5' -CTTCTCTGGTGTCATACTTCT-3' ； 所述熒光定量引物TSWV-113F/TSWV-113R的序列為： 5' -CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAG-3' /5' -TCCCGAGGTCTTTGTATTTTGC-3' ； (2) 提取所述待測植物樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;并以cDNA為模板、TSWV-113F/ TSWV-113R引物進(jìn)行熒光定量PCR，得到待測植物樣品的Ct值；將所述Ct帶入所述標(biāo)準(zhǔn)曲 線中計(jì)算待測植物樣品中番茄斑萎病毒的拷貝數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述熒光定量PCR的體系為：模板luL，2 X SuperReal PreMix Plusl0uL，10umol/L 熒光定量引物 TSWV-113F/TSWV-113R 各 0· 5uL，50XR0X Reference Dye5uL，RNase_free ddH203uL，總體積 20uL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性15min， 95°C變性10s，60°C退火32s，72°C延伸32s，40個(gè)循環(huán)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度采用Nano Drop2000c。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述常用骨架載體指pMD?18-T。
6. 權(quán)利要求1?5任一所述的方法在番爺斑萎病毒絕對定量中的應(yīng)用。
7. 用于檢測番茄斑萎病毒的特異性PCR引物，其核苷酸序列為： TSWV-482F 5' -TCTGGTAGCATTCAACTTCA-3' ； TSWV-482R 5' -CTTCTCTGGTGTCATACTTCT-3'。
8. 用于檢測待測樣品是否攜帶番茄斑萎病毒的方法，包括如下步驟： (1) 提取待測樣品的RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(定量到lng/ul); (2) 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR反應(yīng)的引物為 TSWV-482F/TSWV-482R ： 5' -TCTGGTAGCATTCAACTTCA-3' /5' -CTTCTCTGGTGTCATACTTCT-3' ； (3) 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為482bp，則待測樣品中攜帶番 茄斑萎病毒；若擴(kuò)增產(chǎn)物的大小不是482bp，則待測樣品中未攜帶番茄斑萎病毒； 所述 PCR 反應(yīng)的體系為：cDNA 模板 2uL、TSWV-482R). 5uL、TSWV-482R0. 5uL、2XES Tap MasterMixlOuL、ddH207uL，總體積 20uL ; 所述PCR反應(yīng)的條件為：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、58°C退火45s、72°C延伸45s， 40個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸5min。
【文檔編號】C12N15/11GK104120193SQ201410309229
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】吳青君, 趙巍巍, 張治軍, 徐寶云, 謝文, 王少麗, 張友軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所