分離的寡核苷酸及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了分離的寡核苷酸及其應用，其中該寡核苷酸具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。在制備用于果蠅基因敲除的構建體時，將多個siRNA中相鄰的兩個siRNA通過該寡核苷酸相連，能夠使轉錄產物通過果蠅自身的剪切機制形成各自獨立的shRNA，從而同時RNAi各自的靶基因，進而，能夠同時敲除多個基因，實現(xiàn)對果蠅多基因的同時調控。
【專利說明】分離的寡核苷酸及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及分離的寡核苷酸及其應用，更具體地，涉及、 分離的核苷酸、構建體以及敲除果蠅目的基因的方法。

【背景技術】
[0002] RNA干擾（RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異降解的現(xiàn)象。RNAi技術可 以特異性的降低基因的表達，并且效率高，易于操作，所以該技術已被廣泛應用于果蠅的各 研究領域中。
[0003] 在果蠅研究中，RNAi技術一般和雙元表達系統(tǒng)相結合，實現(xiàn)轉基因果蠅中組織特 異性及特定發(fā)育時期的基因敲除。目前在果蠅中廣泛應用的雙元表達系統(tǒng)是GAL4-UAS系 統(tǒng)，該系統(tǒng)中的酵母轉錄因子基因 GAL4受特定的啟動子控制。反過來，GAL4可以激活另一 個包含上游激活序列（UAS)的外源插入基因的表達。
[0004] 目前RNAi載體普遍應用的啟動子是Hsp70,當受到GAL4激活時，該啟動子可以啟 動外源插入基因的表達。但是，當不存在GAL4時，該啟動子仍然能夠對外源插入基因發(fā)揮 啟動作用，使得外源基因存在一定量的背景表達，影響對實驗結果的判斷。
[0005] 而第三代RNAi技術是由表達載體轉錄形成短發(fā)卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)，來模擬果蠅體內天然存在的mi croRNA。shRNA再通過果蠅體內的mi croRNA途 徑產生小干擾RNA(siRNA)，從而實現(xiàn)基因敲除（Ni et al.，Nature Methods.2011May; 8(5) :405-7.)。但是，該技術只能敲除單個基因。因此，當目的基因的功能與其它基因存在 冗余，或在涉及多個基因功能的研究時，該技術不能很好的滿足研究者的需求。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的 在于提出一種能夠同時敲除果蠅的多個目的基因的手段。
[0007] 因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的 具體實施例，該寡核苷酸具有SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在制備用于果 蠅基因敲除的構建體時，將該寡核苷酸用來連接多個shRNA模板序列，即將多個siRNA中相 鄰的兩個siRNA通過該寡核苷酸相連，能夠使轉錄產物通過果蠅自身的剪切機制形成各自 獨立的shRNA，從而同時RNAi各自的靶基因，進而，能夠同時敲除多個基因，實現(xiàn)對果蠅多 基因的同時調控。在本文中，有時也將該SEQ ID N0 :1所示的寡核苷酸稱為"linker"。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種構建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構 建體包含多個siRNA，所述多個siRNA中相鄰的兩個siRNA通過前面所述的寡核苷酸相連， 其中所述多個siRNA的靶基因相同或不同。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的構建體不僅能夠 同時高效表達多個針對不同基因的siRNA，從而能夠實現(xiàn)對多基因的同時調控，還能夠表達 多個針對同一個基因 siRNA，以增強單個基因的敲除效率。并且該構建體的構建簡單方便， 表達高效穩(wěn)定，適用于果蠅所有的組織和細胞，從而能夠有效用于各種果蠅基因功能性研 究。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體進一步包含：2XQUAS序列；和/或10XUAS序 列。由此，這兩種可抑制型二元表達系統(tǒng)能夠豐富果蠅中轉基因表達、世系追蹤和基因功能 嵌合體分析的手段，使表達的調控更加靈活。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體進一步包含篩選標記基因。由此，便于篩選陽性 質粒。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述篩選標記基因為氨芐青霉素抗性基因和/或篩選 標記vermilion基因。由此，陽性質粒篩選效果好。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體進一步包含啟動子。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)， U-promoter (即U-啟動子）在果蠅各組織器官中的背景表達效率低，在受到誘導時表達效 率高，因而，根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述啟動子為U-啟動子。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實施例,所述構建體進一步包含：基因組定點整合attB序列；ftz內 含子序列；以及SV40ployA序列。由此，能夠使質粒定點整合到果蠅基因組中、翻譯效率增 強，且有利于調控轉錄終止。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體進一步包含：2個LoxP序列；以及隔絕子gypsy 序列，其中，所述隔絕子gypsy序列位于2個LoxP序列之間。由此，能夠在Cre重組酶的作 用下去掉LoxP之間的gypsy序列，達到調節(jié)siRNA表達量的目的，而且gypsy序列可以增 強基因的轉錄，進而使基因表達的調控更加靈活，基因功能分析的手段更加多樣。
[0014] 本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種敲除果蠅目的基因的方法。根據(jù)本發(fā)明 的實施例，該方法利用前面所述的構建體轉化果蠅。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方 法，不僅能夠在果蠅中同時高效表達多個針對不同基因的SiRNA，從而能夠實現(xiàn)多個基因 的同時敲除，還能夠在果蠅中表達多個針對同一個基因 siRNA，從而實現(xiàn)單個基因的高效敲 除，敲出效果好。并且，本發(fā)明的方法操作簡單，結果穩(wěn)定，適用于果蠅所有的組織和細胞， 且利用該方法易于調控果蠅的基因敲除效率，獲得的果蠅表型明顯，從而能夠有效用于果 蠅基因功能研究。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的敲除果蠅目的基因的方法利用GAL4-UAS雙元表 達載體系統(tǒng)進行所述轉化，其中所述構建體包含2 XQUAS序列；和/或10 XUAS序列。由此， 這兩種可抑制型二元表達系統(tǒng)能夠豐富果蠅中轉基因表達、世系追蹤和基因功能嵌合體分 析的手段，使該方法的表達調控更加靈活。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述轉化進一步包括：利用所述構建體轉化第一果蠅，以便 獲得第一轉基因果蠅；提供第二轉基因果蠅，所述第二轉基因果蠅能夠表達Gal4蛋白和/ 或Q蛋白；以及將所述第一轉基因果蠅與所述第二轉基因果蠅雜交，以便獲得后代轉基因 果蠅，所述后代轉基因果蠅中所述目的基因被敲除。
[0017] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0019] 圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的VADUM表達載體的圖譜；
[0020] 圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的野生型及各轉基因雄果蠅翅膀的圖片，其中
[0021] 圖2A顯示了野生型雄果蠅翅膀的圖片，
[0022] 圖2B顯示了 H1KD1與msl096_Gal4雜交后代雄果蠅翅膀的圖片，
[0023] 圖2C顯示了 H1KD2與msl096-Gal4雜交后代雄果蠅翅膀的圖片，
[0024] 圖2D顯示了 H1KD3與msl096-Gal4雜交后代雄果蠅翅膀的圖片。

【具體實施方式】
[0025] 下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明 性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的具體 實施例，該寡核苷酸具有SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列。其中，SEQ ID N0 :1所示的核苷 ：CGCGATGCTCAAGGCAAAAAAAAATCAATCAAAAAACAATTTGAAAATTCCAAAAAAAAAGCATAA TTGAACACAAAAAGTATAAAAACGGTAACAAGTGTCTGATTTTGTTTATATCATTACATGAGCATGAAAACCAAAAT TGAAAATTCTGAACTCCCGCAGTCAAGTATCCCGAAACCTCAATCAATAAAACTATATTGGCGCATTCATGCTG(SE Q ID NO :1)。
[0027] 需要說明的是，該寡核苷酸序列為一段來自于果蠅Mir2基因簇的間隔序列，是 果蠅基因組中mir-2a-l和mir-2b-2之間的序列，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該寡核苷酸帶有果蠅體內 核糖核酸酶的識別位點，將其用來連接多個shRNA模板序列，即將多個siRNA中相鄰的兩 個siRNA通過該寡核苷酸相連，能夠使轉錄產物通過果蠅自身的剪切機制形成各自獨立的 shRNA，從而同時RNAi各自的靶基因，進而，能夠同時敲除多個基因，實現(xiàn)對果蠅多基因的 同時調控。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種構建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構 建體包含多個siRNA，所述多個siRNA中相鄰的兩個siRNA通過前面所述的寡核苷酸相連， 其中所述多個siRNA的靶基因相同或不同。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的構建體不僅能夠 同時高效表達多個針對不同基因的siRNA，從而能夠實現(xiàn)對多基因的同時調控，還能夠表達 多個針對同一個基因 siRNA，以增強單個基因的敲除效率。并且該構建體的構建簡單方便， 表達高效穩(wěn)定，適用于果蠅所有的組織和細胞，從而能夠有效用于各種果蠅基因功能性研 究。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體進一步包含：2XQUAS序列；和/或10XUAS序 列。其中，需要說明的是，果蠅中目前有兩種二元表達系統(tǒng)，Gal4/UAS和QF/QUAS系統(tǒng)。它 們的工作原理是一樣的，以QF/QUAS為例，QF是一種轉錄調控因子，QUAS是DNA上QF結合 的位點，2XQUAS指含有兩個QF結合位點。當QF結合QUAS時，會啟動QUAS下游基因的轉 錄。而本發(fā)明的載體上同時包含UAS和QUAS，從而既可以用Gal4調控，也可以用QF。由此， 這兩種可抑制型二元表達系統(tǒng)能夠豐富果蠅中轉基因表達、世系追蹤和基因功能嵌合體分 析的手段，使表達的調控更加靈活。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體進一步包含篩選標記基因。由此，便于篩選陽性 質粒。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述篩選標記基因為氨芐青霉素抗性基因和/或篩選 標記vermilion基因。由此，陽性質粒篩選效果好。
[0031 ] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體進一步包含啟動子。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，U-promoter在 果蠅各組織器官中的背景表達效率低，在受到誘導時表達效率高，因而，根據(jù)本發(fā)明的一個 實施例，所述啟動子為U-啟動子。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體進一步包含：基因組定點整合attB序列；ftz內 含子序列；以及SV40ployA序列。由此，能夠使質粒定點整合到果蠅基因組中、翻譯效率增 強，且有利于調控轉錄終止。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構建體進一步包含：2個LoxP序列；以及隔絕子gypsy 序列，其中，所述隔絕子gypsy序列位于2個LoxP序列之間。由此，能夠在Cre重組酶的作 用下去掉LoxP之間的gypsy序列，達到調節(jié)siRNA表達量的目的，而且gypsy序列可以增 強基因的轉錄，進而使基因表達的調控更加靈活，基因功能分析的手段更加多樣。
[0034] 其中，根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述各元件的序列如下：
[0035] attB ：
[0036] GCTGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCGGATCAATTCGGCTTCACGTACCGTCGACGATGTAGGTCAC GGTCTCGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCACCTCACCCATCTGGT CCATCATGATGAACGGGTCGAGGTGGCGGTAGTTGATCCCGGCGAACGCGCGGCGCACCGGGAAGCCCTCGCCCTCG AAACCGCTGGGCGCGGTGGTCACGGTGAGCACGGGACGTGCGACGGCGTCGGCTGGTGCGGATACGCGGGGCAGCG TCAGCGGGTTCTCGACGGTCACGGCGGGCATGTCGACAAGCCGAATTGATCCACTAGAAGGCCTAATTC(SEQ ID NO ：44)；
[0037] ftz 內含子：
[0038] CTAGTTCTGATCTGCTAGACAATTGTTGGCATCAGGTAGGCATCACACACGATTAACAACCCCTAAAAA TACACTTTGAAAATATTGAAAATATGTTTTTGTATACATTTTTGATATTTTCAAATAATACGCAGTTATAAAACTCA TTAGCTAACCCATTTTTTCTTTGCTTATGCTTACAGATTGCAAAGAACTAGAG(SEQ ID NO ：45)；
[0039] SV40ployA ：
[0040] GGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAA GCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAMCTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATT CCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAAT GCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACC CCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCT ATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTTGATGTATAGTGCCTTGAC TAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAAC CTGAAACATAAAATGAATGGAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAG CATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTT ATCATGTCTGGTTCCA(SEQ ID NO ：46)；
[0041] LoxP ：
[0042] CTAGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATG(SEQ ID NO ：47)；
[0043] gypsy ：
[0044] TTGGCCACGTAATAAGTGTGCGTTGAATTTATTCGCAAAAACATTGCATATTTTCGGCAAAGTAAAATT TTGTTGCATACCTTATCAAAAAATAAGTGCTGCATACTTTTTAGAGAAACCAAATAATTTTTTATTGCATACCCGTT TTTAATAAAATACATTGCATACCCTCTTTTAATAAAAAATATTGCATACTTTGACGAAACAAATTTTCGTTGCATAC CCAATAAAAGATTATTATATTGCATACCCGTTTTTAATAAAATACATTGCATACCCTCTTTTAATAAAGAATATTGC ATACGTTGACGAAACAAATTTTCGTTGCATACCCAATAAAAGATTATTATATTGCATACCTTTTCTTGCCATACCAT TTAGCCGATCAATTCTGCTCGGCAACAGTATATTTGTGGTGTGCCAACCAACAAC(SEQ ID NO ：48)；
[0045] 2 X QUAS ：
[0046] CGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCCTTAAGC(SEQ ID NO ：49)；
[0047] 10XUAS ：
[0048] GCAGGTCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGT ACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGACTCCCGCGGTCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTG TCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTAC(SEQ ID N0:50)。
[0049] 本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種敲除果蠅目的基因的方法。根據(jù)本發(fā)明 的實施例，該方法利用前面所述的構建體轉化果蠅。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方 法，不僅能夠在果蠅中同時高效表達多個針對不同基因的siRNA，從而能夠實現(xiàn)多個基因 的同時敲除，還能夠在果蠅中表達多個針對同一個基因 siRNA，從而實現(xiàn)單個基因的高效敲 除，敲出效果好。并且，本發(fā)明的方法操作簡單，結果穩(wěn)定，適用于果蠅所有的組織和細胞， 且利用該方法易于調控果蠅的基因敲除效率，獲得的果蠅表型明顯，從而能夠有效用于果 蠅基因功能研究。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的敲除果蠅目的基因的方法利用GAL4-UAS雙元表 達載體系統(tǒng)進行所述轉化，其中所述構建體包含2 XQUAS序列；和/或10 XUAS序列。由此， 這兩種可抑制型二元表達系統(tǒng)能夠豐富果蠅中轉基因表達、世系追蹤和基因功能嵌合體分 析的手段，使該方法的表達調控更加靈活。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述轉化進一步包括：利用所述構建體轉化第一果蠅，以便 獲得第一轉基因果蠅；提供第二轉基因果蠅，所述第二轉基因果蠅能夠表達Gal4蛋白和/ 或Q蛋白；以及將所述第一轉基因果蠅與所述第二轉基因果蠅雜交，以便獲得后代轉基因 果蠅，所述后代轉基因果蠅中所述目的基因被敲除。
[0052] 下面將結合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的 實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條 件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件（例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等 譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社）或者按照產品說明書進行。所用試劑或 儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品，例如可以采購自Illumina公 司。
[0053] 實施例1
[0054] 構建RNAi表達載體VADUM，其具體步驟如下：
[0055] 1、載體基因元件的克隆
[0056] 1. 1、克隆基因元件所用的載體
[0057] 載體PVALIUM20用Hind III和Sac I雙酶切，與退火的合成MCS片段連接，轉化大 腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。測序得到正確的質粒記為pV-MCS，以此質粒來克隆各個基因 元件。
[0058] 退火用的MCS引物分別為：
[0059] MCS-F ：AGCTTCAGCTAGCATGAGCTCAACTGCAGATCCGCGGAATCTAGAAGCT(SEQ ID NO ：2)
[0060] MCS-R ：TCTAGATTCCGCGGATCTGCAGTTGAGCTCATGCTAGCTGA(SEQ ID NO ：3)
[0061] 1.2、克隆一個 LoxP
[0062] 質粒pV-MCS用Nhe I和Sac I雙酶切，與退火的合成LoxP片段連接，轉化大腸桿 菌ToplO,挑選陽性克隆。測序得到正確的質粒記為pV-LoxP。
[0063] 退火用的LoxP引物分別為：
[0064] LoxP-Fl ：ctagcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGagct (SEQ ID NO ：4)
[0065] LoxP-Rl ：CATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATg (SEQ ID NO ：5)
[0066] 1.3、克隆 Q-UAS
[0067] 質粒pV-LoxP用Pst I和Sac I雙酶切，與退火的合成Q-UAS片段連接，轉化大腸 桿菌ToplO,挑選陽性克隆。測序得到正確的質粒記為pV-Q-LoxP。
[0068] 退火用的Q-UAS引物序列分別為：
[0069] Q-F:CGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCCTTAAGCTGCA(SEQ ID NO ：6)
[0070] Q-R:GCTTAAGGATAAGCGATTACCCGAGGATAAGCGATTACCCGAGCGagct(SEQ ID NO ：7)
[0071] 1.4、克隆5父說5
[0072] 以pVALIUM20為模板，用引物UAS-F和UAS-R進行PCR擴增，引物序列如下：
[0073] UAS-F:AACTGCAGGTCGGAGTACTGTCCTCC(SEQ ID NO ：8)
[0074] UAS-R:AACCGCGGGAGTCTCCGCTCGGAG(SEQ ID NO ：9)
[0075] 得到123堿基PCR產物。PCR產物用Pst I和Sac II雙酶切，與經過同樣雙酶切 的質粒pV-Q-LoxP連接，轉化大腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。測序得到正確的質粒記為 pV-UAS-Q-LoxP。
[0076] 1. 5、克隆另外 5XUAS 和 U-promoter
[0077] 以pVALIUM3為模板，用引物promoter-F和promoter-R進行PCR擴增，引物序列 如下：
[0078] Promoter-F:AACCGCGGTCGGAGTACTGTCCTCC(SEQ ID NO ：10)
[0079] Promoter-R:AATCTAGACTTTGGTATGCGTCTTGTGAT(SEQ ID NO ：11)
[0080] 得到282堿基PCR產物。PCR產物用Xba I和Sac II雙酶切，與經過同樣雙酶切的 質粒pV-UAS-Q-LoxP連接，轉化大腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。測序得到正確的質粒記為 pV-U-promoter-UAS-Q-LoxP 〇
[0081] 2、表達載體的構建
[0082] 2· 1構建表達載體骨架
[0083] 載體PVALIUM20用Spe I酶切，與退火的合成MCSb片段連接，轉化大腸桿菌 ToplO,挑選陽性克隆。測序得到正確的質粒記為pV-MCS2。
[0084] 退火用的MCSb引物分別為：
[0085] MCSb-F:CTAGGCTAGCTCAGATCTTGGAATTCATCTAGACAGTA(SEQ ID N0 :12)
[0086] MCSb-R:CTAGTACTGTCTAGATGAATTCCAAGATCTGAGCTAGC(SEQ ID NO :13)
[0087] 用以下突變的方法把質粒PV-MCS2的一些酶切位點去除，方便以后的克隆。去掉 的酶切位點分別是vermilion中的EcoR V、BamH I和Xho I , vermilion和attB之間的 Xho I，attB 中的 Κρη I，以及 gypsy 中的 Mfe I。
[0088] 以質粒PV-MCS2為模板，用一對反向互補的突變引物進行PCR擴增。PCR產物用 Dpn I酶切后直接轉化大腸桿菌ToplO,挑選單克隆搖菌，提取質粒酶切鑒定得到正確的突 變質粒。用到的突變引物如下：
[0089] EcoR V -F:GGAGCGCAGATATTGATAACCAGACGAGCCACCAGTG(SEQ ID NO ：14)
[0090] EcoR V -R:CACTGGTGGCTCGTCTGGTTATCAATATCTGCGCTCC(SEQ ID NO ：15)
[0091] BamH I -F:CCAGTGCCCAACTGTTGCGATCCAATCATGCGTTG(SEQ ID NO ：16)
[0092] BamH I -R:CAACGCATGATTGGATCGCAACAGTTGGGCACTGG(SEQ ID NO ：17)
[0093] Xho I -F1:CAGATCGTGACTCCTCGACCGGCGGATGCTGGCGAAC(SEQ ID NO ：18)
[0094] Xho I -R1:GTTCGCCAGCATCCGCCGGTCGAGGAGTCACGATCTG(SEQ ID NO ：19)
[0095] Xho I -F2:GATATCATCGATCTCGACGCTGCATCCAACGCGTT(SEQ ID NO ：20)
[0096] Xho I -R2:AACGCGTTGGATGCAGCGTCGAGATCGATGATATC(SEQ ID NO ：21)
[0097] Κρη I -F:GGATCAATTCGGCTTCACGTACCGTCGACGATGTA(SEQ ID NO ：22)
[0098] Κρη I -R:TACATCGTCGACGGTACGTGAAGCCGAATTGATCC(SEQ ID NO ：23)
[0099] Mfe I -F:CCATTTAGCCGATCAATTCTGCTCGGCAACAGTATAT(SEQ ID NO ：24)
[0100] Mfe I -R:ATATACTGTTGCCGAGCAGAATTGATCGGCTAAATGG(SEQ ID NO ：25)
[0101] 突變后的質粒記為pVAM，以此為骨架構建表達載體。
[0102] 2. 2、添加表達兀件 U-promoter、UAS、Q-UAS 和 LoxP
[0103] 質粒 pV-U-promoter-UAS-Q-LoxP 用 Xba I 和 Nhe I 雙酶切，膠回收得到 473 喊 基的片段，即U-promoter-UAS-Q-LoxP，與用同樣雙酶切的載體pVAM連接，轉化大腸桿菌 ToplO,挑選陽性克隆。質粒記為 pVAM-U-promoter-UAS-Q-LoxP,
[0104] 2. 3、添加另一個 LoxP
[0105] 質粒pVAM-U-promoter-UAS-Q-LoxP用Nhe I酶切，用堿性磷酸酶處理，再與退 火的合成LoxP片段連接，轉化大腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。測序得到正確的質粒記為 pVAM-U-promoter-UAS-Q-LoxP2 〇
[0106] 退火用的LoxP引物序列分別為：
[0107] LoxP-F2:CTAGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATG(SEQ ID NO ：26)
[0108] LoxP-R2:TAGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATA(SEQ ID NO ：27)
[0109] 2· 4、在兩個LoxP之間加入gypsy
[0110] 以pVAM為模板，用引物gypsy-F和gypsy-R進行PCR擴增。
[0111] Gypsy-F:TTACTAGTTGGCCACGTAATAAGTGTGC(SEQ ID NO ：28)
[0112] gypsy-R:TTACTAGTGTTGTTGGTTGGCACACCAC(SEQ ID NO :29)
[0113] 得到447堿基PCR產物。PCR產物用Spe I酶切，與經過Nhe I酶切和堿性磷酸酶 處理的質粒pVAM-U-promoter-UAS-Q-LoxP2連接，轉化大腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。測 序得到正確的質粒記為 pVAM-U-promoter_UAS-Q-LoxP2-gypsy。
[0114] 2. 5、添加克隆單個hairpin DNA的多克隆酶切位點MCS1
[0115] 質粒PVALIUM20用Xba I和Spe I雙酶切，膠回收730堿基的片段，與用同樣雙 酶切的質粒pVAM-U-promoter-UAS-Q-LoxP2-gypsy連接，轉化大腸桿菌ToplO,挑選陽性克 隆。正確的質粒記為 pVAM-U-promoter_UAS-Q-LoxP2-gypsy-MCSl。
[0116] 2. 6、添加連接多個 hairpin DNA 的 linker
[0117] 以果蠅基因組為模板，用引物linker-F和linker-R進行PCR擴增。
[0118] Linker-F:AATCTAGACGCGATGCTCAAGGCAAAAA(SEQ ID NO :30)
[0119] 1inker-R:AACCTAGGCAGCATGAATGCGCCAATAT(SEQ ID NO :31)
[0120] 得到233堿基PCR產物。PCR產物用Xba I和Avr II雙酶切，與經過Avr II酶切和 堿性磷酸酶處理的質粒pVAM-U-promoter-UAS-Q-LoxP2-gypsy-MCSl連接，轉化大腸桿菌 ToplO,挑選出陽性克隆。測序得到正確的質粒記為pVAM-U-promoter_UAS-Q-LoxP2-gypsy -MCSl_linker〇
[0121] 2. 7、添加克隆多個hairpin DNA的多克隆酶切位點MCS2
[0122] 質粒 pVAM-U-promoter-UAS-Q-LoxP2-gypsy-MCSl_linker 用 Spe I 酶切，用喊性 磷酸酶處理，再與退火的合成MCS2片段連接，轉化大腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。測序得 到正確的質粒作為表達載體，記為VADUM，如圖1所示。
[0123] 實施例2
[0124] Polycomb Group (PcG)蛋白是在果蠅中首次發(fā)現(xiàn)的一類能夠重塑染色質從而使特 定基因在表觀遺傳上維持沉默的蛋白質家族，在發(fā)育過程中起著非常重要的作用。PcG蛋 白通過形成不同的蛋白復合體發(fā)揮作用，其中包括兩種抑制復合體，Polycomb repressive complexesland2(PRCland PRC2)。果妮的核心 PRC1 由 4 種蛋白構成，Polycomb(Pc)、Sex combs extra (See)、Polyhomeotic(Ph)和 Posterior sex combs (Psc)。由于 PRC1 復合體 組成的復雜及多變性，它的功能及生理作用還不是很清楚。尤其是單獨敲除核心PRC1的4 種組分往往沒有明顯的表型，這給PRC1功能的研究造成很大的困擾。利用本發(fā)明可以同時 抑制這4種蛋白的表達，得到與單個基因敲除不同的表型，給PRC1功能的研究帶來便利。
[0125] 按照下面的方法，利用本發(fā)明的構建體同時抑制果蠅PRC1復合體中的各蛋白：
[0126] 1、抑制核心PRC1各組分基因表達的RNAi載體構建
[0127] 把 Pc，See，Ph 和 Psc 基因的 CDS 序列輸入 DSIR 網站（http: //biodev. extra, cea. fr/DSIR/DSIR. html)，設計只針對各個基因的21核苷酸siRNA。把21核苷酸反義核苷酸 (anti-sense oligo)序列及其反向互補序列（sense oligo)分別放在以下引物的相應位 置，得到4對分別用于各個基因的引物。
[0128] F:etageagt sense oligo tagttatattcaagcata anti-sense oligo geg
[0129] R:aattege sense oligo tatgcttgaatataacta anti-sense oligo actg
[0130] Pc-F:ctagcagtCTCATCGACATCTACGAACAAtagttatattcaagcataTTGTTCGTAGATGTCGA TGAGgcg(SEQ ID NO ：32)
[0131] Pc-R:aattcgcCTCATCGACATCTACGAACAAtatgcttgaatataactaTTGTTCGTAGATGTCGAT GAGactg(SEQ ID NO ：33)
[0132] Sce-F:ctagcagtCCGCAAGAAGCTCGTCTCCAAtagttatattcaagcataTTGGAGACGAGCTTCT TGCGGgcg(SEQ ID NO ：34)
[0133] Sce-R:aattcgcCCGCAAGAAGCTCGTCTCCAAtatgcttgaatataactaTTGGAGACGAGCTTCTT GCGGactg(SEQ ID NO ：35)
[0134] Ph-F:ctagcagtCCGGGTCAGCTGGTTCTCTTAtagttatattcaagcataTAAGAGAACCAGCTGAC CCGGgcg(SEQ ID NO ：36)
[0135] Ph-R:aattcgcCCGGGTCAGCTGGTTCTCTTAtatgcttgaatataactaTAAGAGAACCAGCTGACC CGGactg(SEQ ID NO ：37)
[0136] Psc-F:ctagcagtCCAGTCGAATATGATGTACAAtagttatattcaagcataTTGTACATCATATTCG ACTGGgcg(SEQ ID NO ：38)
[0137] Psc-R:aattcgcCCAGTCGAATATGATGTACAAtatgcttgaatataactaTTGTACATCATATTCGA CTGGactg(SEQ ID NO ：39)
[0138] 把合成的4對引物退火，分別與用Nhe I和EcoR I雙酶切的質粒VADUM連接，轉化 大腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。測序得到RNAi單個基因的重組質粒，分別記為VADUM-Pc， VADUM-Sce，VADUM-Ph 和 VADUM-Psc。
[0139] 質粒VADUM-Sce用Xba I和Spe I雙酶切，回收407堿基的小片段，再與用Spe I 單酶切和堿性磷酸酶處理的質粒VADUM-Pc連接，轉化大腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。正 確的質粒記為VADUM-Pc-Sce。質粒VADUM-Ph用Xba I和Spe I雙酶切，回收407堿基 的小片段，與用Spe I單酶切和堿性磷酸酶處理的質粒VADUM-Pc-Sce連接，轉化大腸桿 菌ToplO,經鑒定得到正確的質粒記為VADUM-Pc-Sce-Ph。最后，質粒VADUM-Psc用Xba I 和Spe I雙酶切，回收407堿基的小片段，與用Spe I單酶切和堿性磷酸酶處理的質粒 VADUM-Pc-Sce-Ph連接，轉化大腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆，就得到同時RNAi4個基因的重 組質粒，記為 VADUM-Pc-Sce-Ph-Psc。
[0140] 2、轉基因果蠅的獲得
[0141] 用顯微注射儀將上一步得到的5種RNAi載體分別注射到Ο-lh的果蠅（基因型為 y sc v nanos_integrase;attP2)胚胎中，放于25攝氏度培養(yǎng)。
[0142] 然后，將孵化出的雄果蠅與基因型為y sc v的果蠅雜交，從后代中挑選眼睛顏色 是野生型深紅色的雄果蠅，即為已整合入RNAi載體的轉基因果蠅。挑選出的雄果蠅與基因 型為y sc V;Dr，e/TM3，Sb的果蠅雜交，從后代中挑選深紅眼且短剛毛的果蠅自交，再從其 后代中挑選深紅眼且長剛毛的果蠅，就得到純合的轉基因果蠅。
[0143] 3、抑制核心PRC1各組分基因表達對果蠅發(fā)育的影響
[0144] 將本實施例步驟2得到的轉基因果蠅與nos-Gal4果蠅雜交，放于25°C培養(yǎng)，觀察 后代的表型。
[0145] 結果如下：Pc，See，Ph和Psc單獨RNAi的果蠅與野生型果蠅相比，沒有顯示出明 顯的不同；而4個基因同時被RNAi后，后代雌果蠅的卵巢明顯變小，并且不產卵。這表明核 心PRC1各組分的功能存在冗余，單獨RNAi后可能由于其他組分的作用沒有顯示出表型，同 時RNAi所有組分后才得到明顯的表型。
[0146] 實施例3
[0147] 組蛋白H1是組成真核生物染色質的5種組蛋白中的一種，不僅在染色體高級結構 的建立和維持方面具有重要作用，在細胞增殖、基因表達調控等方面也具有一定作用。果蠅 中只有一種組蛋白H1基因，是研究其功能的有利模型。但是由于果蠅組蛋白H1基因有23 個拷貝，很難得到它的突變體，傳統(tǒng)RNAi方法往往達不到理想的敲除效率。利用本發(fā)明可 以方便的調節(jié)基因敲除的效率，大大方便了其功能的研究。
[0148] 利用本發(fā)明的構建體增強組蛋白H1的敲除效率，具體方法如下：
[0149] 1、組蛋白HIRNAi載體的構建
[0150] 按照實施例2中所訴的方法設計兩對針對組蛋白H1的引物，序列如下：
[0151] HI-FI:ctagcagtTTGGTACATGTTCGCAATTAAtagttatattcaagcataTTAATTGCGAACATGT ACCAAgcg(SEQ ID NO ：40)
[0152] Hl-Rl:aattcgcTTGGTACATGTTCGCAATTAAtatgcttgaatataactaTTAATTGCGAACATGTA CCAAactg(SEQ ID NO ：41)
[0153] H1-F2:ctagcagtACCAGCGACAGTTGAGAAGAAtagttatattcaagcataTTCTTCTCAACTGTCG CTGGTgcg(SEQ ID NO ：42)
[0154] Hl-R2:aattcgcACCAGCGACAGTTGAGAAGAAtatgcttgaatataactaTTCTTCTCAACTGTCGC TGGTactg(SEQ ID NO ：43)
[0155] 兩對引物退火后，分別與用Nhe I和EcoR I雙酶切的質粒VADUM連接，轉化大 腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。測序得到RNAi組蛋白HI的重組質粒，記為VADUM-H1-1和 VADUM-H1-2。
[0156] 質粒VADUM-H1-2用Xba I和Spe I雙酶切，回收407堿基的小片段，再與用Spe I 單酶切和堿性磷酸酶處理的質粒VADUM-H1-1連接，轉化大腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。 正確的質粒記為VADUM-2XH1。質粒VADUM-2XH1再用Xba I和Spe I雙酶切，回收814 堿基的片段，再與用Spe I單酶切和堿性磷酸酶處理的質粒VADUM-2XH1連接，轉化大腸 桿菌ToplO,挑選陽性克隆。正確的質粒記為VADUM-4XH1。最后，質粒VADUM-4XH1用 Xba I和Spe I雙酶切，回收1628堿基的片段，與用Spe I單酶切和堿性磷酸酶處理的質粒 VADUM-4XH1連接，轉化大腸桿菌ToplO,挑選陽性克隆。正確的質粒記為VADUM-8XH1。
[0157] 2、組蛋白H1敲除對翅膀發(fā)育的影響
[0158] 使用上一步得到的 RNAi 載體 VADUM-H1-1、VADUM-4XH1 和 VADUM-8 XH1，按照實 施例2中所述的方法獲得轉基因 RNAi果蠅（即用顯微注射儀將上一步得到的5種RNAi載 體分別注射到〇-lh的果蠅（基因型為y sc v nanos-integrase;attP2)胚胎中，放于25 攝氏度培養(yǎng)。然后，將孵化出的雄果蠅與基因型為y sc v的果蠅雜交，從后代中挑選眼睛 顏色是野生型深紅色的雄果蠅，即為已整合入RNAi載體的轉基因果蠅），分別記為H1KD1、 H1KD2 和 H1KD3。
[0159] 將3種轉基因 RNAi果蠅分別與msl096-Gal4雜交，25攝氏度培養(yǎng)，觀察后代的翅 膀表型。結果如圖2所示：相對于野生型雄果蠅（wt)的翅膀，H1KD1與msl096-Gal4雜交 后代雄果蠅的翅膀無明顯差異；H1KD2與msl096-Gal4雜交后代雄果蠅的翅膀大小稍微變 小，脈絡異常且輕微卷曲；H1KD3與msl096-Gal4雜交后代雄果蠅的翅膀明顯變小，脈絡嚴 重紊亂且卷曲成一團。
[0160] 本領域技術人員均了解，傳統(tǒng)的RNAi載體很難達到H1KD3的敲除效果，而利用上 述的本發(fā)明可以方便地從弱到強調節(jié)基因的敲除效率。
[0161] 在本說明書的描述中，參考術語"一個實施例"、"一些實施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特 點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不 一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何 的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
[0162] 盡管已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解：在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權利要求及其等同物限定。
[0001] SEQUENCE LISTING <110 清華大學 <120 分離的寡核苷酸及其應用 <130 PIDC141479 <160 50 <170,. Patent In version 3. 3 CUO 1 <211 217 <212 DNA <213 Artificial <^0 <223 I.i nker \400 1 cgcgatgctc aagecaaaaa aaaatcaatc aaaaaacaat ttgaaaattc caaaaaaaaa 00 grnt nnttgn nfi-irnrinnag t/itananncg gtnnr.nngtg trtgnttttg ttT/itntrnt 120 tacatgagca tgaaaaccaa aattgaaaat tctgaactcc cgcagtcaag tatccc〇aaa 180 cctcaatcaa taaaactata ttggcgcatt catgctg 217 2 <211 49 <212x DNA <213/ Artificial <220 <223引物 <400 2 agcttcagct agcatgagct caactgcaga tccgcggaat ctagaagct 49 :210 H <211 41 <212 DNA <213 Artificial /〇20v> <223 <400> 3 tcta^atlcc pc^gatctgc a^ttgagclc dt^ctagci^, a 41 <21U 4 <211 44 <212' DN/\ <213 Artificial <^2U <223 引物 <400> 4 cta~cataac ttcqtataat gtatgctata cgaagttatg agct 44 <210 fi <211> 36 <212. DNA <213/ ArLifixia 丄 <220/ <223 引物 <100 S cataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatg 36 <210 G cm 49 <212 DNA <213 Artificial
[0002] <220 <223 引物 <400 6 cgctcgggta atcgcttatc ctcgggtaat cgcttntcct Taagctgcn 49 <210 7 <211 49 <212 i)NA <213 Artificial <220 <223 引物 <400> 7 gcttaagc;at aagcgattac ccgaggataa gcgattaccc gagcga^ct .19 <210 ft <211 26 <212 DNA <213 Arlil'icial <220 <223 引物 <400/ 8 aactgca￡；st LHgrigtdLtp tcctcu 26 <210 i) <211 <212. DNA ￠213,^ Artificial <220 <223 引物 <40?> 9 aaccgcgga gtctccgctc ggag 24 <210 10 <211 25 <211^ DNA <213^ ArtificiHl <220、 <2^3 引物 <400 10 aaccgcg^tc ggngtai --? crtcc 2? <210 11 <211 29 <212. DNA <213 Artificial <220 <223 引物 <400 11 aatctagact ttggtatgcg tcttgtgat 29 <210 12 <211 38 <212 DNA <213 Artificial <220 <223 引物 <4〇0> 12 ctaggctagc tcagatcttg gaattcatct agacagta 38 <210 13 <211 38
[0003] CM2 DM <213, Artificial d <223 引物 <100 13 ctaglactgt ctagatgaat tL'cahgatct gagctagc 38 ^10 14 <211 37 i?A2 ΠΝΑ <213 Arliricial <223 引物 <400 14 2gngcgcaga tattgataac cagacgagcc accagtg 37 <21(.) 15 <211 37 <212 DM <213 Artificial ^220 <223 引物 <400> 15 cactggtggc tcgrctggtt atcaatatct gcgctcc 37 〈210 16 C2U 3B <212 DNA <213/ Artificial <220> <223 引物 <400> 16 ccagtgccca actgttgcga tccaatcatg cgttg 35 <210 IT (1Π1 35 <212 DNA (213 Artificial <220 引物 ^400 17 caacgcatga ttggatcgca acagttgggc actgg 35 <210, 18 <211 37 <212. DNA <213 Artificial <2^0 <223 引物 <400 18 cagatcgtga ctcctcgacc ggcggatgct ggcgaac 37 <210. 19 <211 37 <212 DNA <213 Art i fj r i a1 <10 (223 引物 <400 19 gttcgccagc atccgccggt cgaggagtca cgatctg 37
[0004] <210 20 35 <212 DNA <213^ Artificial <220 <22：^ 引物 <Λ()〇 20 gn丁n1r,〇Trg FiTrtr.gnrgc ^g( n1 rrmr gtt. 35 <210 21 <21i 35 <212. DNA <213 Artificial <220 引物 <400/ 21 aacgcgttgif atgcagcgtc gagatcgatg atatc H5 <210 22 <211 35 <212 DNA <213 Artificial ?：220， <223 引物 C400> 22 U^dUdd. Lc 1 icdt-, 1 dC( dtg 1 a 35 <210 2?, <211 35 <212- DNA <213 Artificial <220 <223 引物 <AOO> 23 tacatcgtcg acggtacytg aa^ccgaatt gatcc 35 <,2W 21 <21L· 37 、212 DNA <21,^/ /Vrtificial <223引物 <400 24 ccatttagcc gatcaattct gctcggcaac a^tatat 37 '210 ^211 37 <212- DNA <213 Artificial (WO <223 引物 <400> 25 atatactgtt gcc^agcaga attgatcgqc taaatp^ 37 <.210 2G <211,· 40 <212 DNA <213 Ailirichil <220 ^223 引物 -.!0()> 26 ctagtatanc ttc&tataat gtstgctata c^aagttatg 40
[0005] 〈mo 2? <1Π1 39 <212 DNA <^2i3 Aitificial <223 引物 <400 27 tagcataact tcgtatagca tacattatac gaagttata 39 <210 28 <211 2R <2)2 DNA Artificial <220 <223/引物 <400 M ttactagttg gccacgtaat aagtgtgc 28 <210 29 <211 1^8 <212 DNA <213 Artificial <220 d3 引物 <400 29 1 tactagL^l LyUggUgg cacaccHC 28 <210 30 <2il 28 <212 DNA <213 Artificial <220 <223 引物 <400> 30 aatctagacg cgatgctcaa ggcaaaaa 28 <210 31 <211 28 ^212 DNA <213 Artificial <220 <223'引物 <100 31 aard nggr ^ gca.t.gaa.t.gc gcca.a.ta.t. 28 <2)0 32 <211 71 DNA <213 Arliricial <?^2? <223 引物 <400 32 ctagca^tct catcgacatc tacgaacaat agttatattc aagcatattg ttcgtagatg 60 tcgatgaft&c g 71 <210 3?. <211 71 <212 DNA <213/ Art.Tfir.ial <220,
[0006] <223 引物 αοο 33 aattcgcctc atcgacatct acgaacaata t.gcttgaata taactattgt tcgtagatgt 60 cgatgagact g 71 34 <211 71 <212 DNA -.213 AilificKil <220 <223 引物 <400> 34 ctagcagtcc gcaagaapct cgtctccaat r^ttatattc aagcatattg gagacgagct 60 tcrtgcgggc g 71 <210 35 (211,' 71 <212 DNA <213 Artificial <220 <223 引物 UOij 35 aattcgcccg caagaagctc gtctccaata tgcttgt^ata taactattgg agacgagctt 60 cLlgcggacl g 71 <210 <211 71 <212- DNA <213 Artificial <220 <223 引物 <'400> 36 ctaycagtcc gggtcagctg gttctcttat agttatattc aagcatitaa gagaaccagc 60 tRacccgggc g 71 .210 37 <211, 71 <212 DNA 21；^ Artificial 引物 400> 37 lattc^cccg ggtcagctgg ttctcttata tgcttgaata taactatnag ngaaccagct 60 ^acccggact g 71 <210 38 rZll 71 <212 DNA <213;. Artificial <220 引物 ααο> 38 r.tngrngrrc ngtrgnataT gatgtarmt ogrtnt,ittc angronttg tBrntriiTnT 60 Icgac tgggc g 71 ^21() 39 <211 71 -,212 DNA <213 Artificial
[0007] <220 <223 引物 <400 39 aattcgccca gtcgaatatg atgtacaata tgcttgaata taaLtcittbt acatcatatt 60 cgactggact g 71 <210 40 <211 71 <212 DNA <213' Artificial <220 <223 引物 < 4υ?> 40 ctagca^ttt ggtacatgtt cgcaattaat agttatattc aagcatatta attgcgaaca 60 fgtA.cca.figr. g 71 '、210 41 <211 71 <2]2 DNA <213 Artificial ^ *>>n 巧3引物 <400 41 nnttrgrtt^ gt.acatgttc gcaattR.n.ta. t.gctt.ganta tnactattaa ttgcgnaca.t 60 gtaccaaact g 71 <210 42 <211 71 <211^ im 、2i3,' Artificial <220/ <1^3 引物 <400> 42 ctagcagtac cagcgacagt tgagaagaat agttatattc aagcatattc ttctcaactg 60 Icgclggtgc g 71 <210 43 <211 71 CZV2 Lm <213 ArtiTirial <220 <223 引物 <400 43 aattcgcacc agcgacagtt gagaagaata tgcttgaata taactattct tctcaactgt 60 cgctggtact g 7i <210 44 <211 ?,R8 <212 謂 <213 Artificial <220 <223 dUB <4--> 44 gclgcalcca .ic^cgttggg agctctcugg atcaattcgg ctlcacgtac cj^tcgacgat 60 gtaggtc^cg gtctcgaagc cgcggtgugg gtgccagggc gtgcccttgg gctccccggg cgcgtactcc acctcaccca tctggtccnt cntgntgaac gggtcga^gt g^cggtagtt 180 gatcccg^c^ aacgcgcggc gcaccgggaa gccctcgccc tcgaaacc^c tgggcgcggt 240
[0008] ggtcacggtg agcacgggac gigcgacggc gtcggctggt gcggatacgc ggggcagcgt 300 cagegggttc tegaeggtea eggegggeat gtcgacaagc egaattgate cactagaagg 360 cctaattc 368 <210 45 <211 199 <211^ DNA <1113 Artificial <22?. ftz內含子 <400 45 ctagt tctga tctgctagac aattgttggc atcaggtagg catcacacac gattaacaac 60 ccutaaaaat acactttgaa aatattgaaa atatgttttt gtatacattt trgatatrtt 120 cnnataatac gcagttataa aactcattng ctaacccntt ttttctttgc ttntgcttnc 180 agattgcfiaa gaactagag 199 <LM0 4fi <211 701 <2)2 DNA <213^ Artificial <220 ^223 SV40 ployA <?400 46 ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg gtgt.gacata att.ggacaaa ctacctacag 60 agat.ttaaag ct.ctaaggta aatat.aaaat. ttt.taagt.gt ataatgt.gt.t aaactactga 120 ttctaattgt. tt.gtgt.attt tagattccaa cctatggaac tgatgaatgg gagcagtggt 180 ggaatgeett taat.gaggaa aacctgtt.tt gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg 240 aggctactgc tgactctcaa cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc 300 ccaaggactt tccttcagaa ttgctaagtt ttttgagtca tgctgtgttt agtaatagaa 360 ctcttgcttg etttgetatt tacaccacaa aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa 420 ttatggaaaa atatttgatg tatagtgcct tgactagaga tcataatcag ccataccaca 480 tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat 540 aaaatgaatg gaattgttgt tgttaacttg tttattgcag ettataatgg ttacaaataa 600 agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 660 ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggttcc a 70i xL'IO. i7 <211 40 d DNA d3 Artificial <1120 <223 LaxP <400 47 ctafttataac ttcgtataat gtatgetata cgaagttatg 40 <210 48 <,21L 432 <212 DNA <213 Artificial <220 <2^3 gypsy <400> 48 ItggccacgL aalHHgtgtg cgllgaaltl tiLLegctiaaa ticaLLgctiLfi 11LLeggeaa 60
[0009] agtaaaattt tgttgcatac cttatcaaaa aataagtgct gcatactttt tagagaaacc 120 aaataatttt ttattgcata cccgttttta ataaaataca ttgcataccc tcttttaata 180 aaaaatattg catactttga cgaaacaaat tttcgttgca tacccaataa aagattatta 240 tattgcatac ccgtttttaa taaaatacat tgcataccct cttttaataa agaatattgc 300 atacgt tgac gaaacaaatt Itcgttgcat acccaataaa agattattat at tgcatacc 360 ttttcttgcc ataccattta gccgatcaat tctgctcggc aacagtatat ttgtggtgtg 420 ccaaccaaca ac 432 <210- 49 <211 45 〈212 DM <213' Artificial <220 <223 2XQUAS <400 49 cgctcgggta atcgcttatc ctcgggtaat cgcttatcct taagc 45 <210 50 <211 182 <212 DNA <213 Artificial <220> <223> 10XUAS <400> 50 gcaggtcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc 60 gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagactc ccgcggtcgg 120 agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt 180 ac 182
【權利要求】
1. 一種分離的寡核苷酸，其具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2. -種構建體，其特征在于，包含多個siRNA，所述多個siRNA中相鄰的兩個siRNA通 過權利要求1所述的寡核苷酸相連，其中所述多個siRNA的靶基因相同或不同。
3. 根據(jù)權利要求2所述的構建體，其特征在于，進一步包含： 2XQUAS序列；和/或 10XUAS 序列。
4. 根據(jù)權利要求2所述的構建體，其特征在于，進一步包含篩選標記基因， 任選地，所述篩選標記基因為氨芐青霉素抗性基因和/或篩選標記vermilion基因。
5. 根據(jù)權利要求2所述的構建體，其特征在于，進一步包含啟動子， 任選地，所述啟動子為U-啟動子。
6. 根據(jù)權利要求2所述的構建體，其特征在于，進一步包含： 基因組定點整合attB序列； ftz內含子序列；以及 SV40ployA 序列。
7. 根據(jù)權利要求2所述的構建體，其特征在于，進一步包含： 2個LoxP序列；以及 隔絕子gypsy序列， 其中，所述隔絕子gypsy序列位于2個LoxP序列之間。
8. -種敲除果蠅目的基因的方法，其特征在于， 利用權利要求2-7所述的構建體轉化果蠅。
9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，利用GAL4-UAS雙元表達載體系統(tǒng)進行所 述轉化，其中所述構建體包含2XQUAS序列；和/或10XUAS序列。
10. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述轉化進一步包括： 利用所述構建體轉化第一果蠅，以便獲得第一轉基因果蠅； 提供第二轉基因果蠅，所述第二轉基因果蠅能夠表達Gal4蛋白和/或Q蛋白；以及 將所述第一轉基因果蠅與所述第二轉基因果蠅雜交，以便獲得后代轉基因果蠅，所述 后代轉基因果蠅中所述目的基因被敲除。
【文檔編號】C12N15/113GK104120127SQ201410310746
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權日:2014年7月1日
【發(fā)明者】倪建泉, 劉魯萍 申請人:清華大學