桃褐腐菌抗dmi類殺菌劑的田間檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種田間快速檢測桃褐腐菌株對DMI類殺菌劑抗性的引物，包括兩對引物，分別為外引物和內(nèi)引物，其序列分別為：MoF:TTTAAGGTACGAACACGAATC；MoB:TCGATGTAGGTGATGGAAG；MoFIP:TGTAAAAAGTATCTCTTCAATACCTTTCAAATCTAAACTACGGTA；MoBIP:GAGCAGAGTATCCCATTTAAATGTGTGAGGACTCGTTGTT。本發(fā)明還提供一種利用上述引物制備的試劑盒、一種上述的試劑盒在檢測桃褐腐菌株是否已對DMI類殺菌劑產(chǎn)生抗性中的應(yīng)用。本發(fā)明可以在噴施殺菌劑前有效預(yù)測殺菌劑是否能有效防治桃褐腐病菌的發(fā)生，從而防止對已產(chǎn)生了抗性的病菌持續(xù)噴藥而導(dǎo)致的防治失敗。
【專利說明】桃褐腐菌抗DMI類殺菌劑的田間檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物病原菌抗藥性檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的是指一種桃褐腐菌抗Dffl類 殺菌劑的田間檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 桃褐腐病是由子囊菌鏈核盤菌（Monilinia SPP.)引起的嚴(yán)重危害桃生產(chǎn)的重要 病害，除危害普通桃，該病還危害油桃、樓桃、杏、李等核果類果樹，其中一些種甚至還危害 蘋果、梨等仁果類果樹。褐腐病遍布全球，其中W美國，亞洲、歐洲部分國家危害最為嚴(yán)重， 在采前及采后均能造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失。
[0003] 目前使用殺菌劑在是控制該病的主要手段。生產(chǎn)上常用醬醇脫甲基化酶抑制劑類 值Mis)殺菌劑來防治桃褐腐病菌，經(jīng)過二十多年的使用，美國佐治亞州，南卡羅來納州，紐 約州及俄亥俄州都陸續(xù)出現(xiàn)了 DMIs抗性菌株，導(dǎo)致不少果園出現(xiàn)防治失敗的現(xiàn)象，造成較 大經(jīng)濟損失。
[0004] 對抗性菌株進(jìn)行分子研究發(fā)現(xiàn)，抗性菌株的MfCYP51基因的上游調(diào)控區(qū)都存在一 個65堿基對的插入片斷'Mona'，是造成菌株產(chǎn)生抗性的原因。
[0005] 若在噴藥前就能明確田間是否已產(chǎn)生了抗性菌株，就可W準(zhǔn)確制定殺菌劑噴施計 劃。目前比較常用的檢測方法包括兩種，即W菌絲生長抑制為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)的菌落直徑法和 基于目標(biāo)基因的PCR技術(shù)。傳統(tǒng)的菌落直徑法需要采集田間菌株，進(jìn)行單抱分離，然后在 添加一系列濃度的農(nóng)藥培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，檢測農(nóng)藥對菌絲生長的效應(yīng)，根據(jù)EC。。（抑制中 濃度）或MIC (最低抑制濃度）鑒別抗藥性，根據(jù)Luo和Schn油el的鑒別濃度標(biāo)準(zhǔn)，即W 0. 3mg/L作為區(qū)分DMI類殺菌劑抗性和敏感菌株的標(biāo)準(zhǔn)。抗性菌株的MfCYP51基因的上游 調(diào)控區(qū)65bp的Mona片段的插入是田間大多數(shù)病原真菌對Dffl類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的原 因。在此基礎(chǔ)上設(shè)計相應(yīng)引物，通過擴增片段長度或者測序結(jié)果可W對桃褐腐菌株的抗藥 性進(jìn)行定性檢測（Luo, C.X. , Cox, K.D., Amiri, A., and Schn油el, G. 2008. Occurrence and detection of the DMI resistance-associated genetic element'Mona'in Monilinia fructicola. Plant Disease92:1099-1103.)。
[0006] 傳統(tǒng)的菌絲對藥劑的敏感性測定方法通常需要幾周時間，工作量大，測定樣本數(shù) 量有限，要求嚴(yán)格的無菌操作，難W在早期就發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株的存在?；赑CR技術(shù)的檢測 方法，所需儀器價格昂貴，對操作人員的技術(shù)要求較高，不適合在田間或者地市縣等農(nóng)業(yè)部 口推廣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)檢測周期長，工作 量大，需要無菌條件，及PCR技術(shù)對儀器和人員技術(shù)要求高的缺陷，提供一種基于分子水平 方便、靈敏、結(jié)果判斷直觀且可在田間操作的桃褐腐抗藥性檢測方法，可W保證基層技術(shù)員 在田間，兩小時內(nèi)獲得客觀、可靠的檢測結(jié)果。
[000引本發(fā)明的第二個目的是研制與上述目的配套使用的試劑盒，使地市縣等基層農(nóng)業(yè) 部口的技術(shù)人員實時掌握本地、當(dāng)年桃褐腐菌株的抗藥性情況，做好病害預(yù)防及化學(xué)防治 工作。
[0009] 本發(fā)明提供了一種桃褐腐菌抗DMI類殺菌劑的田間檢測試劑盒，它是在田間快速 檢測桃褐腐菌株是否已對醬醇脫甲基化酶抑制劑類值Mis)殺菌劑產(chǎn)生抗性的試劑盒，可 在兩小時內(nèi)從菌絲中快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的檢測出抗Dffl類殺菌劑的桃褐腐菌。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的桃褐腐菌抗DMI類殺菌劑的田間檢測的引物， 其特征在于；包括兩對引物，分別為外引物和內(nèi)引物，其序列分別為：
[0011] 外引物：
[0012] MoF:TTTAAGGTACGAACACGAATC ;
[0013] MoB:TCGATGTAGGTGATGGAAG ;
[0014] 內(nèi)引物；
[00巧]MoFIP:TGTAAAAAGTATCTCTTCAATACCTTTCAAATCTAAACTACGGTA ;
[0016] MoBIP:GAGCAGAGTATCCCATTTAAATGTGTGAGGACTCGTTGTT 〇
[0017] 本發(fā)明還提供一種上述引物制備的試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括： lOXIliermopol Buffer、BstDNA 聚合酶、dNTP(MixUire)、MgCl2溶液、外引物 MoF 和 MoB、內(nèi) 引物 MoFIP 和 MoBIP。
[001引進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括LyseGo裂解液（Thermo Scientific公司）和SYBR Green I 染料。
[0019] 本發(fā)明還提供一種上述試劑盒在檢測桃褐腐菌株是否已對Dffl類殺菌劑產(chǎn)生抗 性中的應(yīng)用。
[0020] 進(jìn)一步地，上述試劑盒的應(yīng)用，它包括如下步驟：
[0021] (1)挑取少量菌絲于lOuL Lyso Go裂解液中，100°C 5min ;
[0022] 似按照反應(yīng)體系配制溶液，所述反應(yīng)體系（2加^包括；10 X化ermopol Buffer2. 5uL, dNTPs (lOmmol/L) 3uL, (25mmol/L) 5. OuL, MoF (lOumol/L) 0. 3uL, MoB(10umol/L)0. 3uL，MoFIP(10umol/L)3.加L，MoBIP(10umol/L)3.加L，DM 模板 5. 9uL， Bst DM聚合酶巧U/uL) luL ;所述DM模板為挑取了菌絲的Lyso Go裂解液；ere 75min， 85°C lOmin ；
[002引 做在所得擴增產(chǎn)物中加入luL SYBR Green I染料，觀察顏色反應(yīng)，得出結(jié)果。
[0024] 本發(fā)明的試劑盒能在噴施殺菌劑前就可W準(zhǔn)確預(yù)測出田間是否已產(chǎn)生了 DMI類 殺菌劑抗性菌株，該試劑盒可W在一個半小時內(nèi)，在不需要貴重繁瑣的實驗室儀器的條件 下，通過清晰的顏色反應(yīng)指示出是否存在抗性菌株，對制定科學(xué)的病菌治理策略，保證桃產(chǎn) 業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。
[0025] 本發(fā)明克服傳統(tǒng)技術(shù)中桃褐腐菌對Dffl類殺菌劑的敏感性測定方法耗時，工作量 大，測定樣本數(shù)量有限，要求嚴(yán)格的無菌操作，難W在早期發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株的存在的問題。 同時也克服了基于PCR技術(shù)的檢測方法，所需儀器價格昂貴，對操作人員技術(shù)要求高，難W 在基層農(nóng)業(yè)部口及田間開展的問題。能在田間，快速，準(zhǔn)確檢測大量樣本，檢測準(zhǔn)確率達(dá)到 95% W上，對制定科學(xué)的病菌治理策略，保證桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。
[0026] 本發(fā)明桃褐腐菌抗Dffl類殺菌劑的田間檢測試劑盒和現(xiàn)有其他技術(shù)相比，具有如 下優(yōu)點和積極效果：
[0027] 1、本發(fā)明在已知桃褐腐菌抗DMI類殺菌劑分子機理的研究基礎(chǔ)上，根據(jù)65bp堿基 對的插入，應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)，使檢測桃褐腐菌對Dffl類殺菌劑的抗藥性不需要昂 貴的PCR儀器，在田間條件下就能快速、準(zhǔn)確檢測大量樣本，使在噴施殺菌劑前快速檢測田 間病原菌是否已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性成為可能。
[002引 2、本發(fā)明提供可W特異性和桃褐腐菌對Dffl殺菌劑抗性產(chǎn)生的65bp插入片段相 結(jié)合的四對環(huán)化引物，及其高效準(zhǔn)確便捷的檢測試劑盒及擴增條件。應(yīng)用該試劑盒可在兩 小時內(nèi)從菌絲中快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的檢測出抗Dffl類殺菌劑的桃褐腐菌，靈敏度高的 基因組DNA，檢測速度比傳統(tǒng)的檢測方法-菌落直徑法相比更快速，比普通分子檢測；分離 純化樣本，提取DNA，PCR擴增，更簡單、高效。
[0029] 3、步驟簡單易操作，不需要PCR儀等實驗室高級儀器，該對于基層植保站和田間 操作的工作有重要意義。使用特異性引物和環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)，可W達(dá)到很高的準(zhǔn)確率 和靈敏度，可W在2h內(nèi)完成對田間樣本的檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1是LAMP特異性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP對41個桃褐腐菌株DNA的擴增結(jié) 果電泳圖譜。
[003U 其中；M 代表 Marker, 1-22 依次代表抗性菌株 D-7、D-1、Dmap3-08、Bmpc5、DR1、 DR2、DR3、DR4、D貼、DR6、DR7、DR8、DR9、DRIO、DRll、DR12、DR13、DR14、DR15、DR16、DR17、 DR18, 23-41 依次代表敏感菌株 CPk6-l、HWLlO-lb、CPk3-l、ZM09-2a、YHCl 1-1、YHCl 1-2、 Y肥 11-3、Y肥 11-4、Y肥 11-5、Y肥 11-6、服la、服2a、服6a、服5a、服7a、服8a、服9a、GTCla、 GTC2a，42 W滅菌蒸饋水為對照。
[003引圖2是桃褐腐DMI抗性和敏感菌株菌絲的LAMP產(chǎn)物電泳結(jié)果。
[003引 其中；M代表Marker,選用的抗性菌株依次為D-7、D-l、Dmap3-08、Bmpc5、DRl、DR2、 DR3、DR4、D貼、DR6,選用的敏感菌株依次為 CPk6-l、HWL10-化、CPk3-l、ZM09-2a、YHCll-l、 YHC11-2、服la、服2a、GTCla、GTC2a。
[0034] 圖3是加染料后的LAMP擴增產(chǎn)物。
[0035] 其中；抗性菌株為D-7,敏感菌株為CPk3-l。

【具體實施方式】
[0036] W下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0037] 桃褐腐菌抗DMI類殺菌劑的機理是在該殺菌劑的祀標(biāo)基因MfCYP51基因的上游 調(diào)控區(qū)存在一個65堿基對的插入片斷'Mona'。擴增上述MfCYP51基因的上游調(diào)控區(qū)， 檢測是否存在65堿基對的插入，根據(jù)環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification of DM, LAMP)設(shè)計特異性引物，使擴增反應(yīng)可W在恒溫條件下進(jìn)行，不需 要室內(nèi)PCR儀等昂貴設(shè)備，其引物序列如下；
[00測外引物；
[0039] MoF:TTTAAGGTACGAACACGAATC
[0040] MoB:TCGATGTAGGTGATGGAAG
[0041] 內(nèi)引物；
[0042] MoFIP:TGTAAAAAGTATCTCTTCAATACCTTTCAAATCTAAACTACGGTA
[0043] MoBIP:GAGCAGAGTATCCCATTTAAATGTGTGAGGACTCGTTGTT
[0044] 檢測是否有上述65bp堿基對插入的檢測試劑盒（400次），含有；
[0045] 1) 10ml 10 XHiermopol Buffer
[0046] 2) 20ml25mM 的 MgCla溶液
[0047] 扣 12mll0mM 的 dNTP (Mix1:ure)
[0048] 4) 1. 2mll0uM 的外引物 MoF 和 MoB
[0049] 5) HmllOuM 的內(nèi)引物 MoFIP 和 MoBIP
[0050] 6) 3200U 巧U/ul) Bst DM 聚合酶
[0化1] 7) 1ml 10000巧YBR Green I
[0052] 8) 5ml Lyse Go 裂解液（Thermo Scientific 公司）
[0053] 本發(fā)明一個反應(yīng)體系（2加1)，內(nèi)含；
[0化4] 10 XHiermopol Buffer 2.加L
[005引 dNTPs(lOmmol/L) 3uL
[0化6] Mg2+(25mmol/L) 5. OuL
[0057] MoF (lOumol/L) 0. 3uL
[005引 MoB(10umol/L) 0. 3uL
[0化9] MoFIP (lOumol/L) 3.加L
[0060] MoBIP (lOumol/L) 3.加L
[006U DM 模板 5.9
[0062] BstDNA 聚合酶巧U/uL) luL
[0063] 在本發(fā)明中，首先挑取少許菌絲，加入lOul lyse go試劑（Thermo Scientific公 司），100°C下裂解5分鐘。吸取5. 9ul該裂解液加入含有buffer, dNTP，Mg"，四條特異性 環(huán)化引物，DM Bst I聚合酶的混合體系中，ere下等溫擴增75分鐘，85°C 10分鐘。
[0064] 擴增完成后，加入lullOOOO巧YBR Green I染料，觀察顏色反應(yīng)。若產(chǎn)生了大量 擴增產(chǎn)物，則加入SYBR Green I染料會形成肉眼清晰可分辨的巧光綠色，若未產(chǎn)生擴增產(chǎn) 物，則加入SYBR Green I染料后不變色，仍然為褐色。加入染料后，產(chǎn)生綠色巧光的是抗性 菌株，顏色為紅褐色的為敏感菌株（如圖3所示）。
[00化]若為抗性菌株，加入染料W后呈巧光綠色，表明不可W再使用DMI類殺菌劑進(jìn)行 防治。若不為抗性菌株，加入染料后呈褐色，表明可W使用Dffl類殺菌劑進(jìn)行防治。
[0066] 實施例一；
[0067] 桃褐腐菌株（M. fructicola)的環(huán)化特異性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP的環(huán)介導(dǎo) 恒溫擴增：
[0068] 從美國南卡萊羅納州采集桃褐腐菌株，室內(nèi)常規(guī)單抱分離，獲得Dffl抗性菌株 22株，從中國湖北、云南、甘肅采集分離到Dffl敏感菌株19株。據(jù)羅等報道（文獻(xiàn)），根 據(jù)DMI殺菌劑祀標(biāo)基因MfCYP51上游區(qū)域設(shè)計引物化CYP-1F:AGAGCTACCACCCACGAGGAA和 化CYP-1R:GACCGCTGCGAAATCTCTTGA分別擴增DMI抗性和敏感菌株，測序發(fā)現(xiàn)，所有DMI抗 性菌株在MfCYP51上游區(qū)域含有65bpMona片段插入，而所有的DMI敏感菌株均不含有該插 入。
[0069] 根據(jù)該65bp序列和其上下游序列，利用LAMP引物設(shè)計的在線網(wǎng)站化ttp: // primerexplorer.化/e/)設(shè)計了環(huán)化特異性引物；
[0070] 外引物；
[0071] MoF:TTTAAGGTACGAACACGAATC
[0072] MoB:TCGATGTAGGTGATGGAAG
[007引 內(nèi)引物：
[0074] MoFIP:TGTAAAAAGTATCTCTTCAATACCTTTCAAATCTAAACTACGGTA [00 巧]MoBIP: GAGCAGAGTATCCCATTTMATGTGTGAGGACTCGTTGTT
[0076] 使用本發(fā)明中的試劑盒配方，分別用環(huán)化特異性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP，W 上述41株桃褐腐菌株的基因組DM為模板，并W滅菌蒸饋水為對照進(jìn)行PCR擴增。25ul 反應(yīng)體系中含：① 2.加llOXHiermopolBuffer 緩沖液② 3. 0uLdNTPs(Mix1:ure) (lOmmol/ L)⑨ 5. 0uLMgCl2(25mmol/L)④外引物；MoF 和 MoB(10umol/L)各 0. 3uL⑥內(nèi)引物；MoFIP 和 MoBIP(10umol/L)各 3. 5uL ⑧ DNA 模板 luL ⑦ BstDNA 聚合酶巧U/uL) luL ⑨ 4. 9uLd地2〇。 LAMP 擴增反應(yīng)條件；61°C 75min，85°C lOmin.
[0077] DMI抗性菌株通過環(huán)化特異性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP得到相應(yīng)擴增產(chǎn)物，而 敏感菌株及水對照則無相應(yīng)擴增產(chǎn)物（圖1)。
[0078] 由圖1可知，檢測的42個樣本中，1?22是DMI抗性菌株，23?41是DMI敏感菌 株，42為dd&O對照。檢測準(zhǔn)確度達(dá)100 %。
[0079] 實施例二；
[0080] 桃褐腐菌株（M.化ucticola)菌絲直接用環(huán)化特異性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP 擴增：
[0081] 2011年從美國南卡萊羅納州采集回來的桃褐腐菌株，挑取其菌絲直接用于抗藥性 檢測；挑取少量菌絲置于PCR離屯、管中，加入lOuL Lyse G〇，100°C水中加熱5min后，常溫 放置冷卻。取5. 9uL液體作為模板，用環(huán)化特異性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP對其進(jìn)行擴 增。使用本發(fā)明中的試劑盒配方，25uL反應(yīng)體系中含①2.加110X化ermopol Buffer緩 沖液② 3. OuL dNTPs(MixUire) (lOmmol/L)⑨ 5. OuL MgCl2(25mmol/L)④外引物；MoF 和 MoB(10umol/L)各 0. 3uL ⑥內(nèi)引物；MoFIP 和 MoBIP(10umol/L)各 3. 5uL ⑧ Bst DM 聚合酶 巧U/uL) luL⑦5. 9uL裂解液（約5n曲NA)為模板。擴增條件；erC 75min，85°C lOmin. [008引結(jié)果見圖2,說明直接用菌絲擴增，抗性菌株值-7, D-1，Dmap3-08, Bmpc5, DRl， DR2, DR3, DR4, D貼，DR6)可W得到相應(yīng)的擴增產(chǎn)物，而敏感菌株（CPk6-l、HWL10-化、 〔口心3-1、2]?09-23、￥肥11-1、￥肥11-2、服13、服23、61'(：13、6^23)無法得到相應(yīng)的擴增菌株。 該種方法和提取菌絲基因組DNA相比，準(zhǔn)確率相同都達(dá)到100%，且時間短，只需不到化，且 不需要昂貴的實驗室儀器。
[0083] 實施例對環(huán)化擴增產(chǎn)物進(jìn)行染色反應(yīng)
[0084] SYBRGreen I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染 料。在游離狀態(tài)下，SYBRGreen I發(fā)出微弱的巧光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，巧光大大增 強。利用該特征，若擴增產(chǎn)生大量雙鏈，在加入該染料后，會產(chǎn)生肉眼可W清晰分辨的綠色 巧光，而若未產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，加入該染料后，不會有顏色變化而呈現(xiàn)紅褐色。結(jié)果見圖3,抗 性菌株擴增染色后可產(chǎn)生綠色巧光，而敏感菌株擴增染色后為紅褐色。
[0085] 本發(fā)明試劑盒的檢測原理；Thermo Scientific公司的Lyse Go試劑可W在高溫 下2分鐘內(nèi)釋放出菌絲中的DM,從而使從分子水平上檢測菌株抗藥性成為可能?？剐跃?的MfCYP51基因的上游調(diào)控區(qū)65bp的Mona片段的插入是田間大多數(shù)病原真菌對DMI類殺 菌劑產(chǎn)生抗藥性的原因。在此基礎(chǔ)上設(shè)計相應(yīng)引物，利用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)快速擴增抗性菌株才特有的Mona片段。LAMP技術(shù) 原理是依據(jù)檢測祀基因的6個特異性區(qū)域設(shè)計4條特異引物，在60°C?65°C恒溫環(huán)境下， 利用鏈置換DNA聚合酶60?80min內(nèi)即能完成檢測工作，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán) 等步驟，即可形成大量擴增產(chǎn)物巧?10]。擴增結(jié)束后，加入SYBR Green I染料，該染料 可W結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域，并產(chǎn)生綠色激發(fā)波長。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的巧光，但一旦與雙鏈DM結(jié)合后，巧光大大增強。在本實驗所形成的大量擴增 產(chǎn)物中加入該染料，可W產(chǎn)生肉眼能清晰辨認(rèn)的綠色巧光。若加入染料后產(chǎn)生綠色巧光，說 明是Dffl抗性菌株，若未產(chǎn)生綠色巧光而呈染料本身的紅褐色，則為敏感菌株。
【權(quán)利要求】
1. 一種桃褐腐菌抗DMI類殺菌劑的田間檢測的引物，其特征在于：包括兩對引物，分別 為外引物和內(nèi)引物，其序列分別為： 外引物： MoF:TTTAAGGTACGAACACGAATC； MoB:TCGATGTAGGTGATGGAAG； 內(nèi)引物： MoFIP:TGTAAAAAGTATCTCTTCAATACCTTTCAAATCTAAACTACGGTA； MoBIP:GAGCAGAGTATCCCATTTAAATGTGTGAGGACTCGTTGTT〇
2. 利用權(quán)利要求1所述引物制備的試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括： lOXThermopolBuffer，BstDNA聚合酶，dNTP(Mixture)，1\%012溶液，外引物MoF和MoB， 內(nèi)引物MoFIP和MoBIP。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括LyseGo裂解液和 SYBRGreenI染料。
4. 一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒在檢測桃褐腐菌株是否已對DMI類殺菌劑產(chǎn)生抗 性中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒的應(yīng)用，其特征在于：它包括如下步驟： (1) 挑取少量菌絲于lOuLLysoGo裂解液中，100°C5min; (2) 按照反應(yīng)體系配制溶液，所述反應(yīng)體系（25ul)包括：10XThermopol Buffer2. 5uL,dNTPs(10mmol/L) 3uL,Mg2+(25mmol/L) 5.OuL,MoF(lOumol/L) 0. 3uL, MoB(10umol/L)0. 3uL，MoFIP(10umol/L)3. 5uL，MoBIP(10umol/L)3. 5uL，DNA模板 5. 9uL， BstDNA聚合酶（8U/uL)luL;所述DNA模板為LysoGo裂解液；61°C75min，85°ClOmin; ⑶在所得擴增產(chǎn)物中加入luLSYBRGreenI染料，觀察顏色反應(yīng)，得出結(jié)果。
【文檔編號】C12N15/11GK104513853SQ201410314219
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】羅朝喜, 陳淑寧, 林楊, 陰偉曉 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)