一種易固定化肝素酶i編碼基因及其蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種易固定化肝素酶I蛋白及其編碼基因。該蛋白可被幾丁質(zhì)高效率固定化；本發(fā)明提供的易固定化肝素酶I蛋白，其氨基酸序列如SEQ?IDNO:2.所示,本發(fā)明的蛋白的編碼基因也在保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明通過重疊延伸PCR技術(shù)設(shè)計肝素酶I基因和幾丁質(zhì)結(jié)合域融合表達(dá)可固定化的肝素酶I。
【專利說明】—種易固定化肝素酶I編碼基因及其蛋白

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶的基因工程改造，特別涉及到易固定化肝素酶I編碼基因及其蛋白。

【背景技術(shù)】
[0002]肝素酶是指一類能夠特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離出來的，其后，又發(fā)現(xiàn)在一些微生物和動物組織中也有肝素酶存在。肝素酶具有清除血液中殘存肝素、防止凝血等功能，同時對生產(chǎn)低分子肝素、研究肝素的結(jié)構(gòu)有重要的作用。然而游離的肝素酶容易失活，尤其是肝素酶I溶液在保存96h后活性只有原來的23%，此外，游離的肝素酶在發(fā)生反應(yīng)時需要將其加入底物中，反應(yīng)以后酶溶液、底物和產(chǎn)物混合在一起不容易分離，導(dǎo)致肝素酶無法重復(fù)使用，酶的利用效率低下，這為肝素酶的應(yīng)用帶來很多不便，因此，需要尋找一種既能提高肝素酶的利用效率，又能延長酶的保存時間的方法。
[0003]與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時，又克服了游離酶的不足之處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控等一系列優(yōu)點，因此，對肝素酶I的固定化是一種提高使用效果的理想選擇。目前對肝素酶 I 進(jìn)行固定化的研究較少，Howard Bernstein 等[Bernstein, H., (1987), App1.B1chem.B1tech.16, 129-143]以 CNBr-activated Sepharose 4B 為固定化材料，對肝素酶I進(jìn)行了共價交聯(lián)法的固定化，實現(xiàn)了肝素酶的固定，但是該方法的固定化效率低，我們采用相同的材料和方法得到的結(jié)果只能達(dá)到每毫升材料固定IIU的肝素酶I，而且以CNBr-activated Sepharose 4B為固定化材料成本較高。
[0004]經(jīng)過長期研究，本發(fā)明的發(fā)明人首次通過在肝素酶I的基因C端加上幾丁質(zhì)結(jié)合域后轉(zhuǎn)入工程菌中表達(dá)的方法，得到一種新型的易于固定化的肝素酶I，為實現(xiàn)高效且低成本的肝素酶I的固定化成為可能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了提供一種易固定化肝素酶I基因以及表達(dá)蛋白。
[0006]本發(fā)明所提供的肝素酶I蛋白，名稱為H印A-1-chBD，其肝素酶H印A_l_chBD是具有序列表中SEQ IDNo:2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
[0007]序列表中的SEQ ID No:2由個801個氨基酸殘基組成。
[0008]固定化肝素酶I蛋白編碼基因，名稱為IfepA-1，其具有下列核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQID N0.1的DNA序列:
2)編碼序列表中SEQID N0.2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；
序列I中的DNA序列由個2043個堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5’端第I到第2043位堿基。
[0009]擴(kuò)增該蛋白編碼基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0010]本發(fā)明的第二個目的是提供一種表達(dá)固定化肝素酶I蛋白的方法。
[0011]本發(fā)明所提供的表達(dá)易固定化肝素酶I蛋白的方法，是將含有上述肝素酶I蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)宿主菌，表達(dá)肝素酶I蛋白，且其帶有MBP標(biāo)簽。
[0012]其中，所述易固定化肝素酶I編碼基因全序列是以構(gòu)建好的PMAL-C2X-HepA為模板，以 5 GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag 3 和 5 GGTCAGGCCAAGTTTtctggcagtttcgctgt 3按照常規(guī)PCR方法得到，緊接著幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域以人工合成的幾丁質(zhì)結(jié)合域為模板，以 5 CAGCGAAACTGCCAGAAAACTTGGCCTGACCGGT 和 5 GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC3，按照常規(guī)PCR方法得到后，以上述兩個PCR產(chǎn)物混合物為模板，以GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag 和 GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC 3 為引物進(jìn)行 PCR后得到。所述宿主菌可為大腸桿菌，所述大腸桿菌可為以下菌株:BL21。
[0013]易固定化肝素酶I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件可為0.1mM IPTG.16攝氏度誘導(dǎo)20小時:所采用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為H印A-1的PCR電泳圖譜。
[0015]圖2為陽性轉(zhuǎn)化子的雙酶切鑒定示意圖。
[0016]圖3為!fepA-1-chBD蛋白通過直鏈淀粉樹脂親和分離的SDS-PAGE電泳圖譜。

【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整的說明。
[0018]實施例1、缺失肝素酶I蛋白H印A-1的表達(dá)。
[0019]1、表達(dá)載體 pMal- HepA-1-chBD 的構(gòu)建。
[0020]模板PMal- H印A的構(gòu)建參考專利，專利號為CN 1312183C。
[0021] 表達(dá)載體pMal- HepA-1-chBD的構(gòu)建具體過程如下:以已經(jīng)構(gòu)建好的PMAL- HepA和幾丁質(zhì)結(jié)合域質(zhì)粒PMD19T為模板，所用的上下游引物分別為GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag (帶下劃線的喊基為 BamHI 的酶切位點)，和 GGTCAGGCCAAGTTTtctggcagtttcgctgt 3 以及，以 5 CAGCGAAACTGCCAGAAAACTTGGCCTGACCGGT 和5 GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC 3，分別引入 BamHI 和 HindIII 酶切位點，緊接著再以回收純化后的PMAL- H印A-1和幾丁質(zhì)結(jié)合域質(zhì)粒PMD19T-chBD PCR產(chǎn)物為模板以GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag 和 GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC 3 為引物擴(kuò)增該編碼基因得到H印A-1-chBD;擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:50ng模板DNA，200nmol每種引物，5XPSbuffer擴(kuò)增緩沖液，2.5uMol/L每種dNTP，I單位高保Pfu酶；擴(kuò)增程序為:95攝氏度變性5分鐘，50-60攝氏度引物退火15秒，72攝氏度引物延伸120秒，30個循環(huán)后，72攝氏度延伸5分鐘結(jié)束反應(yīng)。該PCR.結(jié)果如圖1所示，表明擴(kuò)增得到1.1kb的固定化肝素酶I基因片段。圖1中，I為幾丁質(zhì)結(jié)合域PCR回收純化產(chǎn)物，大小為174bp ;2為肝素酶I基因，大小為1047bp ；3-7分別為引物退火溫度為51、53、55、57、59、61°C擴(kuò)增固定化肝素酶基因，8為分子量marker DLl, 000,目標(biāo)片斷處為1.lkb。
[0022]將H印A-1-chBD和pMal_c2x載體分別用BamHI和HindIII雙酶切，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化BL21，提質(zhì)粒通過BamHI和HindIII雙酶切驗證。驗證結(jié)果如圖2示，同時將結(jié)果送去測序，其中序列完全正確的一株命名為重組大腸桿菌BL21 (pMal- HepA-1-chBD) 0
[0023]2、易固定化變肝素酶I蛋白H印A-1-chBD的表達(dá)。
[0024]重組大腸桿菌BL21 (pMal- H印A-1-chBD)在 LB 培養(yǎng)基(含 100ng/ml Amp) 37°C培養(yǎng)3小時，待0D600=0.7-0.8時加入0.7mM IPTG在15°C進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)20小時后菌液在8000rpm下離心1min,棄濾液后重懸在40ml 2OmmoI Tris.HCl中超聲破碎(超聲功率為150W，超聲5s，間歇時間5s，超聲200個循環(huán))，18000rpm.30min離心。
[0025]實施例2、通過直鏈淀粉柱純化肝素酶I蛋白H印A-1-chBD及肝素酶H印A-1-chBD活性測定。
[0026]1.肝素酶I蛋白！fepA-1-chBD純化。
[0027]本發(fā)明中利用的融合伙伴(fus1n partner)麥芽糖結(jié)合蛋白MBP能夠與直鏈淀粉親和吸附實現(xiàn)一步分離。具體的親和分離步驟如下:將0.7mmol IPTG誘導(dǎo)表達(dá)20小時的菌體誘導(dǎo)后菌液在8000rpm下離心1min,棄濾液后重懸在40ml 2OmmoI Tris.HCl中超聲破碎(超聲功率為150W，超聲5s，間歇時間5s，超聲200個循環(huán))，18000rpm.30min離心。離心后上清液體以0.5ml/min通過20ml預(yù)平衡的直鏈淀粉親和分離柱，通過1mM 0.5ml/min麥芽糖梯度洗脫并收集。
[0028]用1mM麥芽糖在10個柱體積下能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白洗脫。結(jié)果如圖3所示，表明經(jīng)過直鏈淀粉樹脂一步純化后目標(biāo)蛋白可占95%以上。圖3為1mM麥芽糖濃度洗脫純化后SDS-PAGE電泳圖，M為分子量marker，I, 2，3為可溶目標(biāo)蛋白H印A-1-chBD，分子量為80KD。
[0029]2.肝素酶H印A-1-chBD活性測定。
[0030]肝素酶活性測定:在5 ml石英比色皿中加入在35 1:預(yù)熱過的2.5 ml肝素濃度為I mg/ml 的 Tris-HCl (50 mM,含 CaC12 10 mM, pH7.0)緩沖液，移取 20 μL 酶液，搖勻后在232 nm測定吸光值，讀取每分鐘的變化量。以雙鍵的摩爾消光系數(shù)3500計算其形成量，換算為酶液中酶的國際單位。蛋白濃度測定采用Bradford法。
【權(quán)利要求】
1.一種易固定化肝素酶I蛋白，是由序列表中序列SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列式序列表中SEQID NO:1所述的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2所述基因的工程菌。
【文檔編號】C12N15/60GK104073480SQ201410316391
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】杜宏銀, 馬小來, 李鋰 申請人:深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司