一株能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌及其應(yīng)用。該菌株名稱為地霉屬DY4(Geotrichum?sp.DY4)，于2014年5月11日保藏于位于中國(guó)武漢武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M2014194。該菌株能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥，可用于降解多種PAEs和農(nóng)藥混合物污染，用于土壤生物修復(fù)，并為土壤中PAEs和農(nóng)藥的降解機(jī)理研究提供了一種新的種質(zhì)資源。
【專利說明】一株能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境有機(jī)污染物生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一株能同時(shí)降解鄰苯二 甲酸酯和農(nóng)藥的真菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 人類為了滿足日益增長(zhǎng)的各種物質(zhì)需求，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量使用地膜、有機(jī)農(nóng)藥、 化肥等農(nóng)用化學(xué)品，造成多種有機(jī)物對(duì)土壤的復(fù)合污染。農(nóng)田土壤中覆蓋地膜對(duì)農(nóng)作物具 有保溫保濕的效果，尤其是在大棚蔬菜和水果的種植過程中起著非常重要的作用。但是地 膜中的增塑劑-鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters, PAEs)與塑料本身很難牢固結(jié)合， 穩(wěn)定性相對(duì)較差，PAEs易從塑料地膜中滲出，造成土壤環(huán)境污染。PAEs污染不僅影響農(nóng)田 土壤質(zhì)量和植物的生長(zhǎng)，影響土壤微生物的數(shù)量和多樣性，其具有的雌激素效應(yīng)和生物累 積效應(yīng)，對(duì)人類健康也具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)優(yōu)先污染物黑名單中列出3種PAEs，分別是鄰 苯二甲酸二甲酯（DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP)和鄰苯二甲酸二辛酯（D0P)。
[0003] 農(nóng)藥也是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，對(duì)于防治病蟲害、去除雜草、調(diào)節(jié)農(nóng)作物生長(zhǎng)具有 重要的作用。但是近年來，隨著農(nóng)藥的大量生產(chǎn)和使用，農(nóng)藥污染事件頻繁發(fā)生，危害也越 來越嚴(yán)重。農(nóng)藥在滅殺有害生物的同時(shí)，也會(huì)破壞農(nóng)田的生物多樣性和生態(tài)平衡，農(nóng)藥污 染土壤和水體、糧食、蔬菜、水果等與人類的生活、生產(chǎn)密切相關(guān)的產(chǎn)品，會(huì)造成人畜中毒。 毒死蝶（chlorpyrifos)是一種廣譜高效、低殘留的有機(jī)磷殺蟲殺螨劑，被國(guó)家發(fā)改委和農(nóng) 業(yè)部列為替代高毒農(nóng)藥的重要品種，位居有機(jī)磷殺蟲劑市場(chǎng)的第一位。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥 (pyrethroids)是一類模擬天然除蟲菊素仿生合成的廣譜性殺蟲劑，含有多個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)，高 效低毒，殺蟲毒力比有機(jī)氯、有機(jī)磷農(nóng)藥等老一代殺蟲劑提高10?100倍，被廣泛使用。擬 除蟲菊酯類農(nóng)藥主要品種有溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯和聯(lián)苯 菊酯等50多種產(chǎn)品，其品種數(shù)和使用量?jī)H次于有機(jī)磷農(nóng)藥，位居殺蟲劑市場(chǎng)的第二位，其 中最常用的為氰戊菊酯。
[0004] 微生物降解是土壤中有機(jī)污染物礦化的主要途徑。生物修復(fù)被認(rèn)為是目前去除環(huán) 境中有機(jī)物的最經(jīng)濟(jì)有效的方法。近年來，關(guān)于PAEs及農(nóng)藥的細(xì)菌降解已得到廣泛研究， 但關(guān)于真菌降解的報(bào)道較少。其微生物降解研究也都是針對(duì)單一的污染物或同一類型污染 物，但對(duì)于實(shí)際土壤環(huán)境而言，有機(jī)物污染往往是多種有機(jī)物同時(shí)存在的復(fù)合污染，PAEs和 農(nóng)藥是農(nóng)田土壤中最常見有機(jī)污染物，篩選出可以同時(shí)降解兩者的真菌菌株并進(jìn)行降解過 程及機(jī)理的研究，將有助于提高土壤中PAEs和農(nóng)藥的降解效率，更好地應(yīng)用于PAEs和農(nóng)藥 有機(jī)物復(fù)合污染農(nóng)田土壤的生物修復(fù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)PAEs和農(nóng)藥復(fù)合污染農(nóng)田土壤生物修復(fù)技 術(shù)中存在的不足，提供一株能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌。
[0006] 本方面的另一目的在于提供所述的能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌的應(yīng) 用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一株能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真 菌，名稱為地霉屬DY4(Geotrichum sp. DY4)，于2014年5月11日保藏于位于中國(guó)武漢武漢 大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2014194。
[0008] 所述的鄰苯二甲酸酯包括鄰苯二甲酸二甲酯（DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP)和 鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP);
[0009] 所述的農(nóng)藥為毒死蜱和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中的一種以上；
[0010] 所述的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥優(yōu)選為氰戊菊酯和溴氰菊酯中的至少一種；
[0011] 所述的能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌可用于處理受鄰苯二甲酸酯和農(nóng) 藥污染的土壤，進(jìn)行環(huán)境污染修復(fù)。
[0012] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明提供的真菌在純培養(yǎng)條件 下7天內(nèi)對(duì)鄰苯二甲酸二甲酯（DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP)、鄰苯二甲酸二（2-乙基己） 酯（DEHP)三種PAEs的混合體系的總降解率為63. 5%?90. 9%，對(duì)毒死蜱、氰戊菊酯和溴 氰菊酯三種農(nóng)藥的混合體系的總降解率為31. 6?37. 1% ;在DBP和氰戊菊酯的混合體系 中，DY4對(duì)DBP和氰戊菊酯的降解率最高達(dá)到65. 4%和55. 8% ;30天內(nèi)，DY4將滅菌土壤中 1001^*1^1的08?和氰戊菊酯分別降解67.3(%和57.5 (%，室內(nèi)模擬田間土壤有機(jī)物降解， 人工染毒，對(duì)照不進(jìn)行滅菌處理，DY4對(duì)土壤中DBP和氰戊菊酯均有很好的降解效果。本發(fā) 明菌株可用于降解多種PAEs和農(nóng)藥混合物污染，用于土壤生物修復(fù)，并為土壤中PAEs和農(nóng) 藥的降解機(jī)理研究提供了 一種新的種質(zhì)資源。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1是地霉屬DY4對(duì)液體混合體系中DBP和氰戊菊酯的降解效果圖。
[0014] 圖2是地霉屬DY4對(duì)滅菌土壤中DBP的降解效果圖。
[0015] 圖3是地霉屬DY4對(duì)滅菌土壤中氰戊菊酯的降解效果圖。
[0016] 圖4是地霉屬DY4對(duì)自然土壤介質(zhì)中DBP的降解效果圖。
[0017] 圖5是地霉屬DY4對(duì)自然土壤介質(zhì)中氰戊菊酯的降解效果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0019] 實(shí)施例1地霉屬（Geotrichum sp. )DY4的篩選分離及其對(duì)PAEs和農(nóng)藥降解性能
[0020] (1)地霉屬（Geotrichum sp. )DY4 的篩選分離
[0021] 從廣東省某地受PAEs和農(nóng)藥污染農(nóng)田的耕層（0?20cm)取土樣。稱取土樣 l〇g，裝入有90mL去離子水、4?5粒玻璃珠的250mL三角瓶，28°C、180rpm振蕩30min，靜 置30min。取10mL上清液，在上清液中加入140mL含復(fù)合PAEs和農(nóng)藥的無機(jī)鹽培養(yǎng)基【無 機(jī)鹽培養(yǎng)基組成如下：(NH 4)2S041. 0g/L、ΚΗ2Ρ041· 0g/L、MgS04 · 7Η200· 2g/L、CaCl20. lg/L、 FeCl30. 01g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌20min，下同】中進(jìn)行3次梯度馴化。每 個(gè)梯度3種PAEs (DMP、DBP和DEHP，下同）和3種農(nóng)藥（毒死蜱、氰戊菊酯和溴氰菊酯，下 同）的濃度分別為100、200和400mg/L (總濃度為600U200和2400mg/L)，每次取10mL菌 液轉(zhuǎn)入140mL新鮮含復(fù)合PAEs和農(nóng)藥的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28°C、120rpm培養(yǎng)7d，加入氯霉 素（終濃度為質(zhì)量體積比〇. 02% )抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。最后取lmL菌液涂布平板，平板培養(yǎng)基 為馬丁氏培養(yǎng)基【葡萄糖l〇g/L、蛋白胨5g/L、KH2P0 4l. 0g/L、MgS04 ·7Η200. 5g/L，調(diào)節(jié)pH值 為7. 0,115°C高壓蒸汽滅菌20min后冷卻至55?60°C，加入氯霉素（終濃度為質(zhì)量體積比 0.02% )，固體培養(yǎng)基需加瓊脂（終濃度為質(zhì)量百分比1.5?2.0% )】，28°C培養(yǎng)7d，將不 同形態(tài)的菌落分別在馬丁氏培養(yǎng)基平板固體培養(yǎng)基上劃線得到單菌落，斜面保存。以上操 作均在無菌條件下進(jìn)行。
[0022] 接種環(huán)挑取篩選出來的真菌，分別接入馬丁氏液體培養(yǎng)基，搖床28°C、120rpm培 養(yǎng)48h誘導(dǎo)孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。分光光度計(jì)測(cè)定菌液660nm下的0D值，適當(dāng)稀釋使其濃 度一致。將10mL菌液分別加入90mL復(fù)合農(nóng)藥無機(jī)鹽培養(yǎng)基（3種農(nóng)藥的濃度均為50mg/L， 總濃度150mg/L)，28°C，120rpm培養(yǎng)7d，以不接種的復(fù)合農(nóng)藥無機(jī)鹽培養(yǎng)基為非生物降解 對(duì)照。檢測(cè)農(nóng)藥降解率和菌絲體干重。菌重測(cè)定采用干重法，將菌液用濾紙過濾后，冷凍干 燥24h后稱重。同樣的方法檢測(cè)PAEs降解率和菌絲體干重。試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。
[0023] 表1四株真菌對(duì)農(nóng)藥的降解率
[0024]

【權(quán)利要求】
1. 一株能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌，其特征在于：名稱為地霉屬 DY4(Geotrichum sp.DY4)，于2014年5月11日保藏于位于中國(guó)武漢武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2014194。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌，其特征在于：所述 的鄰苯二甲酸酯為鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯 中的一種或至少兩種形成的混合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌，其特征在于：所述 的農(nóng)藥為毒死蜱和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中的一種以上。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌，其特征在于：所述 的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥為氰戊菊酯和溴氰菊酯中的至少一種。
5. 權(quán)利要求1?4任一項(xiàng)所述的能同時(shí)降解鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥的真菌的應(yīng)用，其特 征在于：所述的真菌用于處理受鄰苯二甲酸酯和農(nóng)藥污染的土壤，進(jìn)行環(huán)境污染修復(fù)。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104087517SQ201410317731
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】蔡信德, 王冬瑩, 吳文成, 方曉航, 李詩(shī)殷 申請(qǐng)人:環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所