腸桿菌z0206細菌富硒多糖的制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，包括以下步驟：挑取腸桿菌Z0206耐硒菌株，涂布于含硒的PDA加富培養(yǎng)基上進行馴化；通過測定細菌的生長曲線，確定最佳加硒時間和培養(yǎng)時間；將耐硒馴化后的腸桿菌Z0206菌種，接種至PDA加富液體培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵；得到含有腸桿菌Z0206富硒多糖的發(fā)酵液；將發(fā)酵液中收集上清液，再制備得到富硒粗多糖粉末；將所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍體積的熱蒸餾水中，加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；取所得的蛋白酶處理液，用草酸調pH值至7.0等處理后，取上清；向所得的上清液中加入Sevag試劑，得到脫蛋白富硒多糖；將所得到的脫蛋白富硒多糖配成0.5％的多糖溶液制備獲得富硒多糖精品。
【專利說明】腸桿菌Z0206細菌富硒多糖的制備方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種耐硒菌株馴化、富硒研究及利用該菌制備富硒多糖的方法和該富 硒多糖在提高免疫調節(jié)功能和抗氧化功能中的應用，它屬于微生物學及生物工程技術領 域。

【背景技術】
[0002] 硒作為一種重要的微量元素，越來越受到科學界的重視。研究表明，硒具有提高機 體免疫力、抗氧化、解毒、抑制腫瘤、預防心血管疾病發(fā)生等功能。
[0003] 無機硒化合物毒性遠高于有機硒化合物，且生物利用率低。只有將無機硒轉化為 有機硒，才具有食用和保健價值。
[0004] 硒的生物有機化主要是通過動物、植物、微生物轉化無機硒生產有機硒。通過生物 進行硒的有機化不僅可以為人類提供富含有機硒的食品及保健品，而且又可以為畜牧業(yè)生 產提供富含有機硒的添加劑，是一個極具有廣闊前景的方法。
[0005] 部分可以進行硒有機化的微生物分泌的多糖具有免疫增強活性，表現(xiàn)出對宿主免 疫的介導和調節(jié)作用，通過刺激免疫細胞的成熟、分化和增殖，改善宿主機體平衡，達到恢 復和提高宿主細胞對淋巴因子、激素及其他生理因子的反應性。以此為基礎，這些多糖表現(xiàn) 出與免疫力相關的多種活性功能，如抗腫瘤、降血糖、抗衰老、促進肝臟和骨髓細胞的蛋白 質和核酸的合成、抗炎及抗輻射作用等。
[0006] 近年來，我們通過多次篩選、純化，從肉靈芝（陜西）上分離得到了一株胞外多糖 高產細菌菌株陰溝腸桿菌Z0206。所謂肉靈芝，在民間被稱之為"太歲"，據(jù)《本草綱目》記 載，肉靈芝為本草上品，它是在我國發(fā)現(xiàn)的一種天然珍稀物種，即被我國科學界早已認定的 一種原生質生命體，確切定名應為"特大型粘菌復合體"。初步研究表明，菌株陰溝腸桿菌 Z0206對硒有較高的耐受能力，在無機硒培養(yǎng)基上生長可以將無機硒轉化為有機硒，與其分 泌的多糖結合，以分泌的形式到達胞外，具有產量極高的特點，并且這種細菌活性富硒多糖 還具有一定的抗氧化和免疫調節(jié)活性。這種細菌富硒多糖在生物保健品及添加劑生產和開 發(fā)上有較高的實際應用價值。通過細菌的富硒培養(yǎng)，生產細菌富硒多糖作為天然保健生物 制劑，符合保健品開發(fā)及綠色飼料添加劑的發(fā)展要求，具有重要的社會現(xiàn)實意義和生態(tài)意 義。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法；包 括以下步驟：（1)腸桿菌Z0206耐硒菌株馴化：挑取腸桿菌Z0206耐硒菌株，先后涂布于含 硒量分別為10、20、30、40以及50 μ g/mL的PDA加富培養(yǎng)基上，進行硒濃度梯度馴化；每個 梯度于28-32°C培養(yǎng)24-36h ;最后從含硒量50 μ g/mL的PDA加富培養(yǎng)基平板上挑取生長 良好的菌落于平板上劃線分離，純化后斜面保存；（2)腸桿菌Z0206富硒研究：通過測定細 菌的生長曲線，確定最佳加硒時間和培養(yǎng)時間；從斜面上挑取馴化好的菌種，PDA培養(yǎng)基平 板活化培養(yǎng)24-36h后，接種于裝有PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中；28-32°C振蕩培養(yǎng)，每隔lh 無菌操作取出lmL培養(yǎng)液，用分光光度計測定580nm下的吸光值；繪制耐硒菌的生長曲線； 通過生長曲線確定加硒時間及培養(yǎng)時間；從斜面上挑取已經馴化好的耐硒菌種，接種于含 硒量分別為1〇、15、20、25、30以及35μ g/mL的PDA加富培養(yǎng)基上，28-32°C培養(yǎng)24-48h， 選取培養(yǎng)基上菌體顏色略紅、生長良好的硒濃度作為最佳硒濃度；（3)發(fā)酵液獲取：將耐硒 馴化后的腸桿菌Z0206菌種，接種至PDA加富液體培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，28-32°C往復振 蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間18_19h，得到發(fā)酵罐發(fā)酵種子液；發(fā)酵罐內加入70%發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C 蒸汽滅菌20min后，接種種子液，培養(yǎng)13h時加入無菌亞硒酸鈉溶液，使培養(yǎng)基最終含硒 量為25 μ g/mL，發(fā)酵時間48-72h，得到含有腸桿菌Z0206富硒多糖的發(fā)酵液；（4)多糖粉 末獲取：將步驟（3)所得的發(fā)酵液于60-70°C濃縮為原體積的1/10, 80-90°C水浴1-1. 5h， 5000rpm離心10_15min，收集上清液，加入3-5倍體積的預冷95%乙醇，靜置12h，5000rpm 離心10-15min，沉淀依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌2-3次，離心，沉淀真空干燥，得 到富硒粗多糖粉末；(5)蛋白酶處理：將步驟（4)所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍體積 的熱蒸餾水中，用似 20)3調pH至7. 0-9.0,加入質量為多糖質量1/40-1/20的胰蛋白酶， 55°C水解l_2h后，用草酸調pH值至5. 0-5. 7，加質量為多糖質量1/40-1/20的木瓜蛋白酶， 65-70°C水解2-3h后，于100°C水浴加熱5-6min，以終止酶反應；（6)三氯乙酸法脫蛋白：取 步驟（5)所得的蛋白酶處理液，用草酸調pH值至7. 0,加入3%的三氯乙酸，室溫下磁力攪 拌lh后，llOOOrpm離心10-15min，取上清；（7)Sevag法脫蛋白：向步驟（6)所得的上清液中 加入1/3體積的Sevag試劑，充分振蕩，混合20-30min，充分靜置分層，4000rpm離心5min, 重復操作數(shù)次至兩相界面不再出現(xiàn)蛋白沉淀；然后用3-5倍體積預冷的95%乙醇醇析，所 得的沉淀再依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌后，沉淀真空干燥，得到脫蛋白富硒多 糖；(8)脫色：將步驟（7)所得到的脫蛋白富硒多糖配成0.5%的多糖溶液，用氨水調pH至 8. 0,在50°C下滴加20%的H202，至溶液為淡黃色，保溫2h，然后用稀鹽酸中和至7. 0 ;自來 水透析2-3d，蒸餾水透析2-3d后，加入3-5倍體積的預冷95%乙醇沉淀，4°C靜置12h后， 500rpm離心10?15min，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。
[0009] 作為對本發(fā)明的腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法的改進：所述步驟（1)、 (2)、（3)中，PDA加富固體培養(yǎng)基的配方如下：馬鈴薯20%，蛋白胨0.2-0. 5%，酵母浸膏 0.3%，葡萄糖2%，瓊脂粉1.6% ;PDA加富液體培養(yǎng)基的配方如下：馬鈴薯20%，蛋白胨 0. 2-0. 5 %，酵母浸膏0. 3 %，葡萄糖2 %;發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米淀粉20 %，豆柏粉1. 6 %， 玉米漿干粉 〇· 6 %，Κ2ΗΡ04· 3Η200· 3 %，ΚΗ2Ρ040· 3 %，CaCl20. 1 %。
[0010] 作為對本發(fā)明的腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法的進一步改進：所述步驟（2) 中，搖瓶發(fā)酵條件為：接種量3-5環(huán)，往復振蕩的沖程4-10cm，振蕩頻率200-250rpm。
[0011] 作為對本發(fā)明的腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法的進一步改進：所述步驟（3) 中，發(fā)酵罐發(fā)酵條件為：接種量4%，pH值7. 5,溫度32°C，通氣量0. 25-0. 75vvm，機械攪拌 轉速 200-300rpm。
[0012] 作為對本發(fā)明的腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法的進一步改進：所述步驟（7) 中的Sevag試劑由氯仿和正丁醇組成；所述氯仿和正丁醇的體積比為4 :1。
[0013] 一種腸桿菌Z0206富硒多糖在制備增強機體抗氧化功能和免疫調節(jié)功能的保健 品或添加劑中的應用。
[0014] 本發(fā)明所用的腸桿菌Z0206是保藏號為CGMCC No. 2279的腸桿菌Z0206。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點如下：
[0016] 采用苯酚-硫酸法、凱式定氮法、突光分光光度法測定腸桿菌Z0206富硒多糖中多 糖、蛋白質和砸含量；測定結果顯不：陰溝腸桿囷Z0206 g砸粗多糖中多糖、蛋白質和砸含 量分別為：71. 23%、26. 34%及68. 16mg/kg ;陰溝腸桿菌Z0206富硒多糖中多糖、蛋白質和 硒含量分別為：99.98%、0.01%、38. 25mg/kg。結果表明，上述提取富硒多糖的生產過程簡 單，產品純度較高，富硒量較高。
[0017] 本發(fā)明制備的腸桿菌Z0206富硒多糖對血清溶血素半數(shù)溶血值（HC5(I)和抗體形成 細胞數(shù)目（PFC)均有顯著的調節(jié)作用，對H 202誘導氧化損傷RAW264. 7細胞內SOD、GSH-Px 活性和MDA含量也具有顯著的調節(jié)作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0019] 圖1是本發(fā)明的中Z0206細菌生長曲線示意圖。

【具體實施方式】
[0020] 以下實施例中所用腸桿菌Z0206是保藏號為CGMCC No. 2279的腸桿菌Z0206。
[0021] 實施例1、腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法
[0022] PDA加富培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯20 %，蛋白胨0. 3 %，酵母浸膏0. 3 %，葡萄糖 2%，瓊脂粉1.6%。PDA加富液體培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯20%，蛋白胨0.3%，酵母浸膏 0. 3 %，葡萄糖2 %;發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：玉米淀粉20 %，豆柏粉1. 6 %，玉米漿干粉0. 6 %，

【權利要求】
1. 一種腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，其特征包括以下步驟： (1) 腸桿菌Z0206耐硒菌株馴化： 挑取腸桿菌Z0206耐硒菌株，先后涂布于含硒量分別為10、20、30、40以及50μ g/mL的 PDA加富培養(yǎng)基上，進行硒濃度梯度馴化；每個梯度于28-32°C培養(yǎng)24-36h ;最后從含硒量 50 μ g/mL的PDA加富培養(yǎng)基平板上挑取生長良好的菌落于平板上劃線分離，純化后斜面保 存； (2) 腸桿菌Z0206富硒研究： 通過測定細菌的生長曲線，確定最佳加硒時間和培養(yǎng)時間；從斜面上挑取馴化好的菌 種，PDA培養(yǎng)基平板活化培養(yǎng)24-36h后，接種于裝有PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中；28-32°C 振蕩培養(yǎng)，每隔lh無菌操作取出lmL培養(yǎng)液，用分光光度計測定580nm下的吸光值；繪制耐 硒菌的生長曲線；通過生長曲線確定加硒時間及培養(yǎng)時間； 從斜面上挑取已經馴化好的耐硒菌種，接種于含硒量分別為10、15、20、25、30以及 35 μ g/mL的PDA加富培養(yǎng)基上，28-32 °C培養(yǎng)24-48h，選取培養(yǎng)基上菌體顏色略紅、生長良 好的硒濃度作為最佳硒濃度； (3) 發(fā)酵液獲取： 將耐硒馴化后的腸桿菌Z0206菌種，接種至PDA加富液體培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵， 28-321：往復振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間18-1911，得到發(fā)酵罐發(fā)酵種子液；發(fā)酵罐內加入70%發(fā)酵 培養(yǎng)基，121°C蒸汽滅菌20min后，接種種子液，培養(yǎng)13h時加入無菌亞硒酸鈉溶液，使培養(yǎng) 基最終含硒量為25 μ g/mL，發(fā)酵時間48-72h，得到含有腸桿菌Z0206富硒多糖的發(fā)酵液； (4) 多糖粉末獲?。? 將步驟（3)所得的發(fā)酵液于60-70 °C濃縮為原體積的1/10, 80-90 °C水浴1-1. 5h， 5000rpm離心10_15min，收集上清液，加入3-5倍體積的預冷95%乙醇，靜置12h，5000rpm 離心10-15min，沉淀依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌2-3次，離心，沉淀真空干燥，得 到富硒粗多糖粉末； (5) 蛋白酶處理： 將步驟（4)所得的富硒粗多糖粉末溶解于20倍體積的熱蒸餾水中，用Na2COjMpH至 7. 0-9. 0,加入質量為多糖質量1/40-1/20的胰蛋白酶，55°C水解l_2h后，用草酸調pH值至 5. 0-5. 7,加質量為多糖質量1/40-1/20的木瓜蛋白酶，65-70°C水解2-3h后，于100°C水浴 加熱5-6min，以終止酶反應； (6) 三氯乙酸法脫蛋白： 取步驟（5)所得的蛋白酶處理液，用草酸調pH值至7. 0,加入3%的三氯乙酸，室溫下 磁力攪拌lh后，llOOOrpm離心10-15min，取上清； (7) Sevag法脫蛋白： 向步驟（6)所得的上清液中加入1/3體積的Sevag試劑，充分振蕩，混合20-30min，充 分靜置分層，4000rpm離心5min，重復操作數(shù)次至兩相界面不再出現(xiàn)蛋白沉淀；然后用3-5 倍體積預冷的95%乙醇醇析，所得的沉淀再依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌后，沉淀 真空干燥，得到脫蛋白富硒多糖； (8) 脫色： 將步驟（7)所得到的脫蛋白富硒多糖配成0.5%的多糖溶液，用氨水調pH至8.0,在 50°C下滴加20%的H202，至溶液為淡黃色，保溫2h，然后用稀鹽酸中和至7. Ο ;自來水透析 2-3d，蒸餾水透析2-3d后，加入3-5倍體積的預冷95 %乙醇沉淀，4°C靜置12h后，500rpm 離心10?15min，沉淀真空干燥，得富硒多糖精品。
2. 根據(jù)權利要求1所述的腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，其特征在于：所述步驟 (1) 、（2)、（3)中，PDA加富固體培養(yǎng)基的配方如下：馬鈴薯20%，蛋白胨0. 2-0. 5%，酵母浸 膏0. 3%，葡萄糖2%，瓊脂粉1. 6% ;PDA加富液體培養(yǎng)基的配方如下：馬鈴薯20%，蛋白胨 0. 2-0. 5 %，酵母浸膏0. 3 %，葡萄糖2 %;發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米淀粉20 %，豆柏粉1. 6 %， 玉米漿干粉
3. 根據(jù)權利要求2所述的腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，其特征在于，所述步驟 (2) 中，搖瓶發(fā)酵條件為：接種量3-5環(huán)，往復振蕩的沖程4-10cm，振蕩頻率200-250rpm。
4. 根據(jù)權利要求2或3所述的腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，其特征在于，所述步 驟⑶中，發(fā)酵罐發(fā)酵條件為：接種量4%，pH值7.5,溫度32°C，通氣量0.25-0. 75vvm，機 械攪拌轉速200-300rpm。
5. 根據(jù)權利要求4所述的腸桿菌Z0206富硒多糖的制備方法，其特征在于：所述步驟 (7)中的Sevag試劑由氯仿和正丁醇組成；所述氯仿和正丁醇的體積比為4 :1。
6. -種腸桿菌Z0206富硒多糖在制備增強機體抗氧化功能和免疫調節(jié)功能的保健品 或添加劑中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK104087630SQ201410319712
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月6日 優(yōu)先權日:2014年7月6日
【發(fā)明者】汪以真, 徐春蘭, 靳明亮, 姚國佳 申請人:浙江大學