一種紅色諾卡氏菌新的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紅色諾卡氏菌新的培養(yǎng)方法，該方法為在5升以上機械攪拌式發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)紅色諾卡氏菌細胞壁骨架生產(chǎn)菌紅色諾卡氏菌。該方法所用培養(yǎng)基的配方為葡萄糖1％、酵母粉1％、pH7.0-7.2；在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的條件為：攪拌轉(zhuǎn)速250-350r/min、通氣量1∶0.83-1.1、接種量7.0-11.0％、裝液量為罐容積的60％、溫度28-30℃。本發(fā)明相對于現(xiàn)有搖瓶培養(yǎng)技術(shù)，紅色諾卡氏菌生長速度快、培養(yǎng)周期縮短；菌體產(chǎn)品更加均勻；菌體收率更高、培養(yǎng)規(guī)模更易于擴大，有助于提高紅色諾卡氏菌細胞壁骨架相關(guān)藥物的生產(chǎn)效率、實現(xiàn)擴大生產(chǎn)規(guī)模。
【專利說明】一種紅色諾卡氏菌新的培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及紅色諾卡氏菌細胞壁骨架生產(chǎn)菌紅色諾卡氏 菌新的培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 1984年福建省微生物研究所在昆明的土壤中篩選到一株紅色諾卡氏菌P0_8(菌 種保藏編號：CGMCC NO :0187)，由該菌提取獲得的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架制成的凍干粉 針劑已獲準上市，作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，廣泛用于控制各種腫瘤所引起的胸水和腹水，并且 能很好的輔助如膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、非小細胞肺癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤的治療（《中 國生物制品規(guī)程》2000年版）。
[0003] 現(xiàn)有獲準的生產(chǎn)工藝"紅色諾卡氏菌細胞壁骨架制劑制造及檢定規(guī)程"以及相 關(guān)專利（專利號CN93104969. 5\名稱為"利用紅色諾卡氏菌制造細胞壁骨架粉末的方 法"）表明一種利用相同保藏編號的紅色諾卡氏菌菌種，"振蕩通氣培養(yǎng)"以及"經(jīng)培養(yǎng) 基進行菌體培養(yǎng)與制備、菌體破壁、蛋白酶處理、溶媒提出、真空干燥處理制造骨架粉末 的方法，"其中，培養(yǎng)特征為"旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或采用振動培養(yǎng)"方式，這些描述均指搖瓶培養(yǎng)方 式。專利號201210466904. 4、名稱紅色諾卡氏菌細胞壁骨架口含片及其制備方法，僅涉 及制劑的制備方法；其他專利均僅涉及紅色諾卡氏菌細胞壁骨架的相關(guān)藥物用途方面， 如：申請?zhí)朇N200510077407. 5 :紅色諾卡氏菌細胞壁骨架在制備抗真菌感染的藥物中的 用途；以及 CN200510127603. 9、CN200610082627. 1\CN200610156653. 4\CN02132415. 8\ CN200510105533. 7\201310101232. 1〇
[0004] 目前尚未見有關(guān)紅色諾卡氏菌其他培養(yǎng)方法的文獻報道。獲準生產(chǎn)的現(xiàn)有培養(yǎng)工 藝是采用玻璃搖瓶恒溫振蕩培養(yǎng)（《中國生物制品規(guī)程》2000年版的"紅色諾卡氏菌細胞 壁骨架制劑制造及檢定規(guī)程"），該方式批培養(yǎng)裝液量有限、不易于用于自動化工業(yè)化生產(chǎn)， 使得生產(chǎn)規(guī)模受到制約；同時，規(guī)?；囵B(yǎng)具有培養(yǎng)過程的溫度、酸堿度、溶解氧（通氣）等 參數(shù)不易精確自動控制，瓶間差異大，造成菌體產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定；而且，溶氧效果相對較差， 菌體生長速度慢，培養(yǎng)周期長，收率較低等缺點。
[0005] 采用機械攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物，是目前成熟的培養(yǎng)方式，它具有培養(yǎng)液均勻、 溶氧好、裝液量大、易于調(diào)節(jié)控制及放大等優(yōu)點，使之規(guī)?；纳a(chǎn)周期短、產(chǎn)品均勻穩(wěn)定。 但是不同的微生物、不同的培養(yǎng)目的，發(fā)酵罐培養(yǎng)控制參數(shù)，如：培養(yǎng)基配方、裝料量、接種 量、溫度、攪拌速度、通氣量等，均有不同的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有搖瓶培養(yǎng)技術(shù)的缺點與不足，提供一種紅色諾卡氏菌 新的培養(yǎng)方法，該方法為在5升以上機械攪拌式發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)，用于注射用紅色諾卡 氏菌細胞壁骨架的制備。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] -種紅色諾卡氏菌新的培養(yǎng)方法，為在5升以上機械攪拌式發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)， 包括如下步驟：將紅色諾卡氏菌種子液接種到裝有培養(yǎng)基的容積5升以上機械攪拌式發(fā) 酵罐中培養(yǎng)。其中，所述的培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖1%、酵母粉1%、PH7. 0-7. 2 ;在發(fā)酵 罐中培養(yǎng)的條件優(yōu)選為：攪拌轉(zhuǎn)速250-350r/min、通氣量1 : 0.83-1. 1(發(fā)酵液體積與 每分鐘通氣量的體積比）、接種量7. 0-11. 0%、裝液量為罐容積的60%、溫度28-30°C ;更 優(yōu)選的，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)條件為：攪拌轉(zhuǎn)速289-3071'/1^11、通氣量1:0.97-1.03、接種量 8. 6-9. 2%。
[0009] 所述的紅色諾卡氏菌優(yōu)選為紅色諾卡氏菌P0-8,保藏編號為CGMCC N0 :0187。
[0010] 所述的種子液優(yōu)選通過包含如下步驟的方法培養(yǎng)得到：將紅色諾卡氏菌P0-8接 種到培養(yǎng)基中，在28°C、220r/min的搖床下培養(yǎng)36-38h ;該培養(yǎng)基的配方也為：葡萄糖 1%、酵母粉 1%，ρΗ7· 0-7. 2。 toon] 本發(fā)明的有益效果在于：提供一種生產(chǎn)紅色諾卡氏菌細胞壁骨架的紅色諾卡氏菌 培養(yǎng)方法，相對于現(xiàn)有搖瓶培養(yǎng)技術(shù)，機械攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)使得菌體生長速度快、培養(yǎng)周 期縮短；菌體產(chǎn)品更加均勻；菌體收率更高、培養(yǎng)規(guī)模更易于擴大等，更有助于提高相關(guān)藥 物的生產(chǎn)效率、實現(xiàn)擴大生產(chǎn)規(guī)模。

【具體實施方式】
[0012] 以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別 指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0013] 實施例中所用的紅色諾卡氏菌為紅色諾卡氏菌Ρ0-8菌株，其保藏編號為CGMCC Ν0:0187。紅色諾卡氏菌Ρ0-8菌株種子液的培養(yǎng)方法為：將紅色諾卡氏菌Ρ0-8接種到培養(yǎng) 基（葡萄糖1%、酵母粉1%、ρΗ7·0-7·2)中，在28°C、220r/min的搖床下培養(yǎng)36-38h。下 述實施例搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)所用培養(yǎng)基與培養(yǎng)種子液的培養(yǎng)基相同。
[0014] 實施例1紅色諾卡氏菌在5L搖瓶中的擴大培養(yǎng)
[0015] 取種齡為38小時的種子液100mL接種到裝有1L培養(yǎng)基的5L搖瓶中，28-30°C、往 復(fù)式搖床轉(zhuǎn)速80r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)5d，獲得紅色諾卡氏菌的最大菌體量為24. 24g/L。
[0016] 實施例2紅色諾卡氏菌5L發(fā)酵罐培養(yǎng)接種量實驗
[0017] 采用培養(yǎng)基配方：葡萄糖1%、酵母粉1%、ρΗ7. 2 ;裝量3. 0L，攪拌轉(zhuǎn)速289r/min， 通氣量1 : l(v/V/min，表示實際發(fā)酵液與每一分鐘通入空氣量體積比。），28-30°C恒溫發(fā) 酵罐培養(yǎng)的工藝，先后以3%、5%、7%、9%和11%的接種量接種種齡為38小時的種子液， 分別進行發(fā)酵實驗，接種后從〇h開始至60h，間隔4h取樣，稀釋20倍，測定0D600制得生長 曲線（圖1)。從生長曲線可知，接種量7 %與9 %，發(fā)酵生物量增長相對穩(wěn)定，生物量水平較 高，是適宜的接種量參數(shù)。
[0018] 實施例3紅色諾卡氏菌5L發(fā)酵罐培養(yǎng)通氣量實驗
[0019] 采用培養(yǎng)基配方：葡萄糖1%、酵母粉1%、pH7. 2 ;裝量3.0L，攪拌轉(zhuǎn)速289r/ min，接種量9% (種子液種齡為38小時），28-30°C恒溫發(fā)酵罐培養(yǎng)的工藝，先后以2. 5L/ min(l : 0.83)、3.0L/min(l : 1)和 3.5L/min(l : 1.17)的通氣量，分別進行發(fā)酵實驗。 接種后從Oh開始至60h，間隔4h取樣，稀釋20倍，測定0D600制得生長曲線（圖2)。由生 長曲線可以看出通氣量3L/min(l : 1)的發(fā)酵最大生物量較高。因此，該通氣量參數(shù)較為 適宜。
[0020] 實施例4紅色諾卡氏菌5L發(fā)酵罐培養(yǎng)攪拌轉(zhuǎn)速實驗
[0021] 采用培養(yǎng)基配方：葡萄糖1%、酵母粉1%、ρΗ7. 2;裝量3. 0L，通氣量1 : 1，接種 量9% (種子液種齡為38小時），28-30°C恒溫發(fā)酵罐培養(yǎng)的工藝，先后以100r/min、200r/ min、300r/min和400r/min的攪拌轉(zhuǎn)速，分別進行發(fā)酵實驗，接種后從Oh開始至60h，間隔 4h取樣，稀釋20倍，測定0D600制得生長曲線（圖3)。
[0022] 實施例5紅色諾卡氏菌5L發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝優(yōu)化實驗
[0023] 在發(fā)酵培養(yǎng)基配方（葡萄糖1 %、酵母粉1%、pH7. 0-7. 2)、發(fā)酵罐裝量相對固定 (裝液量為60%)的條件下，以上述實施例的單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面法（RSM) 和基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的遺傳算法（ANN-GA)，對紅色諾卡氏菌在機械攪拌式發(fā)酵罐中的主要 發(fā)酵條件（攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、接種量）進行優(yōu)化，最終研制最優(yōu)的發(fā)酵工藝。
[0024] (1)響應(yīng)面法優(yōu)化實驗
[0025] 響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)理統(tǒng)計方法，本實驗采用響 應(yīng)面分析法中的Box-Bohnken(BBD)，以菌體生物量為響應(yīng)值，對轉(zhuǎn)速、通氣量和接種量3因 素與菌體生物量之間的對應(yīng)關(guān)系進行擬合（表1)。其他發(fā)酵條件一致，進行了 15次發(fā)酵實 驗（表2)，應(yīng)用軟件SAS9. 2對實驗數(shù)據(jù)進行分析。
[0026] 表1響應(yīng)面分析因素和水平
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種紅色諾卡氏菌新的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟：將紅色諾卡氏菌種子 液接種到裝有培養(yǎng)基的容積5升以上機械攪拌式發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)； 所述的培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖1 %、酵母粉1 %，PH7. 0-7. 2 ; 在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的條件為：攪拌轉(zhuǎn)速250-350r/min、通氣量1 : 0.83-1. 1、接種量 7. 0-1L 0%、裝液量 60%、溫度 28-30°C。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅色諾卡氏菌新的培養(yǎng)方法，其特征在于：在發(fā)酵罐中培養(yǎng) 的條件為：攪拌轉(zhuǎn)速289-307r/min、通氣量1 : 0. 97-1. 03、接種量8. 6-9. 2%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅色諾卡氏菌新的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的紅色諾卡 氏菌為紅色諾卡氏菌PO-8,保藏編號為CGMCC NO :0187。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅色諾卡氏菌新的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的種子液通 過包含如下步驟的方法培養(yǎng)得到：將紅色諾卡氏菌P0-8接種到培養(yǎng)基中，在28°C、220r/ min的搖床下培養(yǎng)36-38h。
【文檔編號】C12N1/20GK104099271SQ201410320363
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】謝必峰 申請人:謝必峰