一種多通道陣列式dna測序系統(tǒng)及其測序方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測DNA脫氧核糖核苷酸堿基序列的納米孔DNA測序傳感器。該傳感器包含電流檢測單元，二硫化鉬場效應(yīng)管，原子力顯微鏡進(jìn)給系統(tǒng)和陣列單元。將DNA通過化學(xué)修飾的方法鍵合在原子力顯微鏡探針上，通過原子力顯微鏡的進(jìn)給控制系統(tǒng)，可以使得驅(qū)動DNA進(jìn)出納米孔的速度控制在一納米每秒，這一速度完全滿足DNA測序電流信號檢測的帶寬需求。在DNA過孔的過程中，因為納米孔處于二硫化鉬納米帶上，而二硫化鉬納米帶在電流信號的檢測過程中扮演著場效應(yīng)管的角色，可以對DNA過孔的信號進(jìn)行實時的放大，有效的提高信噪比。此外通過將原子力顯微鏡探針對應(yīng)二硫化鉬場效應(yīng)管陣列化的方法可以同時并行的對待測DNA進(jìn)行多通道并行實時測序，大大縮短了時間成本。
【專利說明】一種多通道陣列式DNA測序系統(tǒng)及其測序方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到一種納米孔DNA測序系統(tǒng)及其方法，尤其涉及一種集成原子力顯微 鏡和二硫化鑰場效應(yīng)管的多通道陣列式DNA測序系統(tǒng)及其測序方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 納米孔單分子傳感器因其低成本高通量的特點，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于單分子的 檢測。納米孔單分子傳感器的基本工作原理基于庫特計數(shù)器，當(dāng)帶電單分子在外加電壓條 件下電泳穿過納米孔的時候，因為單分子自身在孔內(nèi)的物理占位作用以及其與納米孔壁之 間的強(qiáng)相互作用使得過孔的離子電流被調(diào)制，通過檢測調(diào)制離子電流的幅值和阻塞時間就 可以對單分子的種類及過孔姿態(tài)等進(jìn)行有效檢測。2004年，美國國家衛(wèi)生研究院提出了 " 1000美元"的基因測序項目，旨在降低基因測序的貨幣和時間成本。納米孔DNA測序技術(shù) 因其簡單低成本高通量的特點無疑是最有可能實現(xiàn)這一目標(biāo)的技術(shù)之一。只要納米孔的直 徑小于2納米，薄膜厚度與堿基間的間隙相當(dāng)，DNA鏈在過孔的過程中便會始終保持單堿 基在孔內(nèi)占位，不同的堿基會產(chǎn)生對應(yīng)的離子電流信號，從而實現(xiàn)單堿基辨識的目標(biāo)。然而 研究者們在不斷推進(jìn)這一技術(shù)的時候仍然面臨著兩個亟待解決的問題。首先，DNA的過孔 速度太快，一般為數(shù)微秒每個堿基，而膜片鉗的采樣頻率有限，目前主流的最高采樣頻率為 200 kHz，這將導(dǎo)致單堿基辨識過程中信號嚴(yán)重缺失，因此降低DNA的過孔速度十分必要； 其次，DNA過孔信號的信噪比有限，提高信噪比將使得DNA過孔信號的分析更加精確。在納 米孔DNA測序技術(shù)發(fā)展的過程中，研究者們采取了一系列的措施來降低DNA的過孔速度。 降低驅(qū)動電壓，降低體系溫度，增加溶液的粘度，將無機(jī)鹽溶液置換成有機(jī)鹽溶液，都能適 量降低DNA的過孔速度，然而距離降低到DNA測序所需的速度還很遠(yuǎn)；聚合酶對DNA聚合的 速度約為數(shù)十毫秒每堿基，因此采用聚合酶驅(qū)動DNA可以達(dá)到DNA測序的要求，然而聚合酶 驅(qū)動DNA操作復(fù)雜，而且對環(huán)境要求苛刻，這違背了第三代DNA無需修飾，簡單，低成本的初 衷；機(jī)械操縱的方法因其能控制DNA過孔的運動方向和過孔速度而成為有效操控DNA過孔 的方法之一，光鑷和磁鑷等DNA操控方法都已經(jīng)被研究者們提出，然而因光鑷磁鑷等操縱 復(fù)雜而且技術(shù)尚不成熟，應(yīng)用于DNA過孔的主動控制還需要很長的時間。因此具有創(chuàng)新意 義和便利性的新型DNA操縱方法亟待被提出。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] (一）要解決的技術(shù)問題 本發(fā)明主要解決的是納米孔DNA測序過程中面臨的主要挑戰(zhàn)：（1)降低DNA的過孔速 度并對DNA過孔實現(xiàn)主動控制；（2)提高DNA過孔過程中信號檢測的信噪比；（3)實現(xiàn)操控 DNA的并行測序，大大縮短DNA測序的時間。
[0004] (二）技術(shù)方案 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是： 一種集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應(yīng)管的多通道陣列式DNA測序技術(shù)，其特征 是：包括電流檢測單元，二硫化鑰場效應(yīng)管，原子力顯微鏡進(jìn)給系統(tǒng)和陣列單元。所述的電 流檢測單元主要為膜片鉗放大器系統(tǒng)，主要用于檢測二硫化鑰場效應(yīng)管源漏極間的電流； 所述的二硫化鑰場效應(yīng)管包括源極電源（匕)，漏極電源（匕)，氮化硅基底，帶有納米孔的二 硫化鑰納米帶和絕緣層；所述的原子力顯微鏡進(jìn)給系統(tǒng)主要是控制DNA的運動方向和過孔 速度；所述的陣列單元是將上述提到的電流檢測單元，二硫化鑰場效應(yīng)管及原子力顯微鏡 進(jìn)給系統(tǒng)進(jìn)行集成后陣列展開，實現(xiàn)并行操控。
[0005] -種集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應(yīng)管的多通道陣列式DNA測序技術(shù)，針對 擬解決的三個技術(shù)問題提出了解決方案： (1)本發(fā)明針對"降低DNA的過孔速度并對DNA過孔實現(xiàn)主動控制"提出的解決方案： 本發(fā)明是集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應(yīng)管的多通道陣列式DNA測序技術(shù)，針對 "降低DNA的過孔速度并對DNA過孔實現(xiàn)主動控制"，提出了采用原子力顯微鏡進(jìn)給系統(tǒng)對 DNA進(jìn)行運動方向和過孔速度的主動控制。原子力顯微鏡的進(jìn)給系統(tǒng)為壓電陶瓷進(jìn)給，系 統(tǒng)通過設(shè)置施加在壓電陶瓷上面的電壓從而轉(zhuǎn)化為基底的位移，通過其成熟的反饋系統(tǒng)可 以將基底的進(jìn)給速度控制在1納米每秒，此外原子力顯微鏡進(jìn)給的方向也能實時的調(diào)節(jié)切 換，因此可以對DNA過孔實現(xiàn)主動控制。
[0006] DNA與原子力顯微鏡探針之間的鍵合可以通過化學(xué)修飾的方法實現(xiàn)，首先在原子 力顯微鏡探針的針尖上鍍上一層Cr薄膜涂層（5納米厚)，然后再在涂層上面鍍上一層Au薄 膜（50納米厚)。通過化學(xué)方法在單鏈DNA的5'端或3'端修飾上巰基（-HS)，因為巰基與 金之間有強(qiáng)的共價吸附作用，進(jìn)行簡單的化學(xué)處理后就可以將單鏈DNA通過巰基與鍍金的 原子力顯微鏡探針進(jìn)行有效結(jié)合。
[0007] (2)本發(fā)明針對"提高DNA過孔過程中信號檢測的信噪比"提出的解決方案： 本發(fā)明是集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應(yīng)管的多通道陣列式DNA測序技術(shù)，針 對"提高DNA過孔過程中信號檢測的信噪比"，提出了采用二硫化鑰場效應(yīng)管對DNA過孔的 信號進(jìn)行放大，從而大大提高DNA檢測的信噪比。由于單層二硫化鑰的禁帶寬度可以達(dá)到 1. 8eV，因此，它是一個理想場效應(yīng)管材料，其次，單層二硫化鑰的厚度在0. 65nm左右，這樣 的薄膜厚度很適用于納米孔DNA測序。二硫化鑰場效應(yīng)管的制備過程如下，首先將單層二 硫化鑰納米帶轉(zhuǎn)移到氮化娃基底上，通過MEMS工藝將二硫化鑰納米帶的兩側(cè)與Au (或Pt) 電極相連，覆蓋上絕緣層進(jìn)行保護(hù)后在兩側(cè)的電極上分別施加源極和漏極電壓，并在源極 處連接電流檢測裝置，用于實時檢測源漏極之間電流信號的變化。然后在二硫化鑰納米帶 的中間位置用高能透射電子顯微鏡（TEM)將二硫化鑰連同保護(hù)層及基底氮化硅打穿，加工 出2納米左右的納米孔。二硫化鑰場效應(yīng)管的基本工作原理如下，當(dāng)單鏈DNA穿過二硫化 鑰納米孔的時候，納米孔處的電勢會因為DNA的物理占位作用以及其與二硫化鑰的強(qiáng)相互 作用而發(fā)生改變，相當(dāng)于二硫化鑰場效應(yīng)管的柵極電壓（匕）發(fā)生改變，從而導(dǎo)致由二硫化 鑰納米帶相連的源極和漏極之間的電導(dǎo)發(fā)生變化，相比檢測傳統(tǒng)離子電流而言，通過檢測 此時源漏極間的電流變化信噪比將得到大幅度提高。
[0008] (3)本發(fā)明針對"實現(xiàn)操控DNA的并行測序"提出的解決方案： 通過將（1)中針對"降低DNA的過孔速度并對DNA過孔實現(xiàn)主動控制"提出的解決方案 和（2)中針對"提高DNA過孔過程中信號檢測的信噪比"提出的解決方案進(jìn)行陣列化，即可 以實現(xiàn)DNA操控的并行測序，可以大大縮短DNA測序所需的時間。圖1中給出了陣列化方 案的示意圖，原子力顯微鏡探針的陣列化是通過在原子力顯微鏡探針基底上采用MEMS工 藝制備得到，二硫化鑰納米帶陣列化可以通過將二硫化鑰納米帶轉(zhuǎn)移到氮化硅基底上按照 所需陣列化圖形排好，這里所需要保證的是原子力顯微鏡探針陣列化后必須與陣列化的二 硫化鑰納米帶上納米孔位置相對應(yīng)。
[0009] 上述三個解決方案中，首先采用化學(xué)修飾的方法在原子力顯微鏡探針上鍵合待測 單鏈DNA (具體鍵合方法參照下文的【具體實施方式】)，然后通過控制原子力顯微鏡的進(jìn)給系 統(tǒng)來操縱DNA的過孔遷移速度和方向，以滿足基本的信號檢測帶寬需求。此外提出了采用 二硫化鑰場效應(yīng)管測序的思路，對DNA過孔信號進(jìn)行有效放大，提高信噪比。最后將電流檢 測單元，原子力顯微鏡進(jìn)給系統(tǒng)和二硫化鑰場效應(yīng)管進(jìn)行陣列化，實現(xiàn)并行化高通量的DNA 測序，降低了時間成本。
[0010] (三）有益效果 將原子力顯微鏡進(jìn)給系統(tǒng)應(yīng)用于納米孔DNA測序傳感器上，通過在原子力顯微鏡探針 上鍵合待測單鏈DNA，然后對DNA進(jìn)行主動控制，可以操控DNA過孔的方向和速度，速度可以 控制在1納米每秒，完全滿足膜片鉗放大器系統(tǒng)電流檢測的帶寬需求，從而可以對信號進(jìn) 行全面分析。二硫化鑰場效應(yīng)管被引入后，因 DNA過孔時單層二硫化鑰納米孔周圍的電勢 變化（即柵極電勢變化)，直接將導(dǎo)致二硫化鑰納米帶的源漏極電流變化，通過檢測源漏極 間的電流相比傳統(tǒng)電流而言信噪比大幅度提高。而將電流檢測單元，原子力顯微鏡的進(jìn)給 系統(tǒng)和二硫化鑰場效應(yīng)管進(jìn)行陣列后，可以同時進(jìn)行并行的DNA測序，大幅度降低了測序 的時間成本。
[0011] 基于上述基本原理，本發(fā)明提供的這種集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應(yīng)管的 多通道陣列式DNA測序技術(shù)可以實現(xiàn)對DNA過孔速度和方向的有效控制，而且可以對DNA 過孔的信號進(jìn)行放大，提高了信噪比和納米孔DNA測序傳感器的檢測靈敏度，此外陣列化 后還能并行測序，大大縮短了時間成本，這將對實現(xiàn)DNA堿基精確辨識和降低成本產(chǎn)生重 大意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0013] 圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中只給出了三個一維的陣列是為了能將本發(fā)明的 思路表述清楚，本發(fā)明所提出的陣列方式不僅僅局限于此，而是適用于其他可行的所有陣 列方式。
[0014] 圖中：1·原子力顯微鏡探針基底，2.原子力顯微鏡探針，3.電流表，4.源極電源 (匕)，5.單鏈DNA，6.氮化硅基底，7.帶有納米孔的單層二硫化鑰納米帶，8.絕緣層，9.漏 極電源（匕)，。

【具體實施方式】
[0015] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參考 附圖，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0016] 如圖1所示，本發(fā)明提供的這種集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應(yīng)管的多通道 陣列式DNA測序技術(shù)由電流檢測單元，二硫化鑰場效應(yīng)管，原子力顯微鏡進(jìn)給系統(tǒng)和陣列 單元組成。其中電流檢測單元由電流表（3)構(gòu)成；二硫化鑰場效應(yīng)管由源極電源（匕）（4)， 漏極電源（匕）（9)，氮化硅基底（6)，帶有納米孔的單層二硫化鑰納米帶（7)和絕緣層（8)組 成。原子力顯微鏡進(jìn)給系統(tǒng)由原子力顯微鏡探針基底（1)和原子力顯微鏡探針（2)組成。 本發(fā)明提供的這種集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應(yīng)管的多通道陣列式DNA測序技術(shù) 的具體方案布局參見圖1所示。
[0017] 本發(fā)明的實施過程如下： A、 按照圖1的布局在氮化硅基底（6)上陣列式鋪展單層二硫化鑰納米帶（7)，將納米帶 的兩側(cè)分別采用MEMS工藝壓焊上Au (或Pt電極）并引出連接極源極電源（匕）（4)和漏極 電源（匕）（9)形成各自的獨立檢測單元，然后覆蓋上絕緣層（8)對二硫化鑰納米帶進(jìn)行保 護(hù)，避免直接跟溶液接觸； B、 采用高能透射電子顯微鏡（TEM)將單層二硫化鑰納米帶（7)連同氮化硅基底（6)和 絕緣層（8)打穿，加工出2納米的孔； C、 采用MEMS工藝在原子力顯微鏡探針基底（1)上制備出陣列式的原子力顯微鏡探針 (2)，此處要強(qiáng)調(diào)的是陣列式的二硫化鑰場效應(yīng)管必須與陣列式的原子力顯微鏡探針位置 --對應(yīng)； D、 在陣列式的原子力顯微鏡探針上鍵合待測單鏈DNA分子，具體可參照下述方法執(zhí) 行； (1) 采用磁控濺射在陣列式的原子力顯微鏡探針表面鍍上一層Cr薄膜涂層（5納米 厚)，然后再在涂層上面鍍上一層Au薄膜（50納米厚）； (2) 配制所要修飾的DNA (事先將DNA修飾上巰基"-HS"官能團(tuán))溶液1 μΜ (PH 8. 0); (3) 將鍍有Au薄膜的陣列式原子力顯微鏡探針浸泡到步驟（2)中所配制的DNA溶液 0.2 mL中，靜置24小時； (4) 在步驟（3)的溶液中加入0.02 mL的1 M NaCl (PH 8.0)溶液三次，每次加入的時 間間隔為2小時； (5) 用去離子水洗去吸附不牢的DNA三次，空氣中晾干后備用。
[0018] (6)通過操控原子力顯微鏡的進(jìn)給系統(tǒng)來控制陣列式的探針牽引DNA沿著二硫化 鑰納米孔軸線方向低速移動，并同時開始檢測DNA移動過程中各個二硫化鑰場效應(yīng)管源漏 極間的電流信號； (7) 重復(fù)步驟（6)大于一次； (8) 完成上述步驟后，通過整合比對分析所得的并行檢測數(shù)據(jù)，尋找堿基與信號之間的 對應(yīng)規(guī)律，完成測序。
[0019] 以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳 細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡 在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種多通道陣列式DNA測序系統(tǒng)，包括電流檢測單元，二硫化鑰場效應(yīng)管，原子力顯 微鏡進(jìn)給系統(tǒng)和陣列單元； 其中所述二硫化鑰場效應(yīng)管包括源極電源（匕）（4)、漏極電源（匕）（9)、氮化硅基底 (6)、帶有納米孔的單層二硫化鑰納米帶（7)和絕緣層（8); 所述原子力顯微鏡進(jìn)給系統(tǒng)包括原子力顯微鏡探針基底（1)和原子力顯微鏡探針 (2)； 其特征在于： 將帶有納米孔的單層二硫化鑰納米帶的兩側(cè)分別連接金屬電極作為場效應(yīng)管的源極 和漏極，納米孔作為柵極，其電流信號檢測原理類似于場效應(yīng)晶體管。
2. 如權(quán)利要求1所述多通道陣列式DNA測序系統(tǒng)，其特征在于將單層二硫化鑰場效應(yīng) 管陣列式鋪展在基底上。
3. 如權(quán)利要求1所述多通道陣列式DNA測序系統(tǒng)，其特征在于：將納米尺度下二硫化 鑰場效應(yīng)管應(yīng)用于DNA過孔時電流變化的實時檢測。
4. 如權(quán)利要求1所述多通道陣列式DNA測序系統(tǒng)，其特征在于：通過MEMS工藝在原子 力顯微鏡探針基座上制備出陣列式的探針，并且探針之間的相對位置對應(yīng)陣列式二硫化鑰 場效應(yīng)管中的納米孔位置。
5. 如權(quán)利要求1所述多通道陣列式DNA測序系統(tǒng)，所述電流檢測單元是電流表（3)。
6. -種基于權(quán)利要求1-5所述多通道陣列式DNA測序系統(tǒng)的測序方法，包括以下步 驟： A、 在氮化硅基底（6)上陣列式鋪展單層二硫化鑰納米帶（7)，將所述納米帶的兩側(cè)分 別采用MEMS工藝壓焊上Au或Pt電極，并引出連接源極電源（匕）（4)和漏極電源（匕）（9) 形成各自的獨立電流檢測單元，然后覆蓋上絕緣層（8 )對二硫化鑰納米帶進(jìn)行保護(hù)，避免直 接跟溶液接觸； B、 采用高能透射電子顯微鏡（TEM)將單層二硫化鑰納米帶（7)連同氮化硅基底（6)和 絕緣層（8)打穿，加工出2納米的孔； C、 采用MEMS工藝在原子力顯微鏡探針基底（1)上制備出陣列式的原子力顯微鏡探針 (2)，所述陣列式的二硫化鑰場效應(yīng)管必須與陣列式的原子力顯微鏡探針位置一一對應(yīng)； D、 在陣列式的原子力顯微鏡探針上鍵合待測單鏈DNA分子； E、 通過操控原子力顯微鏡的進(jìn)給系統(tǒng)來控制陣列式的探針牽引DNA沿著二硫化鑰納 米孔軸線方向低速移動，并同時開始檢測DNA移動過程中各個二硫化鑰場效應(yīng)管源漏極間 的電流信號； F、 重復(fù)步驟E大于一次； G、 完成上述步驟后，通過整合比對分析所得的并行檢測數(shù)據(jù)，尋找堿基與信號之間的 對應(yīng)規(guī)律，完成測序。
7. 如權(quán)利要求6所述多通道陣列式DNA測序系統(tǒng)的測序方法，其中在陣列式的原子力 顯微鏡探針上鍵合待測單鏈DNA分子，具體包括： (1) 采用磁控濺射在陣列式的原子力顯微鏡探針表面鍍上一層Cr薄膜涂層，然后再在 涂層上面鍍上一層Au薄膜； (2) 配制所要修飾的HS-DNA溶液； (3) 將鍍有Au薄膜的陣列式原子力顯微鏡探針浸泡到步驟（2)中所配制的DNA溶液 中，靜置大于或等于24小時； (4) 在步驟（3)的溶液中加入0. 02 mL的1 M NaCl溶液三次，每次加入的時間間隔為 2小時； (5) 用去離子水洗去吸附不牢的DNA三次，空氣中晾干后備用。
【文檔編號】C12M1/34GK104087505SQ201410320550
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】陳云飛, 司偉, 伍根生, 章寅, 沙菁潔, 劉磊 申請人:東南大學(xué)