Npr3基因在制備診斷試劑盒中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了NPR3基因在制備診斷骨肉瘤的試劑盒中的用途。本發(fā)明利用NCBI?GEO數(shù)據(jù)檢索將符合要求的8套骨肉瘤病例和正常人群基因組mRNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)納入研究范圍，通過對上述芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析，篩選出NPR3基因是差異顯著基因，相比正常組織，NPR3基因在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào)，并使用熒光實(shí)時定量PCR方法驗(yàn)證了上述結(jié)論。據(jù)此，本發(fā)明還公開了一種診斷骨肉瘤的試劑盒以及利用該試劑盒診斷骨肉瘤的方法。本發(fā)明一方面為研究骨肉瘤的分子機(jī)理提供新的思路，另一方面為早期診斷骨肉瘤提供了更為靈敏的診斷試劑盒。
【專利說明】NPR3基因在制備診斷試劑盒中的用途 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種骨肉瘤診斷試劑盒及NPR3基因在制備骨肉 瘤診斷試劑盒中的應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 在轉(zhuǎn)錄組研究中應(yīng)用最早及最廣泛的為基因芯片技術(shù)，首先從待檢測樣品中提取 RNA，并利用熒光標(biāo)記的核苷酸將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)過標(biāo)記的核苷酸序列可與基因芯片 特定位點(diǎn)上的探針雜交，經(jīng)檢測雜交信號而獲取細(xì)胞基因表達(dá)信息?；蛐酒夹g(shù)已成為 一項非常穩(wěn)定可信的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，目前公布的大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)主要是利用基因芯片技術(shù)產(chǎn)生 的。
[0003] 骨肉瘤是來源于間葉組織的惡性腫瘤，其主要致病特征為體內(nèi)增殖的腫瘤細(xì)胞直 接形成未成熟骨或骨樣組織，是一種人類骨骼系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。目前，國內(nèi)篩 選該疾病的相關(guān)基因主要采用的是基因芯片技術(shù)構(gòu)建表達(dá)譜的方法。隨著生物技術(shù)的發(fā) 展，實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生了大量的基因芯片數(shù)據(jù)，并通過基因表達(dá)芯片篩選出了影響骨肉瘤發(fā)生 發(fā)展的基因及信號通路，已鑒別出大量差異表達(dá)的基因。但是不同的實(shí)驗(yàn)平臺及樣本的差 異導(dǎo)致各個基因芯片的分析結(jié)果存在很多不一致性。
[0004] Meta分析可對同一個問題所發(fā)表相關(guān)研究報告的結(jié)果進(jìn)行收集、統(tǒng)計上的整合， 以期獲得更準(zhǔn)確或更多的結(jié)果。這個分析能產(chǎn)生很多顯著的差異表達(dá)基因，能避免單個研 究帶來的不正確性。Meta分析是在多個芯片實(shí)驗(yàn)研究中識別差異表達(dá)基因的強(qiáng)有力工具。 此外，用Meta分析能識別出單個研究不能識別的差異基因，并且能有效地降低單個芯片數(shù) 據(jù)的假陽性。
[0005] 本發(fā)明通過對已發(fā)表的骨肉瘤轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析，篩選出影響骨肉 瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，并使用熒光實(shí)時定量PCR(QPCR)檢測驗(yàn)證臨床樣本中的表達(dá)，本 發(fā)明通過生物信息學(xué)手段發(fā)掘這些基因在骨肉瘤中的作用，從而對骨肉瘤的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行 探究，為其診斷和治療提供一定的研究基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過對已發(fā)表的骨肉瘤轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析和QPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) NPR3基因在骨肉瘤組織中的表達(dá)與在正常組織中的表達(dá)存在差異。與正常組織相比，NPR3 基因在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào)，通過檢測NPR3基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，可以判斷受試者 是否患有骨肉瘤。
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供NPR3基因在制備骨肉瘤診斷試劑盒中的用途。所述診斷 試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增NPR3基因和管家基因的引物對。 SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0008] 上述技術(shù)方案中，PCR緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選地，PCR緩 沖液包含：25mM KC1，2. 5mM MgCl2,200mM(NH4)2S04。
[0009] 引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)引物設(shè)計的常規(guī)設(shè)計原則設(shè)計。優(yōu)選的實(shí) 施方案中，擴(kuò)增NPR3基因的正向引物序列為5 ' -TATAACTCAACACGGAAC-3 '，反向引物序 列為5' -CTACCTAGAGACATCAAC-3' ；管家基因優(yōu)選GAPDH，擴(kuò)增該基因的正向引物序列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
[0010] 在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體 系，該逆轉(zhuǎn)錄體系包含：T重復(fù)寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶 抑制劑、dNTPs。
[0011] 優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL，375mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2， 50mM 的 DTT。
[0012] RNA酶抑制劑可選用本領(lǐng)域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)的非競爭 性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0013] 在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑， RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
[0014] 本發(fā)明的診斷試劑盒保存于-20°c，盡量減少反復(fù)凍融。
[0015] 本發(fā)明的又一個目的在于提供一種診斷骨肉瘤的試劑盒。所述診斷試劑盒包含 SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增NPR3基因和管家基因的引物對。所述SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0016] 上述技術(shù)方案中，PCR緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選地，PCR緩 沖液包含：25mM KC1，2. 5mM MgCl2,200mM(NH4)2S04。
[0017] 引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)引物設(shè)計的常規(guī)設(shè)計原則設(shè)計；優(yōu)選的實(shí) 施方案中，擴(kuò)增NPR3基因的正向引物序列為5 ' -TATAACTCAACACGGAAC-3 '，反向引物序 列為5' -CTACCTAGAGACATCAAC-3' ；管家基因優(yōu)選GAPDH，擴(kuò)增該基因的正向引物序列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
[0018] 在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體 系，該逆轉(zhuǎn)錄體系包含：T重復(fù)寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶 抑制劑、dNTPs。
[0019] 優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL，375mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2， 50mM 的 DTT。
[0020] RNA酶抑制劑可選用本領(lǐng)域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)的非競爭 性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0021] 在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑， RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
[0022] 本發(fā)明還提供了診斷骨肉瘤的方法，所述方法包括：
[0023] (1)利用RNA提取試劑提取樣本總RNA ;
[0024] (2)將步驟（1)獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ;
[0025] (3)在熒光實(shí)時定量PCR儀上將NPR3基因和管家基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測；
[0026] (4)通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Λ Λ CT法進(jìn)行相對定量；
[0027] (5)NPR3基因表達(dá)下調(diào)，表明研究對象為骨肉瘤患者。
[0028] 步驟（1)的具體實(shí)施方法為：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷 的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：
[0029] ①加入Trizol，室溫保存5min ;
[0030] ②加氯仿0. 2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5min-10min ;
[0031] ③12000rpm高速離心15min后吸取上層水相（吸70%)到另一新離心管中，注意 不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，充分顛倒 混勻，置于冰上lOmin ;
[0032] ④12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按lml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗滌沉淀（4°C保存），洗滌沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5min ;
[0033] ⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉 淀；
[0034] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-70°C。
[0035] 步驟（2)的具體實(shí)施方法為：用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對1 μ g總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。采用25 μ 1反應(yīng)體系，每個樣品取1 μ g總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入 以下組分：DEPC 水，5X 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 M-MLV RT，模板 RNA。42°C孵育 lh，72°C 10min，短暫離心。
[0036] 步驟（3)的具體實(shí)施方法為：采用25 μ 1反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個 平行管，所有擴(kuò)增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。配制以下反應(yīng)體系： SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12. 5μ1，正向引物（5μΜ/μ1)1μ1，反向引物 (5 μ Μ/ μ 1) 1 μ 1，模板CDNA2. 0 μ 1，無酶水8. 5 μ 1 ;擴(kuò)增NPR3基因的正向引物序列 為 5' -TATAACTCAACACGGAAC-3'，反向引物序列為 5' -CTACCTAGAGACATCAAC-3' ；擴(kuò) 增GAPDH基因的正向引物序列為5 ' -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3 '，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'，各項操作均于冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C 10min，（95°C 15s，60°C 60s) *45個循環(huán)。以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR 儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Λ ACT法進(jìn)行相對定量。
[0037] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于：（1)本發(fā)明首次公開了 NPR3基因與骨肉瘤相關(guān)， NPR3基因有望成為診斷骨肉瘤的分子標(biāo)志物，并為研究骨肉瘤的分子機(jī)理提供新的思路。 (2)利用檢測基因表達(dá)的方式診斷骨肉瘤的存在與否的方法更加靈敏，有利于疾病早期的 診斷。 【專利附圖】

【附圖說明】：
[0038] 圖1表示熒光實(shí)時定量PCR測定在正常組織和骨肉瘤組織中NPR3基因 mRNA的相 對表達(dá)量。
[〇〇39] 具體的實(shí)施方式：
[〇〇4〇] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0041] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[〇〇43] 實(shí)施例1篩選與骨肉瘤相關(guān)的基因
[0044] 1. 1NCBI GEO (Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)檢索
[0045] GEO (Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫是由NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心） 開發(fā)維護(hù)，GE0數(shù)據(jù)庫作為最大的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫以芯片數(shù)據(jù)為主，此外 亦包含一些非芯片類型的數(shù)據(jù)如SAGE (基因表達(dá)系列分析）數(shù)據(jù)、SARST (核糖體序列標(biāo)簽 連續(xù)分析）數(shù)據(jù)、MS (質(zhì)譜）數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和新一代高通量測序數(shù)據(jù)（MPSS，大規(guī)模平 行測序技術(shù)）等。
[0046] a.檢索關(guān)鍵詞：
[0047] {" osteosarcoma/7 [MeSH Terms]0R osteosarcoma [All Fields])AND/7 Homo sapi ens" [porgn]
[0048] b.研究中的樣本篩選策略：
[0049] 限制研究類型為"expression profiling by array"符合以下標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)集將納 入我們的研究中：①所選數(shù)據(jù)集必須是全基因組的表達(dá)mRNA芯片數(shù)據(jù)；②這些數(shù)據(jù)來自于 骨肉瘤病例組和對照組的活檢組織或培養(yǎng)的細(xì)胞（無藥物刺激或被轉(zhuǎn)染）；③本研究均考 慮經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化或者原始數(shù)據(jù)集；④所選數(shù)據(jù)集必須包括超過3個樣本以上。最后，有8套芯片 數(shù)據(jù)集納入我們的研究中（表1所示）。
[0050] 表1 8套骨肉瘤全基因組數(shù)據(jù)集的基本情況
[0051]
【權(quán)利要求】
1. NPR3基因在制備骨肉瘤診斷試劑盒中的用途，其特征在于，所述診斷試劑盒包含 SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增NPR3基因和管家基因的引物對；所述SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含：PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述擴(kuò)增NPR3基因的引物 對的序列如下：正向引物序列為5' -TATAACTCAACACGGAAC-3'，反向引物序列為 5' -CTACCTAGAGACATCAAC-3' ；所述管家基因是GAPDH，擴(kuò)增GAPDH基因的正向引物序列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR緩沖液包含：25mM KCL、2. 5mM MgCL2、200mM(NH4)2S04。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的用途，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄體系，所述逆轉(zhuǎn)錄體系包含：T重復(fù)寡核苷酸Oligo dT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄 酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含：250mM PH8. 3的 Tris-HCL、375mM 的 KCL、15mM 的 MgCL2、50mM 的 DTT。
6. -種骨肉瘤的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈 式反應(yīng)體系、用于擴(kuò)增NPR3基因和管家基因的引物對；所述SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體 系包含：PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增NPR3基因的引 物對的序列如下：正向引物序列為5 ' -TATAACTCAACACGGAAC-3 '，反向引物序列為 5' -CTACCTAGAGACATCAAC-3' ；所述管家基因是GAPDH，擴(kuò)增GAPDH基因的正向引物序列為 5' -ITTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液包含：25mM KCL、 2. 5mM MgCL2,200mM(NH4)2S04〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還 包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系，所述逆轉(zhuǎn)錄體系包含：T重復(fù)寡核苷酸Oligo dT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL、375mM 的 KCL、15mM 的 MgCL2、50mM 的 DTT。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087667SQ201410321627
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】楊祚璋, 謝琳, 許達(dá), 李東奇, 楊義豪, 張婭 申請人:楊祚璋