F9基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種F9基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，包括2×PCR緩沖液；競爭性DNA；PCR引物混合液；Taq?DNA聚合酶。AccuCopy技術(shù)的精確度高，變異系數(shù)小于5%，并且結(jié)果的準(zhǔn)確性也高。因此，本項發(fā)明采用了AccuCopy技術(shù)開發(fā)F9基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，并檢測發(fā)現(xiàn)了約15例有大缺失突變的血友病B患者，臨床應(yīng)用效果良好。
【專利說明】F9基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，應(yīng)用于生物科學(xué)研究和臨床分子診斷，具體涉及一種 F9基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 血友病B(HB)是臨床常見的一種遺傳性出血疾病，主要由F9基因突變導(dǎo)致凝血因 子IX (FIX)質(zhì)或量的缺陷而引起體內(nèi)凝血功能的異常，在男性中的發(fā)病率約為1/30, 000。 根據(jù)血漿中FIX活性，HB可分為輕型（>5%)、中型（1-5%)和重型（〈1%)三種類型。重型患者 表現(xiàn)為自發(fā)性關(guān)節(jié)出血，肌肉出血和內(nèi)臟器官出血等，輕型患者表現(xiàn)為外傷后出血難止。因 此，該病具有高致殘率和致死率。替代治療是目前唯一有效的治療方法，制劑主要包括凝血 酶原復(fù)合物（PCC)和重組凝血因子IX (rFIX)。由于缺乏根治措施，通過攜帶者診斷和產(chǎn)前 診斷避免血友病胎兒的出生，對提高人口素質(zhì)，減輕社會負(fù)擔(dān)具有重要的意義。然而，前提 是需要先對家系中血友病B患者進(jìn)行準(zhǔn)確有效的基因診斷。
[0003] F9基因位于X染色體長臂27. 1-27. 2,全長32. 7kb，包括8個外顯子和7個內(nèi)含子 及其側(cè)翼調(diào)控區(qū)域。遺傳方式為X連鎖隱性遺傳病，先證者同胞患病風(fēng)險決定于母親是否 為致病基因攜帶者，攜帶者女性的男性后代患病風(fēng)險為50%，女性后代攜帶致病基因的風(fēng)險 也為50%。男性患者的女性后代100%為攜帶者，而男性后代100%為正常。目前已報道的 F9基因突變類型廣泛，包括有點突變、缺失、插入、重復(fù)等。隨著基因體外擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)和 發(fā)展，通過患者外周血有核細(xì)胞DNA進(jìn)行F9基因分析已經(jīng)成為當(dāng)前進(jìn)行F9基因診斷的主 要手段。簡單來說，針對F9的8個外顯子及其側(cè)翼序列區(qū)域分別設(shè)計PCR引物進(jìn)行體外擴(kuò) 增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，通過將測序結(jié)果與參考序列比對，查找可能的致病 突變。這種直接測序的方法可以檢測錯義突變、剪接位點突變、無義突變及小缺失和小插入 等突變。當(dāng)家系中先證者的突變位點明確后，對于女性家系成員進(jìn)行的攜帶者檢測只需擴(kuò) 增相應(yīng)突變位點所在的外顯子，測序比對是否存在相同的突變。如果該女性為攜帶者，那么 相應(yīng)位點為雜合突變。女性攜帶者懷孕后，為了避免患兒的出生，懷孕16-22周時需要抽取 胎兒羊水進(jìn)行DNA抽提，直接擴(kuò)增胎兒羊水DNA的相應(yīng)突變位點所在外顯子，測序比對后查 找胎兒是否存在相同的突變。除了直接測序法查找致病突變外，我們還會對家系成員進(jìn)行 基因連鎖分析，以對攜帶者檢測和產(chǎn)前診斷結(jié)果進(jìn)行核實?；蜻B鎖分析并不是直接檢測 致病基因的異常，而是利用與致病基因緊密連鎖和共同傳遞的一系列基因組遺傳多態(tài)性標(biāo) 記，通過檢測家系先證者，明確與致病基因相關(guān)的這些遺傳標(biāo)記的特點，進(jìn)而對家系中其他 成員的遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測協(xié)助診斷。經(jīng)過前期工作的篩選后，我們選擇了 F9基因外的6個 STR 位點（DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)用于 F9 基因的遺傳連鎖 分析。然而由于遺傳連鎖分析屬于間診斷方法，且容易受到染色體同源重組等因素的影響， 不能得到完全可靠的結(jié)果，所以需要與常規(guī)測序方法的結(jié)果相互驗證以取得更加可信的診 斷結(jié)論。
[0004] 利用常規(guī)直接測序方法可使絕大部分的血友病B家系能得到明確診斷。但據(jù)血友 病B突變數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，大缺失或重復(fù)突變占總F9基因突變類型的5%左右，直接測序的方法 不能給與明確診斷，甚至漏診。首先，當(dāng)先證者存在大片段缺失時，由于缺失而使得PCR擴(kuò) 增失敗。而對于女性家系成員來說，由于存在另外一條正常的染色體模板，PCR擴(kuò)增是能夠 成功的，測序結(jié)果也是正常的，但不能排除攜帶者的可能性。其次，當(dāng)先證者為大片段重復(fù) 時，PCR能夠成功擴(kuò)增所有外顯子區(qū)域，但是測序比對不能發(fā)現(xiàn)重復(fù)突變。此時，對相應(yīng)外 顯子的拷貝數(shù)進(jìn)行定量能夠明確。基因大片段缺失和重復(fù)又稱為基因拷貝數(shù)變異（CNVs)。 隨著微陣列CNV芯片技術(shù)以及二代測序技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)變異（CNVs)廣泛地 存在于人類染色體基因組中。CNVs主要由基因組發(fā)生重組而導(dǎo)致，一般指長度為幾 kb-幾 Mb基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的重復(fù)，缺失和插入等。通 過拷貝數(shù)檢測方法對先證者F9各外顯子的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，如果相應(yīng)外顯子缺失，則拷貝 數(shù)結(jié)果為0 ;如果相應(yīng)外顯子重復(fù)，則拷貝數(shù)結(jié)果大于1。而對于攜帶者來說，如果缺失拷貝 數(shù)結(jié)果為1，而重復(fù)的話拷貝數(shù)結(jié)果將大于2。但是目前針對CNVs的檢測方法非常多，選擇 合適的技術(shù)用于F9基因檢測極為重要。
[0005] 目前CNVs的檢測方法主要有：多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-depengent probe amplification，MLPA)、微陣列比較基因雜交（array-based comparative genomic hybridization, array-CGH)、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP)分型芯片、affymetrix CNV芯片技術(shù)及二代測序技術(shù)等。此外，實時突 光定量 PCR 技術(shù)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)和突光 原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization, FISH)等則主要用于CNVs的驗證。 其中array-CGH、SNP分型芯片、Affymetrix微陣列技術(shù)、二代測序技術(shù)等主要用于全基因 組范圍內(nèi)未知CNVs的檢測，這些全基因組CNVs檢測技術(shù)先進(jìn)，準(zhǔn)確而高效，但相對比較昂 貴，尤其是在檢測某些特定基因或者特定區(qū)域時并不是最佳選擇。RT-qPCR方法雖然經(jīng)典， 但是效率太低，一個反應(yīng)體系中不能同時對多個片段進(jìn)行檢測。MLPA主要是針對特定基因 或特定區(qū)域進(jìn)行拷貝數(shù)檢測的技術(shù)，2002年由Schouten等首次報道，是目前應(yīng)用最為廣泛 的單一基因拷貝數(shù)檢測技術(shù)，可在同一反應(yīng)管中對50個不同片段的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，所需 設(shè)施簡單，PCR儀和毛細(xì)管電泳儀。荷蘭MRC-Holland公司研發(fā)了數(shù)百種MLPA檢測試劑 盒，用于人類疾病，細(xì)胞遺傳學(xué)及腫瘤研究，其中包括各種遺傳性出血與血栓性疾病的相關(guān) 基因的CNVs的檢測。盡管MLPA在診斷特定基因外顯子CNVs方面技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但是 MLPA也存在一些比較突出的問題。首先，它對所檢測標(biāo)本的DNA質(zhì)量要求相對較高，普通的 DNA抽提方法無法滿足實驗要求，需要購買質(zhì)量較好的商品化試劑盒進(jìn)行抽提，增加了實驗 成本，而且檢測標(biāo)本和參比標(biāo)本必須使用同種DNA抽提方法。其次，MLPA方法不易建立，我 們也曾試圖進(jìn)行該方法的建立，但是通過多次嘗試后，并未得到理想而又準(zhǔn)確的結(jié)果。我們 也曾經(jīng)購買商品化的試劑盒，每次檢測結(jié)果不穩(wěn)定，不能保證結(jié)果的可靠性。因此，我們針 對自己的需求開發(fā)了以多重突光競爭PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的AccuCopy拷貝數(shù)檢測技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的以上問題，提供一種F9基因拷貝數(shù)變異 檢測試劑盒，基于多重基因拷貝數(shù)檢測方法技術(shù)，檢測F9基因拷貝數(shù)變異的試劑盒及檢測 體系，主要用于檢測F9基因缺失或重復(fù)突變而導(dǎo)致的凝血因子IX (FIX)質(zhì)或量的缺陷，以 獲取F9基因各目標(biāo)位點的正確拷貝數(shù)的檢測試劑盒。
[0007] 為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)： 一種F9基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，包括： 1) 2XPCR緩沖液； 2) 競爭性DNA ; 3) PCR引物混合液； 4) TaqDNA聚合酶； 其中，所述PCR引物混合液包括： a) F9_l，F(xiàn)9_2+3, F9_4, F9_5, F9_6, F9_7, F9_8 共七對目標(biāo)位點的多重 PCR 引物：SEQ ID NO:1-14 ； b) 參照位點A、參照位點B、參照位點C共三對參照基因的多重PCR引物：SEQ ID NO:15-20 ； c) 一對性別位點的多重PCR引物：SEQ ID NO: 21-22 ; 所述競爭性DNA包括： i) F9_1，F(xiàn)9_2+3，F(xiàn)9_4，F(xiàn)9_5，F(xiàn)9_6，F(xiàn)9_7，F(xiàn)9_8 共七個人標(biāo)準(zhǔn)序列的內(nèi)對照 DNA :SEQ ID NO:23-29; ii) 參照基因 A、參照基因 B、參照基因 C共三個參照基因的內(nèi)對照DNA :SEQ ID NO:30-32。
[0008] 進(jìn)一步的，所述的每對引物中有一個5'端熒光素標(biāo)記。
[0009] 優(yōu)選的，所述熒光素可選用 FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、熒光素、FITC、 IRD-700/800、CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、TET、TAMRA、J0E、B0DIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅 丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬黃。但不僅限于此23種熒光素，如果上述所標(biāo)記引物的擴(kuò)增 產(chǎn)物利用片斷大小可以區(qū)分鑒別，可利用同種熒光標(biāo)記；如果無法以擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小區(qū) 別則可利用不同種熒光標(biāo)記區(qū)分。
[0010] F9基因拷貝數(shù)變異檢測方法，主要包括以下步驟： (1) 針對待測F9基因，設(shè)計七對目標(biāo)位點的多重PCR引物，每對引物中的一條具有熒光 標(biāo)記；設(shè)計了三對參照基因的多重PCR引物；每對引物中的一條具有熒光標(biāo)記；設(shè)計了一對 性別位點的多重PCR引物；該對引物中的一條具有熒光標(biāo)記；上述同種熒光標(biāo)記的多重PCR 引物對應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度有差異； (2) 設(shè)計針對不同待測的F9基因目標(biāo)位點和參照基因的內(nèi)對照DNA片段，所述內(nèi)對照 DNA片段與（1)中對應(yīng)的多重PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物高度一致，為對應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列缺失或 插入少數(shù)1-50個堿基的序列； (3) 對所有內(nèi)對照DNA片段嚴(yán)格定量； (4) 將每種內(nèi)對照DNA片段等量混合，與所述多重PCR引物對待測樣品進(jìn)行多重?zé)晒?PCR擴(kuò)增； (5) 擴(kuò)增產(chǎn)物通過變性毛細(xì)管電泳將不同長度的片段分開，得到每個條帶的位置信息 以及熒光強(qiáng)度。
[0011] 優(yōu)選的，步驟（5)之后還包括以下步驟：計算每個F9基因目標(biāo)位點的樣本條帶/ 內(nèi)對照DNA條帶的熒光峰高或面積比，然后將目標(biāo)位點的該比值除以參照基因的該比值再 乘以參照基因的拷貝數(shù)即得目標(biāo)位點的相對拷貝數(shù)。
[0012] 如果存在目標(biāo)位點拷貝數(shù)已知的參照樣本，可以將待測樣本目標(biāo)位點的相對拷貝 數(shù)除以參照樣本對應(yīng)目標(biāo)位點的相對拷貝數(shù)再乘以參照樣本該目標(biāo)位點拷貝數(shù)即得待測 樣本該目標(biāo)位點的精確拷貝數(shù)。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是： 1、AccuCopy技術(shù)與MLPA -樣，可在同一反應(yīng)管中針對多個外顯子進(jìn)行拷貝數(shù)檢 測。而且在診斷特定基因或者特定區(qū)域CNVs方面AccuCopy具有更大的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。 AccuCopy技術(shù)操作相對簡單，只需要常規(guī)的PCR儀及ABI3130XL測序儀，而且對模板DNA 的質(zhì)量要求沒有MLPA高，各種方法抽提的DNA均能滿足試驗要求，且僅需10-20 ng的模板 DNA。同時，應(yīng)用AccuCopy技術(shù)，完成整個試驗過程只需要4個小時，而MLPA需要24個小 時，效率明顯提高。更為重要的是AccuCopy技術(shù)的精確度高，變異系數(shù)小于5%，并且結(jié)果的 準(zhǔn)確性也高。因此，本項發(fā)明采用了 AccuCopy技術(shù)開發(fā)F9基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，并 檢測發(fā)現(xiàn)了約15例有大缺失突變的血友病B患者，臨床應(yīng)用效果良好。
[0014] 2、快速檢測：在獲得內(nèi)對照DNA后，只要將樣本DNA與內(nèi)對照DNA混勻后進(jìn)行多重 PCR，然后將PCR產(chǎn)物直接上毛細(xì)管熒光電泳儀(如ABI測序儀）即可，整個實驗過程僅需要 一步PCR循環(huán)和一步毛細(xì)管電泳，耗時不到4個小時。
[0015] 3、高精確性：由于目標(biāo)基因片段與其內(nèi)對照DNA之間僅有少數(shù)幾個堿基差別，這 兩個模板的擴(kuò)增效率將體現(xiàn)高度一致性，因此最后的擴(kuò)增產(chǎn)物真實的反應(yīng)了擴(kuò)增前兩個模 板濃度比例，根據(jù)我們預(yù)測試結(jié)果，一個競爭性PCR反應(yīng)重復(fù)3次的標(biāo)準(zhǔn)方差在5%之內(nèi)，而 且如果將目標(biāo)基因片段與內(nèi)對照DNA按不同稀釋梯度混合進(jìn)行競爭性PCR，我們發(fā)現(xiàn)樣本 峰與內(nèi)對照峰面積之比與兩個模板的原始濃度比的相關(guān)性達(dá)到99. 9%以上。
[0016] 上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。 本發(fā)明的【具體實施方式】由以下實施例及其附圖詳細(xì)給出。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，本發(fā) 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中： 圖1為本發(fā)明所述檢測方法的原理示意圖； 圖2為本發(fā)明實施例中樣品1檢測結(jié)果示意圖； 圖3為本發(fā)明實施例中樣品2檢測結(jié)果示意圖。

【具體實施方式】
[0018] 下面將參考附圖并結(jié)合實施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0019] F9基因目標(biāo)位點序列，參照基因及內(nèi)對照DNA序列信息： 1、F9基因位點1 (目標(biāo)位點） 人標(biāo)準(zhǔn)序列，164bp tccaaagacccattgagggagatggacattatttcccagaagtaaatacagctcagcttgtactttggtacaa ctaatcgaccttaccactttcacaatctgc TAGC aaaggttatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcacc aggcctcatcaccat F9_l內(nèi)對照DNA序列，162bp tccaaagacccattgagggagatggacattatttcccagaagtaaatacagctcagcttgtactttggtacaa ctaatcgaccttaccactttcacaatctgc TC aaaggttatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccag gcctcatcaccat 2、 F9基因位點2+3 (目標(biāo)位點） 人標(biāo)準(zhǔn)序列，188bp tggctccatgccctaaagagaaattggctttcagattatttggattaaaaacaaagactttcttaagagatg taaaattttcatgatgttttcttttttgctaaaactaaagaattattcttttacatttcagtttttcttgatcatga aaacgccaac AAAA ttctgaatcggccaaagaggtataa F9_2+3內(nèi)對照DNA序列，186bp tggctccatgccctaaagagaaattggctttcagattatttggattaaaaacaaagactttcttaagagatg taaaattttcatgatgttttcttttttgctaaaactaaagaattattcttttacatttcagtttttcttgatcatga aaacgccaac AA ttctgaatcggccaaagaggtataa 3、 F9基因位點4 (目標(biāo)位點） 人標(biāo)準(zhǔn)序列，154bp ggaccgggcattctaagcagtttacgtgccaattcaatttcttaacctatctcaaagatggagatcagtgtga gtcca ATCC atgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggattt gaagg F9_4內(nèi)對照DNA序列，152bp ggaccgggcattctaagcagtttacgtgccaattcaatttcttaacctatctcaaagatggagatcagtgtga gtcca AC atgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttga agg 4、 F9基因位點5 (目標(biāo)位點） 人標(biāo)準(zhǔn)序列，96bp aatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctc CTGT actgagggatat cgacttgcagaaaaccagaagtcc F9_5內(nèi)對照DNA序列，94bp aatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctc CT actgagggatateg acttgcagaaaaccagaagtcc 5、 F9基因位點6 (目標(biāo)位點） 人標(biāo)準(zhǔn)序列，212bp aagtgacaaggatgggcctcaatctcaatttttgtaatacatgttccatttgccaatgagaaatatcaggtta ctaatttttcttctatttttctagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcaca AACT tctaagctcacccg tgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttgga F9_6內(nèi)對照DNA序列，210bp aagtgacaaggatgggcctcaatctcaatttttgtaatacatgttccatttgccaatgagaaatatcaggtta ctaatttttcttctatttttctagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcaca AT tctaagctcacccgtg ctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttgga 6、 F9基因位點7 (目標(biāo)位點） 人標(biāo)準(zhǔn)序列，174bp Tgttttcacaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggat tgtaactgctgcccactgtgttga AACT ggtgttaaaattacagttgtcgcaggtaaatacacagaaagaataata atctgcagcaccactagctctttaa F9_7內(nèi)對照DNA序列，172bp tgttttcacaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggat tgtaactgctgcccactgtgttga AT ggtgttaaaattacagttgtcgcaggtaaatacacagaaagaataataat ctgcagcaccactagctctttaa 7、 F9基因位點8 (目標(biāo)位點） 人標(biāo)準(zhǔn)序列，109bp tggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactga AGTG gaagg gaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaa F9_8內(nèi)對照DNA序列，107bp tggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactga AG gaaggga ccagtttcttaactggaattattagctggggtgaa 8、 參照基因 A 人標(biāo)準(zhǔn)序列，75bp TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGAGCTTTCAAGGAAAAAGG CTGT ATGCTGCGTTTGCCTGCCTTCCAAGCAA 參照基因 A內(nèi)對照DNA序列，73bp TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGAGCTTTCAAGGAAAAAGG C T ATGCTGCGTTTGCCTGCCTTCCAAGCAA 9、 參照基因 B 人標(biāo)準(zhǔn)序列，145bp CACTGAGCCCCAGAGACCTGACAAGCCTGTTTGAGCCGTGCCTGAAAAATGTGGCTCATCCTCAG GCTG CAG CGGGGAAAATGGAAGAGTTTAATTGGTTCTGACTTCAGGATTCAGATCATAGTTTTCCCTGGAGGTGTGCATT 參照基因 B內(nèi)對照DNA序列，143bp CACTGAGCCCCAGAGACCTGACAAGCCTGTTTGAGCCGTGCCTGAAAAATGTGGCTCATCCTCAG GG CAGCG GGGAAAATGGAAGAGTTTAATTGGTTCTGACTTCAGGATTCAGATCATAGTTTTCCCTGGAGGTGTGCATT 10、 參照基因 C 人標(biāo)準(zhǔn)序列，222bp AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAGGCTTTTTCAGGGAGACCATCAGTGGGTGGGAGAAGATGTCTCATCTCCGC CCGAGTCTCCATTGTGAGCTTTCTGAGCATTTCACCATGGAGACTCGGCACAGACGTGTTCCTTGGCTTTCCTGTAG GAATCCAGGGCCCACCAGAGCTTCCCTTAGCACCAGCAG TGGCAGCTGGTTCATTTTGCCACCCTCCAGTAGC 參照基因 C內(nèi)對照DNA序列220bp AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAGGCTTTTTCAGGGAGACCATCAGTGGGTGGGAGAAGATGTCTCATCTCCGC CCGAGTCTCCATTGTGAGCTTTCTGAGCATTTCACCATGGAGACTCGGCACAGACGTGTTCCTTGGCTTTCCTGTAG GAATCCAGGG CCCACCAGAGCTTCCCTTAGCACCA GG TGGCAGCTGGTTCATTTTGCCACCCTCCAGTAGC 11、性別位點 人標(biāo)準(zhǔn)序列，X染色體，116bp CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTGTGTTGATTCTTTATCCCAGATGTTTCTCAAGTGGTCCTGATTTTACAGT TCCTACCACCAGCTTCCCAGTTTAAGCTCTGATGGTTGGCCTC 人標(biāo)準(zhǔn)序列，Y染色體，122bp CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTGGGTGGATTCTTCATCCCAAATAAAGTGGTTTCTCAAGTGGTCCCAATTT TACAGTTCCTACCATCAGCTTCCCAGTTTAAGCTCTGATGGTTGGCCTC 下表為用于復(fù)合擴(kuò)增體系的引物序列以及所述引物序列的混合物。

【權(quán)利要求】
1. 一種F9基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，其特征在于，包括： 1) 2XPCR緩沖液； 2) 競爭性DNA ; 3. PCR引物混合液； 4. TaqDNA聚合酶； 其中，所述PCR引物混合液包括： a) F9_l，F(xiàn)9_2+3, F9_4, F9_5, F9_6, F9_7, F9_8 共七對目標(biāo)位點的多重 PCR 引物：SEQ ID NO:1-14 ； b) 參照位點A、參照位點B、參照位點C共三對參照基因的多重PCR引物：SEQ ID NO:15-20 ； c) 一對性別位點的多重PCR引物：SEQ ID NO: 21-22 ; 所述競爭性DNA包括： i) F9_1，F(xiàn)9_2+3，F(xiàn)9_4，F(xiàn)9_5，F(xiàn)9_6，F(xiàn)9_7，F(xiàn)9_8 共七個人標(biāo)準(zhǔn)序列的內(nèi)對照 DNA :SEQ ID NO:23-29; ii) 參照基因 A、參照基因 B、參照基因 C共三個參照基因的內(nèi)對照DNA :SEQ ID NO:30-32。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的F9基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，其特征在于：所述的每對引 物中有一個5'端突光素標(biāo)記。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的F9基因拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，其特征在于：所述熒光素 可選用 FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、熒光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3. 5、 CY5. 5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬 黃。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046699SQ201410322475
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】王學(xué)鋒, 姜正文, 丁秋蘭, 張希, 戴菁, 姚忻岑, 陸曄玲, 林琳 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院, 天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司