高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明揭示了一種利用可以用于穩(wěn)定地提高Darbepoetinα表達(dá)量的無血清培養(yǎng)基的高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)方法。該方法包括采用無血清培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞株，然后在CHO細(xì)胞中高效表達(dá)Darbepoetinα的步驟。本發(fā)明還揭示了上述的高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)方法所使用的一種無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明的高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)方法中，利用可以用于穩(wěn)定提高Darbepoetinα表達(dá)量的無血清培養(yǎng)基組分，同時(shí)CHO細(xì)胞能夠高效穩(wěn)定地表達(dá)Darbepoetinα，表達(dá)穩(wěn)定、培養(yǎng)方法簡(jiǎn)潔、適合大規(guī)模培養(yǎng)。
【專利說明】高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的工業(yè)化生產(chǎn) 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激 蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)方法，尤其涉及一種利用可以用于穩(wěn)定地提高Darb印oetina表達(dá)量的 無血清培養(yǎng)基的高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 促紅細(xì)胞生成素（ΕΡ0)是一種主要由腎臟分泌的糖蛋白，分子量約為34kD，是人 體內(nèi)調(diào)節(jié)紅系造血的主要激素，其與骨髓中紅系祖細(xì)胞表面的ΕΡ0受體（EP0R)結(jié)合，刺激 紅系祖細(xì)胞（包括紅系爆式集落形成單位（BFU-E)、紅系集落形成單位（CFU-E)及原紅細(xì) 胞）的增殖、分化和成熟。腎功能受損導(dǎo)致ΕΡ0無法正常分泌，因此ΕΡ0是治療慢性腎性貧 血的有效藥物，上市25年來已被國(guó)內(nèi)外大量的臨床試驗(yàn)研究所證實(shí)。
[0003] 隨著ΕΡ0的市場(chǎng)接受度逐年提高，我國(guó)對(duì)ΕΡ0的需求量逐年遞增。由于ΕΡ0在體 內(nèi)的半衰期短，患者需要頻繁的給藥，因此如何延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期，減少病人的痛苦和治療 費(fèi)用是國(guó)際上ΕΡ0藥物研究的熱點(diǎn)。遵循此思路，國(guó)際上已研發(fā)并成功上市了兩種長(zhǎng)效ΕΡ0 產(chǎn)品，一種是Amgen通過氨基酸突變?cè)黾犹腔稽c(diǎn)的長(zhǎng)效產(chǎn)品Darbepoetin α，另一種是 聚乙二醇修飾的EPO(PEG-EPO)。
[0004] Darbepoetin α (商品名Aranesp)是Amgen公司于2001年上市的多糖基化位點(diǎn) 修飾的長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素，其物質(zhì)結(jié)構(gòu)是通過對(duì)促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin, ΕΡ0) 進(jìn)行基因改造，增加了兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，從而使其在體內(nèi)半衰期比ΕΡ0延長(zhǎng)了 3倍。 Darbepoetina的使用方法與ΕΡ0(每周注射3次）明顯不同的是，Darbepoetina變?yōu)槊?周或每?jī)芍茏⑸湟淮?，從而?jiǎn)化了患者和保健服務(wù)提供的護(hù)理過程，明顯降低了治療成本， 減輕了病人的痛苦。
[0005]目前國(guó)內(nèi)ΕΡ0的規(guī)?；a(chǎn)方式為兩種，一種是采用有血清培養(yǎng)基在滾瓶中貼壁 擴(kuò)增細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)滿層后更換培養(yǎng)基至不含牛血清的培養(yǎng)基生產(chǎn)收獲。這種生產(chǎn)方式 對(duì)硬件投入要求低，但需要大量的人員操作。另外一種生產(chǎn)方式則是將細(xì)胞接種至含有固 定載體基質(zhì)的發(fā)酵罐中，通過一定時(shí)間的靜置使細(xì)胞貼壁至固相載體上生長(zhǎng)，待細(xì)胞密度 達(dá)到最高后更換培養(yǎng)基至不含牛血清的培養(yǎng)基生產(chǎn)收獲。由于固相載體形式的培養(yǎng)受限 于固相載體的重量，因此放大生產(chǎn)存在困難，國(guó)內(nèi)有廠家使用數(shù)十個(gè)20L規(guī)模以下的小罐 平行進(jìn)行生產(chǎn)。這兩種生產(chǎn)方式都存在著由數(shù)十至上百個(gè)不同容器培養(yǎng)一個(gè)批次產(chǎn)品的問 題，產(chǎn)品質(zhì)量很難保證均一性。同時(shí)這兩種生產(chǎn)方式都需要使用牛血清，增加未知病毒污染 產(chǎn)品的可能性，給臨床用藥安全造成隱患。
[0006] 名詞解釋：CH0細(xì)胞是指是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種利用可以用于穩(wěn)定地提 高Darb印oetin α表達(dá)量的無血清培養(yǎng)基工業(yè)化生產(chǎn)高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng) 刺激蛋白的方法，即多糖基化位點(diǎn)修飾的長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素 Darbepoetin α的工業(yè)化生 產(chǎn)方法。
[0008] 本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：
[0009] 一種無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述無血清基礎(chǔ) 培養(yǎng)基由SIGMA公司生產(chǎn)的Ex-cel 1302培養(yǎng)基和Hyclone公司生產(chǎn)的CP1027培養(yǎng)基組成， 所述添加劑包括D-半乳糖、尿嘧啶、Mn2+中的一種或多種的組合。
[0010] 上述的無血清培養(yǎng)基中，添加劑的溶劑可以為培養(yǎng)基中的水，但不限于此。
[0011] 上述的無血清培養(yǎng)基中，理論上，無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基還可以用其他市售的商業(yè)化 無血清培養(yǎng)基中的一種或多種的組合。
[0012] 上述的無血清培養(yǎng)基中，優(yōu)選的，以重量比計(jì)，所述Ex_cell302培養(yǎng)基：CP1027 培養(yǎng)基組成=9 : 1-1 : 1;優(yōu)選的，所述Ex-cell302培養(yǎng)基：CP1027培養(yǎng)基組成=9 : 1。
[0013] 上述的無血清培養(yǎng)基中，優(yōu)選的，所述D-半乳糖在無血清培養(yǎng)基中的含量為 500mg/L-5000mg/L，所述尿嘧啶在無血清培養(yǎng)基中的含量為100mg/L-500mg/L，所述Mn 2+在 無血清培養(yǎng)基中的含量為1 μ mol/L-50 μ mol/L。
[0014] 本發(fā)明還提供一種利用上述的無血清培養(yǎng)基來工業(yè)化生產(chǎn)高糖基化修飾的重組 人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的方法，該方法包括采用無血清培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng) CH0細(xì)胞株，然后在CH0細(xì)胞中高效表達(dá)Darbepoetin α的步驟。
[0015] 上述的方法中，優(yōu)選的，該方法包括采用無血清培養(yǎng)基，在生物反應(yīng)器中，采用無 血清懸浮灌注培養(yǎng)工藝懸浮培養(yǎng)CH0細(xì)胞株，在CH0細(xì)胞中高效表達(dá)Darb印oetin α，然后 收獲培養(yǎng)液的步驟。
[0016] 本發(fā)明通過培養(yǎng)CH0細(xì)胞，用CH0細(xì)胞表達(dá)Darb印oetina，細(xì)胞所表達(dá)的 Darbepoetin α?xí)尫旁谂囵B(yǎng)液中，通過不斷收獲培養(yǎng)液來實(shí)現(xiàn)重組蛋白的生產(chǎn)。
[0017] 上述的方法中，優(yōu)選的，所述無血清懸浮灌注培養(yǎng)工藝包括細(xì)胞接種階段控制，細(xì) 胞生長(zhǎng)階段控制和細(xì)胞生產(chǎn)階段控制；所述細(xì)胞接種階段控制為將CH0細(xì)胞接種到無血清 培養(yǎng)基中，其起始接種密度為4-8 X 105cellS/ml，接種體積為工作體積的1/6-1/3,攪拌轉(zhuǎn) 數(shù)為100-200轉(zhuǎn)/分鐘，得到接種了 CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
[0018] 上述的方法中，細(xì)胞生長(zhǎng)階段為細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的擴(kuò)增階段，優(yōu)選的，所 述細(xì)胞生長(zhǎng)階段控制為在溫度351：-371：、？?jī)?cè).90-7.20、溶解氧20%-60%的條件下，以 100-200轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌轉(zhuǎn)數(shù)攪拌接種了 CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)接種在該無血 清培養(yǎng)基中的CH0細(xì)胞，培養(yǎng)4天-6天，直到生物反應(yīng)器中的CH0細(xì)胞的細(xì)胞密度長(zhǎng)至 6X 106cells/ml，進(jìn)入穩(wěn)定期，得到增殖CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
[0019] 上述的方法中，優(yōu)選的，所述細(xì)胞生產(chǎn)階段控制為向生物反應(yīng)器中的增殖CH0 細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中灌注生物反應(yīng)器工作體積的〇. 8-1. 2倍的無血清培養(yǎng)基，在溫度 35-37°C、pH6. 90-7. 20、溶解氧20% -60%的條件下，以攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100-200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 攪拌培養(yǎng)25天-30天，收集培養(yǎng)液。
[0020] 上述的收集培養(yǎng)液后剩下的CH0細(xì)胞可以繼續(xù)灌注無血清培養(yǎng)基，以實(shí)現(xiàn)連續(xù)生 產(chǎn)。
[0021] 上述的方法中，在培養(yǎng)過程中需要監(jiān)測(cè)培養(yǎng)條件，以保證培養(yǎng)過程的精準(zhǔn)和穩(wěn)定 控制，優(yōu)選的，所述無血清懸浮灌注培養(yǎng)工藝還包括對(duì)整個(gè)培養(yǎng)周期中每天的溫度、pH、葡 萄糖濃度、摩爾滲透壓濃度及蛋白表達(dá)量的監(jiān)控。
[0022] 上述的方法中，監(jiān)控的目的控制上述指標(biāo)的參數(shù)不發(fā)生劇烈的波動(dòng)，其可以通過 本領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行調(diào)控。
[0023] 本發(fā)明的突出效果為：
[0024] 本發(fā)明中高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白Darbepoetina的生產(chǎn)采 用連續(xù)灌注懸浮培養(yǎng)方式，這種生產(chǎn)方式有以下三點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：
[0025] 1)發(fā)酵罐中的細(xì)胞通過截流系統(tǒng)使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)，因此整個(gè)生產(chǎn)過程中能 維持較高的細(xì)胞密度，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；
[0026] 2)由于不斷有新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充到發(fā)酵罐中，代謝廢物可及時(shí)排出，因此細(xì)胞穩(wěn)定 的處在較好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，細(xì)胞培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高，產(chǎn)品均一性能得到保 證。
[0027] 3)產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。
[0028] 本發(fā)明通過無血清培養(yǎng)基連續(xù)灌注培養(yǎng)方式生產(chǎn)Darb印oetin a，不僅使生產(chǎn)工 藝穩(wěn)定且易于放大，同時(shí)大大減輕了生產(chǎn)者的勞動(dòng)強(qiáng)度，提高了產(chǎn)品的安全性和均一性。
[0029] 本發(fā)明的高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)方法中，利用 可以用于穩(wěn)定提高Darb印oetin a表達(dá)量的無血清培養(yǎng)基組分，同時(shí)CH0細(xì)胞能夠高效穩(wěn) 定地表達(dá)Darbepoetin a，表達(dá)穩(wěn)定、培養(yǎng)方法簡(jiǎn)潔、適合大規(guī)模培養(yǎng)。
[0030] 以下便結(jié)合實(shí)施例附圖，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步的詳述，以使本發(fā)明 技術(shù)方案更易于理解、掌握。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1是實(shí)施例1中不同培養(yǎng)基組合對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響結(jié)果圖；
[0032] 圖2是實(shí)施例1中不同培養(yǎng)基組合對(duì)細(xì)胞表達(dá)量的影響結(jié)果圖；
[0033] 圖3是實(shí)施例1中不同培養(yǎng)基組合對(duì)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物酸性比例的影響結(jié)果圖；
[0034] 圖4是實(shí)施例1中培養(yǎng)基添加劑對(duì)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物酸性比例的影響結(jié)果圖；
[0035] 圖5是實(shí)施例2中5L反應(yīng)器中細(xì)胞的生長(zhǎng)及表達(dá)情況圖；
[0036] 圖6是實(shí)施例3中30L反應(yīng)器中細(xì)胞的生長(zhǎng)及表達(dá)情況圖。

【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí) 施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可 從商業(yè)途徑獲得。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 本實(shí)施例提供一種無血清培養(yǎng)基，其包括無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑。
[0040] 本實(shí)施例的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基比例是這樣確定的：
[0041] 將種子細(xì)胞復(fù)蘇并擴(kuò)增培養(yǎng)，制備細(xì)胞懸液，分別接種于1、2、3三種無血清培養(yǎng) 基，培養(yǎng)基1、2、3分別為重量份數(shù)比是9:1、3:1、1:1的Ex-cell302培養(yǎng)基和CP1027培養(yǎng) 基的組合培養(yǎng)基。在36+0. 2°C培養(yǎng)，進(jìn)行6天的糖批實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)第4天開始，每日取細(xì)胞計(jì) 數(shù)，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞后凍存，應(yīng)用ELISA的方法檢測(cè)細(xì)胞的表達(dá)量，應(yīng)用IEF 的方法檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物酸性部分比例。在評(píng)價(jià)中，以酸性部分比例作為首要考慮指標(biāo)。評(píng) 價(jià)結(jié)果如圖1、圖2和圖3所示，培養(yǎng)基1中細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá)尚可，并且產(chǎn)物酸性部分比例明 顯比另外兩者商。
[0042] 本實(shí)施例的添加劑是這樣確定的：
[0043] 將種子細(xì)胞復(fù)蘇并擴(kuò)增培養(yǎng)，制備細(xì)胞懸液，接種，將細(xì)胞分別于不含添加劑和含 D-半乳糖l〇〇〇mg/L，尿嘧啶100mg/L，Μη2+2 μ Μ的添加劑的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，無血清培養(yǎng) 基為分?jǐn)?shù)比9 :1的Ex-cell302培養(yǎng)基和CP1027培養(yǎng)基。在36+0. 2°C培養(yǎng)6天后收集上 清液，用IEF的方法檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物酸性部分比例。結(jié)果如圖4所示（圖中A :未加添加 齊U ;B :加添加劑），添加劑能夠明顯增加產(chǎn)物酸性比例。
[0044] 所以本實(shí)施例的無血清培養(yǎng)基為重量份數(shù)比是9:1的Ex-Cell302培養(yǎng)基和 CP1027培養(yǎng)基的組合組成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑組成的無血清培養(yǎng)基，其中添加劑D-半 乳糖的濃度為l〇〇〇mg/L，添加劑尿嘧啶的濃度為100mg/L，添加劑Mn 2+的濃度為2μΜ。
[0045] 實(shí)施例2
[0046] 本實(shí)施例提供一種高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)方 法，使用實(shí)施例1的無血清培養(yǎng)基，采用動(dòng)物細(xì)胞5L反應(yīng)器，進(jìn)行高密度、懸浮灌注培養(yǎng)，包 括如下步驟：
[0047] 1、細(xì)胞接種階段控制
[0048] 復(fù)蘇一支20mL的CH0種子細(xì)胞至搖瓶，每3天傳代擴(kuò)增，至細(xì)胞擴(kuò)增到500mL，細(xì) 胞處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（密度在3X106cells/mL左右），將該500ml種子細(xì)胞接種至5L NBS CELLIGEN310生物反應(yīng)器內(nèi)的無血清培養(yǎng)基，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為100-200轉(zhuǎn)/分鐘。接種后細(xì)胞密 度為5. lX105cells/mL，反應(yīng)器起始工作體積為3L，得到接種了 CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
[0049] 2、細(xì)胞生長(zhǎng)階段控制
[0050] 在溫度36+0. 2 °C、pH6. 90-7. 20、溶解氧20% -60 %的條件下，以120轉(zhuǎn)/分鐘的 攪拌轉(zhuǎn)數(shù)攪拌接種了 CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)接種在該無血清培養(yǎng)基中的CH0細(xì)胞， 培養(yǎng)4天，直到生物反應(yīng)器中的CH0細(xì)胞的細(xì)胞密度長(zhǎng)至6 X 106cellS/ml，得到增殖CH0細(xì) 胞的無血清培養(yǎng)基。
[0051] 3、細(xì)胞生產(chǎn)階段控制
[0052] 當(dāng)細(xì)胞密度超過6X106cells/mL，進(jìn)入表達(dá)期，降溫至35+0. 2°C，向生物反應(yīng)器中 的增殖CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中灌注生物反應(yīng)器工作體積的1倍的無血清培養(yǎng)基。再以 攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100-200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速攪拌培養(yǎng)30天后，終止培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液。
[0053] 4、監(jiān)測(cè)培養(yǎng)條件
[0054] 培養(yǎng)過程中需要監(jiān)測(cè)后控制的指標(biāo)有：溫度、pH值、葡萄糖濃度（每升大于兩克）、 摩爾滲透壓濃度（控制在280-350之間）。
[0055] 上述方法培養(yǎng)的CH0細(xì)胞能夠在5L反應(yīng)器中高效穩(wěn)定地表達(dá)Darb印oetin α。細(xì) 胞生長(zhǎng)及表達(dá)結(jié)果如圖5所示?？梢娫?L反應(yīng)器中細(xì)胞能保持高密度及高活率，細(xì)胞的平 均密度為lX107cells/mL，平均活率為93%，Darb印oetina的平均表達(dá)量為50mg/L。
[0056] 實(shí)施例3
[0057] 本實(shí)施例提供一種高糖基化修飾的重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)方 法，使用實(shí)施例1的無血清培養(yǎng)基，采用動(dòng)物細(xì)胞30L反應(yīng)器的高密度、懸浮灌注培養(yǎng)，包括 如下步驟：
[0058] 1、細(xì)胞接種階段控制
[0059] 復(fù)蘇一支20mL的CH0種子細(xì)胞至搖瓶，每3天傳代擴(kuò)增，至細(xì)胞擴(kuò)增到5000mL， 細(xì)胞處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（密度在3X10 6cells/mL左右），將該5000ml種子細(xì)胞接種至 Sartourius Stedium C-Plus30L生物反應(yīng)器內(nèi)的無血清培養(yǎng)基，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為100-200轉(zhuǎn)/ 分鐘。接種后細(xì)胞密度為6. 6X105cells/mL，反應(yīng)器起始工作體積為30L，得到接種了 CH0 細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
[0060] 2、細(xì)胞生長(zhǎng)階段控制
[0061] 在溫度36+0. 2°C、pH6. 90-7. 20、溶解氧20% -60%的條件下，以120轉(zhuǎn)/分鐘的 攪拌轉(zhuǎn)數(shù)攪拌接種了 CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)接種在該無血清培養(yǎng)基中的CH0細(xì)胞， 培養(yǎng)5天，直到生物反應(yīng)器中的CH0細(xì)胞的細(xì)胞密度長(zhǎng)至6 X 106cellS/ml，得到增殖CH0細(xì) 胞的無血清培養(yǎng)基。
[0062] 3、細(xì)胞生產(chǎn)階段控制
[0063] 當(dāng)細(xì)胞密度超過6X106cells/mL，進(jìn)入表達(dá)期，降溫至35+0. 2°C，向生物反應(yīng)器中 的增殖CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中灌注生物反應(yīng)器工作體積的1倍的無血清培養(yǎng)基。再以 攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100-200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速攪拌培養(yǎng)30天后，終止培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液。
[0064] 4、監(jiān)測(cè)培養(yǎng)條件
[0065] 培養(yǎng)過程中需要監(jiān)測(cè)后控制的指標(biāo)有：溫度、pH值、葡萄糖濃度（每升大于兩克）、 摩爾滲透壓濃度（控制在280-350之間）。
[0066] 上述方法培養(yǎng)的CH0細(xì)胞能夠在30L反應(yīng)器中高效穩(wěn)定地表達(dá)Darb印oetin α， 成功實(shí)現(xiàn)從3L規(guī)模至30L規(guī)模的放大。細(xì)胞生長(zhǎng)及表達(dá)結(jié)果如圖6所示。在30L反應(yīng)器 中細(xì)胞能保持高密度及高活率，細(xì)胞的平均密度為9.9X106cell S/mL、平均活率為95%、 Darbepoetina的平均表達(dá)量為57mg/L。
[0067] 本發(fā)明尚有多種實(shí)施方式，凡采用等同變換或者等效變換而形成的所有技術(shù)方 案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述無血清基礎(chǔ)培 養(yǎng)基由SIGMA公司生產(chǎn)的Ex-cell302培養(yǎng)基和Hyclone公司生產(chǎn)的CP1027培養(yǎng)基組成， 所述添加劑包括D-半乳糖、尿嘧啶、Mn 2+中的一種或多種的組合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于：以重量比計(jì)，所述Ex-Cell302 培養(yǎng)基：CP1027培養(yǎng)基組成=9 : 1-1 : 1;優(yōu)選的，所述Ex-cell302培養(yǎng)基：CP1027培 養(yǎng)基組成=9 : 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于：所述D-半乳糖在無血清培養(yǎng)基 中的含量為500mg/L-5000mg/L，所述尿嘧啶在無血清培養(yǎng)基中的含量為100mg/L-500mg/ L，所述Mn2+在無血清培養(yǎng)基中的含量為1 μ mol/L-50 μ mol/L。
4. 一種利用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的無血清培養(yǎng)基來工業(yè)化生產(chǎn)高糖基化修飾的 重組人紅細(xì)胞生長(zhǎng)刺激蛋白的方法，該方法包括采用無血清培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中懸浮培 養(yǎng)CH0細(xì)胞株，然后在CH0細(xì)胞中高效表達(dá)Darbepoetin α的步驟。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：該方法包括采用無血清培養(yǎng)基，在生物 反應(yīng)器中，采用無血清懸浮灌注培養(yǎng)工藝懸浮培養(yǎng)CH0細(xì)胞株，在CH0細(xì)胞中高效表達(dá) Darbepoetin α，然后收獲培養(yǎng)液的步驟。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述無血清懸浮灌注培養(yǎng)工藝包括細(xì)胞 接種階段控制，細(xì)胞生長(zhǎng)階段控制和細(xì)胞生產(chǎn)階段控制；所述細(xì)胞接種階段控制為將CH0 細(xì)胞接種到無血清培養(yǎng)基中，其起始接種密度為4-8X10 5cellS/ml，接種體積為工作體積 的1/6-1/3,攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為100-200轉(zhuǎn)/分鐘，得到接種了 CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述細(xì)胞生長(zhǎng)階段控制為在溫度 35°〇-371：4冊(cè).90-7.20、溶解氧20%-60%的條件下，以100-200轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌轉(zhuǎn)數(shù)攪 拌接種了 CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)接種在該無血清培養(yǎng)基中的CH0細(xì)胞，培養(yǎng)4天-6 天，直到生物反應(yīng)器中的CH0細(xì)胞的細(xì)胞密度長(zhǎng)至6X10 6cellS/ml，進(jìn)入穩(wěn)定期，得到增殖 CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述細(xì)胞生產(chǎn)階段控制為向生物反應(yīng)器 中的增殖CH0細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中灌注生物反應(yīng)器工作體積的0. 8-1. 2倍的無血清培養(yǎng) 基，在溫度35-37°C、pH6. 90-7. 20、溶解氧20% -60%的條件下，以攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100-200轉(zhuǎn)/分 鐘的轉(zhuǎn)速攪拌培養(yǎng)25天-30天，收集培養(yǎng)液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述無血清懸浮灌注培養(yǎng)工藝還包括對(duì) 整個(gè)培養(yǎng)周期中每天的溫度、pH、葡萄糖濃度、摩爾滲透壓濃度及蛋白表達(dá)量的監(jiān)控。
【文檔編號(hào)】C12P21/02GK104099392SQ201410322927
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】王征, 譚靖?jìng)? 徐云霞, 唐瑤 申請(qǐng)人:蘇州康聚生物科技有限公司