一種快速鑒定鴨圓環(huán)病毒基因型的雙重pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種快速鑒定鴨圓環(huán)病毒基因型的雙重PCR方法，通過對參考GenBank上已發(fā)表的DuCV-1和DuCV-2的序列進行比對，選擇在DuCV-1和DuCV-2的保守區(qū)分別設(shè)計一對針對DuCV的通用特異性引物SEQ1/SEQ2，1型鴨圓環(huán)病毒特異性引物SEQ3和2型鴨圓環(huán)病毒特異性引物SEQ4；本發(fā)明主要是設(shè)計并篩選了新的特異性引物，優(yōu)化了反應(yīng)過程中的各種參數(shù)，利用本組引物建立的針對鴨圓環(huán)病毒的雙重PCR分型方法特異性強、敏感性更高，可以快速準(zhǔn)確地進行DuCV-1和DuCV-2的鑒定。
【專利說明】-種快速鑒定鴨圓環(huán)病毒基因型的雙重PCR方法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明所涉及的是一種用于快速鑒定鴨圓環(huán)病毒不同基因型的雙重PCR方法，屬 于病毒分子生物學(xué)領(lǐng)域。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV)是圓環(huán)病毒科的新成員，流行病學(xué)調(diào)查顯不 在我國鴨群中普遍存在DuCV感染，且常與鴨疫里默氏桿菌、鴨病毒性肝炎病毒、鴨大腸桿 菌等病原微生物發(fā)生混合感染。研究表明，鴨子感染DuCV后會呈現(xiàn)羽毛凌亂、生長遲緩、體 重減輕等癥狀；對DuCV感染鴨的組織病理學(xué)分析顯示該病毒感染主要引起鴨法氏囊淋巴 細(xì)胞減少、萎縮、組織細(xì)胞增生等；原位熒光檢測表明DuCV感染鴨后能夠在鴨的脾臟、胸腺 和法氏囊中形成明顯的病灶；這表明DuCV感染會侵害鴨的免疫器官并導(dǎo)致免疫細(xì)胞的凋 亡。盡管目前未發(fā)現(xiàn)DuCV感染在臨床中引起嚴(yán)重的發(fā)病和死亡，但其很可能引起免疫抑制 導(dǎo)致其他鴨的病原微生物危害加重，從而引起較為嚴(yán)重的生產(chǎn)問題。
[0003] 依據(jù)DuCV的基因組及Cap基因的序列分析，目前將DuCV分為兩個基因型：DuCV-ι 和DuCV-2,這兩個基因型的病毒均在我國鴨群中普遍存在。目前，已經(jīng)建立了檢測DuCV病 原的PCR、熒光定量PCR、核酸探針雜交以及檢測抗體的ELISA方法，但這些方法均不能區(qū)分 兩種基因型DuCV的混合感染。至今仍然未見對兩型鴨圓環(huán)病毒分型檢測的報道。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種快速鑒定鴨圓環(huán)病毒不同基因型的雙重 PCR方法，主要是設(shè)計并篩選了新的特異性引物，優(yōu)化了反應(yīng)過程中的各種參數(shù)，利用本組 引物建立的針對鴨圓環(huán)病毒的雙重PCR分型方法特異性強、敏感性更高，可以快速準(zhǔn)確地 進行DuCV-Ι和DuCV-2的鑒定。
[0005] -種用于快速鑒定鴨圓環(huán)病毒不同基因型的雙重PCR特異性引物，是通過對參考 GenBank上已發(fā)表的DuCV-Ι和DuCV-2的序列進行比對，選擇在DuCV-Ι和DuCV-2的的保守 區(qū)分別設(shè)計一對針對DuCV的通用特異性引物SEQ1/SEQ2,1型鴨圓環(huán)病毒特異性引物SEQ3 和2型鴨圓環(huán)病毒特異性引物SEQ4，
[0006] SEQ1 :5 ' -CGG GAA ATG ACG TAG TCG TCA TG-3 '，
[0007] SEQ2 :5 ' -GG (A/C) (C/T) T (G/A) AAC ATG AGA TGG GC-3 '，
[0008] SEQ3 :5 ' -GTT CAC TCC (G/T) GT TGT GTT GTC (C/T) GG-3 '，
[0009] SEQ4 :5 ' -GAT AAT GCG AC (C/T) GGC GAC G-3 ' ；
[0010] 所有引物以無菌ddH20(Rnase free)配成25pmol/μ 1的濃度備用；
[0011] 上述引物的使用方法如下：
[0012] Α、常規(guī)方法提取待測鴨各個臟器組織DNA作為模板，進行PCR反應(yīng)；反應(yīng)體系 為：1 μ L 組織 DNA、1XPCR buffer(50mM KC1, 10mM Tris-HCl[pH8. 3])、L 5mM MgCl2、0. 2mM dNTPs、lUTaqDNAPolymerase、引物SEQl、SEQ2、SEQ3和SEQ4各lμL，加水補齊至25μL。 PCR 擴增程序為：94°C 5min ;94°C 45s，68°C 90s，共 35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin ;
[0013] B、對步驟A得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測：
[0014] 如果從樣品中擴增出了 1032bp和446bp的產(chǎn)物，則該樣品為DuCV-1陽性，DuCV-2 陰性；如果從樣品中擴增出了 l〇32bp和599bp的產(chǎn)物，則該樣品為DuCV-2陽性，DuCV-1 陰性；如果同時擴增出了 l〇32bp、446bp和599bp的產(chǎn)物，則該樣品為DuCV-1和DuCV-2亞 型同時存在；如果未擴增出了 l〇32bp、446bp和599bp的產(chǎn)物，則該樣品不含有DuCV-1和 DuCV-2。
[0015] 本發(fā)明的雙重PCR方法最低可檢測到10個拷貝DuCV-1和DuCV-2的病毒DNA，表 明本方法具有很高的靈敏性。
[0016] 利用該組引物建立的雙重PCR方法對山東不同地區(qū)12個鴨群86只分離到DuCV-1 或/和DuCV-2的雛鴨病理組織進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品的檢測結(jié)果與使用單重PCR檢 測結(jié)果符合率為1〇〇%，說明本發(fā)明建立的雙重PCR方法適合于基因1型和2型鴨圓環(huán)病毒 的快速鑒定。由于本方法可以通過一次PCR完成對DuCV-1和DuCV-2的鑒定，可快速鑒定 鴨圓環(huán)病毒基因型。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1雙重PCR特異性檢測結(jié)果
[0018] M, DL2000 ;1，1 型鴨圓環(huán)病毒（DuCV-1) ;2, 2 型鴨圓環(huán)病毒（DuCV-2) ;3, 1 型和 2 型鴨圓環(huán)病毒混合感染樣品（DuCV-1和DuCV-2) ;4,鴨瘟病毒（DPV) ;5,產(chǎn)蛋下降綜合征病 毒（EDSV) ;6,鴨乙型肝炎病毒（DHBV) ;7,番鴨細(xì)小病毒（MDPV) ;8,鴨疫里默氏桿菌（Ra); 9，沙門氏菌（Salmonella) ;10，大腸桿菌（E. coli) ;11，陰性對照.
[0019] 圖1顯示：使用建立的雙重PCR方法進行特異性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針對單獨感染 DuCV-1的鴨病理組織DNA，擴增出1032bp和446bp的兩條目的條帶；針對單獨感染DuCV-2 的鴨病理組織DNA，擴增出1032bp和599bp的兩條目的條帶；針對DuCV-1和DuCV-2混合感 染的鴨病理組織DNA，擴增出1032bp、599bp和446bp的三條目的條帶；而針對鴨瘟（DPV)、 減蛋綜合癥病毒（EDSV)、鴨乙型肝炎病毒（DHBV)、番鴨細(xì)小病毒（MDPV)、鴨疫里默氏桿菌 (Ra)、沙門氏菌（Salmonella)和大腸桿菌（E. coli)的病原DNA，均未沒有擴增產(chǎn)物。這說 明本發(fā)明建立的檢測兩個基因型DuCV的雙重PCR方法具有很強的特異性。
[0020] 圖2雙重PCR針對DuCV模板DNA的敏感性檢測結(jié)果
[0021] M，DL2000 ;1-9,分別為按10倍梯度稀釋的108-10°拷貝的DuCV-Ι和DuCV-2模板 DNA
[0022] 圖2顯示：以不同拷貝數(shù)的含有兩個基因型DuCV完整基因組的陽性質(zhì)粒為模板， 對雙重PCR的擴增靈敏度進行檢測，結(jié)果表明，本發(fā)明建立的雙重PCR靈敏度高，最低可分 別檢測出含有10個拷貝的DuCV-Ι和DuCV-2病毒DNA。 (五）

【具體實施方式】
[0023] 1引物設(shè)計
[0024] 通過對參考GenBank上已發(fā)表的DuCV-1和DuCV-2的序列進行比對，選擇在 DuCV-Ι和DuCV-2的的保守區(qū)分別設(shè)計一對針對DuCV的通用特異性引物SEQ1/SEQ2,1型鴨 圓環(huán)病毒特異性引物SEQ3和2型鴨圓環(huán)病毒特異性引物SEQ4,利用常規(guī)方法對兩種病毒樣 品進行擴增。
[0025] SEQ1 :5 ' -CGG GAA ATG ACG TAG TCG TCA TG-3 '，
[0026] SEQ2 :5 ' -GG (A/C) (C/T) T (G/A) AAC ATG AGA TGG GC-3 '，
[0027] SEQ3 :5 ' -GTT CAC TCC (G/T) GT TGT GTT GTC (C/T) GG-3 '，
[0028] SEQ4 :5 ' -GAT AAT GCG AC (C/T) GGC GAC G-3 ' ；
[0029] DuCV的通用引物SEQ1/SEQ2擴增片段大小為1032bp，DuCV-1特異性引物SEQ2/ SEQ3擴增片段大小為446bp，DuCV-2特異性引物SEQ1/SEQ4擴增片段大小為599bp。所有 引物以無菌ddH 20(Rnase free)配成25ρηιο1/μ 1的濃度備用。
[0030] 2 DNA 提取
[0031] 使用常規(guī)方法提取DuCV感染鴨各種組織的總DNA作為模板。
[0032] 3雙重PCR條件的優(yōu)化
[0033] 對PCR反應(yīng)用引物、dNTPs、Buffer的濃度，及退火溫度等參數(shù)進行優(yōu)化，得到雙重 PCR最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。
[0034] 反應(yīng)總體積為25 μ L，最佳反應(yīng)體系為：1 μ L組織DNA、1 X PCR buf f er (50mM KC1, lOmM Tris-HCl[pH8. 3])、L 5mM MgCl2、0. 2mM dNTPs、lU Taq DNA Polymerase、引物 SEQ1、SEQ2、SEQ3 和 SEQ4 各 1 μ L，加水補齊至 25 μ L。
[0035] PCR 擴增程序為：94°C 5min ;94°C 45s，68°C 90s，共 35 個循環(huán)；最后 72°C 延伸 10min〇
[0036] 4特異性試驗
[0037] 分別以鴨瘟（DPV)、減蛋綜合癥病毒（EDSV)、鴨乙型肝炎病毒（DHBV)、番鴨細(xì)小病 毒（MDPV)、鴨疫里默氏桿菌（Ra)、沙門氏菌（Salmonella)和大腸桿菌（E. coli)的病原DNA 為模板，用上述優(yōu)化的條件進行雙重PCR檢測，同時用DuCV-Ι和DuCV-2單獨感染以及用 DuCV-Ι和DuCV-2混合感染的鴨病理組織DNA做陽性對照，用健康鴨肝提取的DNA做陰性對 照，進行雙重PCR的特異性檢測。對雙重PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可知，建立的 雙重PCR方法只能特異性的針對DuCV-Ι和DuCV-2的單獨或混合感染進行擴增，對其他家 禽常發(fā)病的病原擴增為陰性，可作為特異性鑒定DuCV-l、DuCV-2的快速方法（見圖1)。
[0038] 5敏感性試驗
[0039] 將分別含有 FJ0601 株 DuCV-1 (Jiang et al.，2008)和 WF0701 株 DuCV-2 (Zhang et al.，2012)完整基因組的陽性質(zhì)粒pDuCV-1和pDuCV-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使用質(zhì)粒純化試劑盒 (QIAprep Spin Miniprep kit,購自Qiagen公司）制備純化的質(zhì)粒并進行核酸定量，計算出 拷貝數(shù)，按照1〇8拷貝/ μ L?1拷貝/ μ L的濃度進行10倍梯度稀釋，分別取1 μ L各稀釋 度的質(zhì)粒DNA作為模板，按步驟3)所述優(yōu)化好的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行雙重PCR的擴增 靈敏度檢測。結(jié)果可知該雙重PCR方法最低可檢測到10個拷貝的病毒DNA(見圖2)。
[0040] 6臨床樣本檢測
[0041] 用建立的雙重PCR方法對山東不同地區(qū)12個鴨群86只分離到DuCV-Ι或/和 DuCV-2的雛鴨病理組織進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品的檢測結(jié)果與使用單重PCR檢測結(jié)果 符合率為100%，說明本發(fā)明建立的雙重PCR方法適合于DuCV-Ι和DuCV-2的快速鑒定。
[0001] <110〉山東農(nóng)業(yè)大學(xué) <120>-種快速鑒定鴨圓環(huán)病毒基因型的雙重PCR方法 <160>4 <210>1 <211>23 <212>DNA <213〉人工序列 <400>1 cgggaaatga cgtagtcgtc atg 23 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220〉 <221>misc_f eature <223>n= A 或 C <222> (3 ) <223>n= C或 T <222〉（4) <223>n= G 或 A <222> (6) <400>2 ggnntnaaca tgagatgggc 20 <210>3 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <221>misc_f eature <223>n= g 或 t <222> (10) <223>n=c 或 t <222> (22) <400>3 gttcactccn gttgtgttgt cngg 24
[0002] <210>4 <211>19 <212>DNA <213〉人工序列 <220> <221>misc-f eature <223>n= c 或 t <222> (12 ) <400>4 gataatgcga cnggcgacg 19
【權(quán)利要求】
1. 一種快速鑒定鴨圓環(huán)病毒基因型的雙重PCR特異性引物，其特征在于是通過對參考 GenBank上已發(fā)表的DuCV-1和DuCV-2的序列進行比對，選擇在DuCV-1和DuCV-2的保守區(qū) 分別設(shè)計一對針對DuCV的通用特異性引物SEQ1/SEQ2,1型鴨圓環(huán)病毒特異性引物SEQ3和 2型鴨圓環(huán)病毒特異性引物SEQ4 : SEQ1 :5' -CGG GAA ATG ACG TAG TCG TCA TG-3'， SEQ2 :5' -GG (A/C) (C/T) T (G/A) AAC ATG AGA TGG GC-3'， SEQ3 :5' -GTT CAC TCC(G/T)GT TGT GTT GTC(C/T)GG-3'， SEQ4 :5' -GAT AAT GCG AC (C/T) GGC GAC G-3' ； 所有引物以無菌ddH20(Rnase free)配成25ρηιο1/μ L的濃度備用； 上述引物的使用方法如下： A、 常規(guī)方法提取待測鴨各個臟器組織DNA作為模板，進行PCR反應(yīng)；反應(yīng)體系為：1 μ L 組織 DNA、1XPCR buffer :50mM KC1, 10mM Tris-HCl，ρΗ8· 3、1· 5mM MgCl2、0. 2mM dNTPs、lU Taq DNA Polymerase、引物 SEQ1、SEQ2、SEQ3 和 SEQ4 各 1 μ L，加水補齊至 25 μ L ;PCR 擴增程 序為：94°C 5min ;94°C 45s，68°C 90s，共 35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin ; B、 對步驟A得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測： 如果從樣品中擴增出了 l〇32bp和446bp的產(chǎn)物，則該樣品為DuCV-Ι陽性，DuCV-2陰 性；如果從樣品中擴增出了 l〇32bp和599bp的產(chǎn)物，則該樣品為DuCV-2陽性，DuCV-Ι陰性； 如果同時擴增出了 l〇32bp、446bp和599bp的產(chǎn)物，則該樣品為DuCV-Ι和DuCV-2亞型同時 存在；如果未擴增出了 l〇32bp、446bp和599bp的產(chǎn)物，則該樣品不含有DuCV-Ι和DuCV-2。
【文檔編號】C12N15/11GK104059998SQ201410323308
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】姜世金, 李志國, 王鑫, 張瑞華 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)